澳大利亚查尔斯斯特大学动物与兽医科学学院
德国波恩大学解剖研究所神经解剖系
电子邮件:zhaque@csu.edu.au
德国波恩大学解剖研究所神经解剖系
澳大利亚查尔斯斯特大学动物与兽医科学学院
德国阿尔伯特-路德维希大学解剖学与细胞生物学研究所分子胚胎系
DOI: 10.15761 / IMM.1000198。
Semaphorins通过与受体结合在神经元和非神经元过程中发挥作用。这两个在体外而且在活的有机体内研究表明plexin-As（plexin-A1,plexin-A1而且plexin-A1),neuropilins（Npn-1而且Npn-2)是iii类的结合部分semaphorin年代．这些受体在脊椎动物的器官发生和中枢神经系统(CNS)发育过程中以时空不连续的方式表达。然而，伴随iii类的信号受体semaphorins作为中介，他们的行为仍然难以被描述。为了评估它们在神经回路形成中的不同作用，我们分析了丛- a1，丛- a2，丛- a4，Npn-1而且Npn-2在小鸡胚胎的头部和脑干中。在眼睛发育过程中，plexin-A1在镜头中表达，而plexin-A2而且Npn-1在眶周间质中。Plexin-A1也表现为整个耳部的小泡不过Npn-1背侧的仅表现在背部的部分在分析的数据中plexins而且neuropilins,只有Npn-2在鳃裂弓中有表达。Npn-2而且plexin-A4三叉神经节和迷走副神经节也有表达。在后脑，全部分析plexins而且neuropilins背侧运动神经元(dMNs)和腹侧运动神经元(vMNs)的选择性表达plexin-A4(只有静)。有趣的是,plexin-A2而且Npn-1dmn和vmn(滑车核、三叉神经核、外展核、舌咽核、迷走神经附属核和舌下核)相似组共表达。这些表达结果表明plexins而且neuropilins参与鸡胚颅结构的神经发育。
丛蛋白，神经鞘蛋白，头盖骨，脑干，小鸡胚胎
头盖骨的发育需要将各种类型的细胞部署到胚胎头部的特定位置。细胞迁移到这些位置以及它们随后的模式产生了特定的结构，例如大脑、鳃裂弓、眼睛、耳朵等。颅运动神经元起源于神经管基底。运动神经元的一个亚型通过背根延伸轴突，因此被称为背出运动神经元(dMNs)。另一种亚型称为腹侧退出运动神经元(vMNs)的轴突遵循腹侧轨迹[1]。一旦进入外围，它们的轴突就会遵循一个明确的轨迹导航到最终的目标组织，因此，它们被分类为分支运动神经元(bm)、内脏运动神经元(vm)和躯体运动神经元(sm)。sm神经元(vMNs)避开感觉神经节，bm/vm神经元(dMNs)靠近传入的感觉纤维，通常侵入附近的颅感觉神经节[2]。
发育中的轴突是通过引导分子与生长锥质膜上的受体结合而引导到它们的目标，从而激活细胞内信号级联。这导致细胞骨架的动态变化和后续定向轴突延伸和目标识别[3]。生物化学和遗传学研究已经揭示了多种轴突引导分子家族，包括netrins，缝，semaphorins而且ephrins[4]。的semaphorins通过与信号转导结合发挥其作用plexins配体结合neuropilins（Npn-1而且Npn-2）.Plexins跨膜蛋白家族是否在脊椎动物和无脊椎动物中都广泛分布[5]。NeuropilinsFujisawa及其同事最初描述为孤儿受体的细胞表面糖蛋白在蝌蚪中是否表达神经纤维网[6]。在寻找其他semaphorin受体,一个neuropilin-1相关的分子,Npn-2，被鉴定[7,8]。既不Npn-1也不Npn-2能够传达semaphorin信号在它们自己的[9]上，而不是与它们形成复合体plexins(8 - 12)。Plexins根据结构标准分为A、B、C、D四个子类。最大的亚科是plexin-A有四个成员(A1, A2, A3和A4)，然后是plexin-B有三个成员的亚科(B1, B2和B3)。亚科C和D各有一个成员(C1和D1)。在鸡的基因组中只有7个plexins（plexin-A1， -A2， -A4， -B1， -B2， -C1＆d1)与哺乳动物形成鲜明对比plexins已被识别[13]。
Plexin-As最有特点的是什么plexins．它们被证明以钙依赖的方式介导嗜同质细胞-细胞粘附[14]。此外，它们被证明可以介导膜结合的作用第六课semaphorins在一个neuropilin独立的方式(15、16)。相互作用plexin-B1与Sema4D已被描述，但鲜为人知的作用plexin-Bs在活的有机体内(17、18)。Plexin-C1演示如何与之交互Sema7A[19]，尽管迄今为止唯一的功能性研究表明整合素而不是丛素c1作为功能介导受体Sema7A[20]。Plexin-D1最后，它与心脏和血管系统的发育有关，与它在内皮细胞中的主要表达一致(研讨会)。
