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摘要

为了开发抗感染人工骨，需要一个与临床感染密切相似的健壮动物模型。因此，我们建立了大鼠头颅感染模型。在大鼠顶骨造骨缺损后，将胶原海绵蜂窝或无菌纱布插入缺损处，接种创面金黄色葡萄球菌．这种方法有效地导致了颅内感染，其方式依赖于所插入的海绵/纱布。总之，我们认为该模型将是有用的颅骨感染模型，并将使研究用于颅骨成形术的材料在适合于临床环境的状态下的感染潜力。

关键字

人工骨、颅骨成形术、颅骨感染模型、大鼠模型

介绍

整形外科医生经常遇到的情况是，涉及人工材料的颅骨成形术患者的颅骨缺损后，神经外科或外伤。随着医学工程的发展，各种类型的人工骨进入了市场[1-10]，这些材料的应用也越来越频繁和广泛。然而，严重的并发症包括感染。感染的发生恶化了预后，因为人工种植支持细菌生长，影响了抗生素治疗的效果;事实上，有些病例需要取出人造骨。如果不去除感染的人工材料，感染可能扩散到更广的区域，造成顽固性皮肤溃疡，不仅需要去除人工骨，还需要重建受损的皮肤，导致长期住院[11,12]。为了加快抗感染人工骨的发展，必须建立一个与临床感染密切相似的健壮动物模型。粉碎创面[14]、烧伤创面[15]、缝线、沙粒等异物插入引起的溃疡的感染模型已经建立，但据我们所知，目前还没有建立头颅感染模型。大鼠等小动物通常被认为具有较强的抗感染能力，在这些动物模型[17]中维持感染具有很高的挑战性。在本研究中，我们研究了可维持在感染状态的大鼠颅感染模型的发展。

材料和方法

实验方法

成年雄性SD大鼠30只;10-12周龄，体重390-432 g，作为实验模型。首先，大鼠腹腔注射戊巴比妥0.4 ml麻醉。头顶被剃光，露出皮肤，然后用乙醇消毒。用15号手术刀从头部中线行2厘米的矢状皮肤切口，显露骨膜下顶骨。接下来，在避免矢状缝线的情况下，在每侧全层骨上创建一个直径为5mm的缺损(图1)。

图1所示。建立实验模型的头盖骨缺损

对模型中使用的两种外来物质进行了评估;胶原蛋白海绵蜂窝(AteloCell®;日本东京科肯株式会社)或无菌纱布插入骨缺损。对照组不使用异物。制造感染，15-CFU金黄色葡萄球菌（金黄色葡萄球菌, 30 CFU /细胞;简单的QA球®;Nissui Pharmaceutical Co.， Ltd.， Tokyo, Japan)接种于每一个骨缺损，而对照组不接种该细菌。用4-0尼龙线缝合缝合伤口;伤口未通过外用软膏或纱布覆盖引流。

根据细菌接种和异物插入情况，将大鼠分为以下6组。

第一组:无材料及编号金黄色葡萄球菌，

第二组:无材料&金黄色葡萄球菌，

第三组:海绵金黄色葡萄球菌，

第四组:海绵&金黄色葡萄球菌，

第5组:纱布金黄色葡萄球菌，

第6组:纱布&金黄色葡萄球菌．

因此，共分为6组，每组6个骨缺损;各组术后3 d检查3个骨缺损，7 d检查3个骨缺损。

所有动物实验都是按照藤田健康大学实验动物委员会批准的协议进行的

革兰氏染色细菌分析

术后3天和7天，大鼠腹腔注射戊巴比妥0.4 ml麻醉。解剖颅骨，目视评估骨缺损的肉芽肿状况，包括有无渗出物和脓肿形成。取各组大鼠颅骨缺损处的肉芽组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋。标本在5 μm厚度的冠状面切片，并在常规的定性、亮场光学显微镜下进行革兰氏染色观察，以评估有无革兰氏阳性细菌。

利用细菌培养来评估增加的细菌计数

术后3天和7天，从各组大鼠骨缺损中心采集2mm见方的肉芽组织。捣碎后溶解于1ml生理盐水中;0.1 ml溶液接种后涂布于含蛋黄的甘露醇盐琼脂上。然后将每个琼脂平板置于37°C, 5% CO的培养箱中₂)孵育24小时，计数菌落数量。

统计分析

采用Wilcoxon符号秩检验进行统计分析。所有计算均使用SPSS version 17 for Windows (SPSS Inc, Chicago, IL, USA)进行，p值<0.05被认为具有统计学意义。

结果

宏观的外表

3、5组肉芽肿组织稍有异常。所有接种创面均可见明显渗滤液及粗细异常肉芽组织金黄色葡萄球菌(第2、4、6组)。第3、7天标本外观比较无显著差异。

组织学

术后第3天创面组织学分析，1、3、5组为未感染组，未检出革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(图2)如预期的那样，在第2组、第4组和第6组的组织中零星检测到播散的革兰氏阳性菌。

图2。术后3天肉眼组织学观察(革兰氏染色)。第1、3、5组未检出革兰氏阳性菌。在第2组、第4组和第6组的样本中零星检测到播散的革兰氏阳性菌。

a.第一组:无材料及编号金黄色葡萄球菌b.第2组:无材料&金黄色葡萄球菌c.第3组:海绵金黄色葡萄球菌第4组:海绵&金黄色葡萄球菌e.第5组:纱布金黄色葡萄球菌第6组:纱布&金黄色葡萄球菌。

术后7天，未接种组(组1、组3、组5)的组织中均未检测到革兰氏阳性菌。此外，组2未检测到革兰氏阳性菌菌落(图3)，这与术后3天的结果不同。另一方面，术后第4、6、7天组织中均有革兰氏阳性菌。与没有菌落的第2组相比，这一结果说明了外来物质对细菌生长的重要性。

图3。术后7天肉眼组织学观察(革兰氏染色)。1、2、3、5组均未检出革兰氏阳性菌。第2组与第3天组结果有明显差异。另一方面，第4组和第6组标本中检出大量革兰氏阳性菌。

a.第一组:无材料及编号金黄色葡萄球菌,b.第2组:无材料&金黄色葡萄球菌,c.第3组:海绵金黄色葡萄球菌,d.第4组:海绵&金黄色葡萄球菌,e.第5组:纱布金黄色葡萄球菌,f.第6组:纱布&金黄色葡萄球菌。

细菌计数

培养24小时后，从标本中计数革兰氏阳性菌落数。术后第3天，第1组、第3组和第5组未计数菌落。接种2组、4组、6组细菌的菌落计数平均值分别为210±46.3、747±85.2、946±109.5。组1与组2、组1与组4、组1与组6的菌落计数差异均有统计学意义(p<0.01)。组2与组4、组2与组6的菌落计数差异有统计学意义(p<0.01;图4)。

图4。术后3天各组细菌菌落计数。

第一组:无材料及编号金黄色葡萄球菌,第二组:无材料&金黄色葡萄球菌,第三组:海绵金黄色葡萄球菌,第四组:海绵&金黄色葡萄球菌,第5组:纱布金黄色葡萄球菌,第6组:纱布&金黄色葡萄球菌。

术后7天获得的组织的结果与术后3天获得的组织的结果相似。术后7天，1组、3组、5组的平均菌落计数均为0。第2组、第4组和第6组的平均测量菌落数分别为12±8.2、5147±366.7和5229±690.9。术后3 d, 2组与4组、2组与6组菌落计数差异有统计学意义(p<0.01)，说明细菌生长依赖于异物。然而，组1和组2之间没有显著差异(p = 0.52;图5)。

图5。术后7天各组细菌菌落计数。

第一组:无材料及编号金黄色葡萄球菌,第二组:无材料&金黄色葡萄球菌,第三组:海绵金黄色葡萄球菌,第四组:海绵&金黄色葡萄球菌,第5组:纱布金黄色葡萄球菌,第6组:纱布&金黄色葡萄球菌,

讨论

主要颅骨缺损可表现为最令人不安的畸形。颅骨成形术可恢复脑保护，改善颅面美观。当自体骨不可用或使用不当时，异变异体材料被认为是下一个最佳选择[6]。然而，目前用于重建颅骨缺损的材料都不能令人完全满意。羟基磷灰石是一种生物相容性和骨传导材料，缺乏显著的毒性或免疫原性;这似乎是修复颅骨缺损的理想基质。

然而，感染是颅成形术的主要并发症，在许多手术后感染的病例中，取出植入物材料成为必要的。一旦细菌附着在种植体表面，就会引起局部炎症，并逐步损害邻近组织[20]。此外，这可能会导致假体材料的更换失败，从而导致致命的后果。我们使用人工骨治疗颅骨缺损[21,22]，由于上述原因，我们认为人工骨具有抗感染和抗压强度的发展是非常重要的事情。

在临床应用这些程序以确认新治疗的有效性之前，需要进行动物研究。大鼠的颅骨大而厚，足以造成骨缺损，也相对频繁地被用于评估颅骨缺损的实验[23]。因此，我们考虑建立人工骨移植的大鼠颅骨感染模型。然而，建立啮齿动物感染模型较为困难，已有研究利用异物建立皮肤感染模型[14,17]。在阅读了这些报告后，我们假设，在颅骨缺损中使用异物时，可能会培养致病微生物并诱导组织反应。外来材料胶原蛋白海绵(AteloCell®)是一种三维、蜂窝状、胃蛋白酶处理过的材料。它具有可生物降解的特性，常用于各种组织工程应用[24,25]。我们选择这种材料是因为它的成分与生物组织相似。此外，我们使用棉纱作为异物，以符合Tachi等人[16]的实验报道。他们建立了一种伤口感染模型，在该模型中，由于在全层伤口的基底上应用纱布，溃疡形成后感染持续9天。

在本研究中，我们使用金黄色葡萄球菌作为颅内感染的病原体。这种细菌常见于人的手指、鼻前庭和咽部。它也存在于皮肤上，被认为是一种潜在的炎症细菌在颅骨人工骨感染。因此,我们使用金黄色葡萄球菌本实验用于颅骨缺损创面的接种。

我们用从住院病人身上收集的细菌作为实验的开始。然而，由于各种细菌混合在一起，很难控制一定数量的细菌。此外，它可能不包含活细胞，在使用时导致“零计数”。因此我们使用了Easy QA Ball®(biball®;现作为一种跟随者)，因为稳定和恢复活细胞，细菌的准确数量。此外，它不需要制备或预孵育，可以直接添加到培养基或基质样品[21]中。通过这个过程我们了解到，由于骨缺损非常小，很难计数和比较太多的菌落数量，所以我们测定了S的15CFU。葡萄球菌适宜接种。

我们的研究有一定的局限性。我们只检查了颅骨骨缺损的组织学肉芽组织。在不损伤硬脑膜和大脑的情况下，大鼠颅骨标本制作困难。然而，我们认为有必要使用一种方法，充分探索颅内变化，因为临床医生可能对这一区域的连接感兴趣。此外，我们没有监测感染的持续时间。自体骨引起类似细菌“熔化”的反应，但我们不知道人工骨是如何改变细菌的。因此，在研究人工骨的变化时，控制感染时间是很有必要的。

总之，我们认为该模型将是有用的颅骨感染模型，并将使研究用于颅骨成形术的人工骨及其在更类似于临床环境的状态下的感染潜力成为可能。

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