尽管事实是plexin-As而且neuropilins参与神经回路的形成，其表达模式在中枢神经系统发育过程中的时间变化尚未详细分析。为了更好的理解多样化的角色plexin-As而且neuropilins，我们决定评估它们在鸡胚胎中的表达模式。在这里，我们分析了的表达式plexin-As (plexin-A1，a2,a4)而且neuropilins (Npn-1而且Npn-2)在胚胎的头部。我们还关注了脑干中的颅运动神经元的表达，这些神经元沉降到某些颅核中，支配眼外肌、鳃裂肌和舌肌。
肥沃白来亨鸡(家养的Gallus Gallus)的鸡蛋来自德国波恩大学动物科学研究所经营的农场。鸡蛋在37.8°C的潮湿(80%)气氛中孵育所需的时间和阶段[24]。胚胎用4% PFA在PBS或Dent’s固定液中固定4小时至4℃。后脑沿顶板背侧打开，与脑的其余部分和周围的间质分离开来。
地高辛标记的鸡感和反义RNA探针plexin-As（plexin-A1, plexin-A2而且plexin-A4)而且neuropilins (Npn-1而且Npn-2)分别由瑞士苏黎世大学动物研究所Esther T Stoeckli和以色列理工学院Gera Neufeld提供的模板质粒合成。简单地说，1µg/µl的线性DNA被RNAse游离水悬浮。在20µl溶液中加入以下物质:2µl 10X转录缓冲液、2µl digg -RNA标记混合物、2µl RNA聚合酶和0.5µl RNAse-Inhibitor。将样品混合，在37°C (T3或T7)或42°C (Sp6)孵育至少2小时。加入0.5µl 0.5 m EDTA (pH 8.0)停止反应。随后，加入2.4 μ l 4 M LiCl和75 μ l 100%冷乙醇，在-20°C下孵育过夜。溶液以130000 rpm离心20分钟。小心地从颗粒中取出液体，并添加500 μ l 70%冷乙醇。然后再次以13000 rpm离心10分钟。从颗粒中去除乙醇，在37°C(3-5分钟)下干燥。将50µl RNAse自由水和0.5µl RNAse抑制剂加入球团，37℃加热20 min，用Dot-blot技术测定探针浓度。探针的浓度为50-100 ng/µl原位杂化。
原位采用[25]所述的改进方案进行杂交。简单地说，胚胎在PBT中在室温(RT)温和摇晃中洗涤2次(每次5分钟)。用6%的过氧化氢在PBT中漂白剂漂白1小时，然后用PBT洗涤两次5分钟。胚胎在PBT(10µg/ml)中用蛋白酶- k处理10分钟，PBT仔细冲洗后立即在4%缓冲甲醛中固定30分钟，然后用PBT在RT中洗涤两次5分钟，然后在RT中将胚胎置于PBT:杂交缓冲液(1:1)的混合物中，让它们在小瓶底部沉淀。这一步是重复使用杂交缓冲。将杂交缓冲液替换为新鲜缓冲液，在65°C下孵育1小时。然后用杂交缓冲探针混合物(0.05-0.1µg/ml)进行杂交。预温杂交混合物，胚胎与杂交混合物在65°C孵育一夜。杂交后进行洗涤(2X SSC/CHAPS和0.2X SSC/CHAPS，在65℃下各20分钟)，然后在RT下用KTBT缓冲液洗涤10分钟。在RT下用10% FCS堵塞胚胎4小时，然后在4℃下用anti - digg - ap / KTBT(1:20 00)孵育过夜。然后在KTBT中洗涤6次(每次1小时)，再在AP缓冲液中洗涤2次(每次20分钟)，最后用NBT / BCIP在AP中(20 μ l/ml)检测抗体。
使用尼康数码相机DXM1200C连接尼康SM21500荧光显微镜对样品进行拍摄。在所有情况下，图像都是使用Adobe Photoshop CS3组装和注释的。
的功能semaphorins，适当评估受体在给定物种或系统中的表达是先决条件。鸡胚是一个很有吸引力的研究模型系统semaphorins以及它们的受体，考虑到它的可及性和功能分析的潜力。我们分析了的表达式plexin-As（plexin-A1，plexin-A2而且plexin-A4),neuropilins（Npn-1而且Npn-2)在头部和脑干的胚胎发育过程中发现的鸡基因组。我们分析了的表达模式plexin-As（plexin-A1, plexin-A2而且plexin-A4)而且neuropilins（Npn-1而且Npn-2)在小鸡胚胎中现场杂交(整体安装和平面安装)使用相关信使核糖核酸调查。结果显示，在眼眶、小囊泡、鳃裂弓、颅神经节和后脑均有表达。
神经嵴起源的眶周间质逐渐积累，形成虹膜、巩膜、角膜[26]。我们观察到plexin-A2而且Npn-1在眶周间质中表达(图)，支持它们在眼球发育中的合作作用。除此之外,plexin-A1在晶状体中发现了表达(图)。晶状体已被证明是对视网膜的化学排斥活性的来源[27,28]。Npn-1而且Npn-2信号通路是小鼠角膜[29]神经正常支配所必需的。击倒的plexin-A1或plexin-A2结果动眼神经[30]轴突导向缺损显著且可复制。这些观察结果与我们的数据一起表明plexin-A1，plexin-A2而且Npn-1在眼睛的发育和神经支配方面。
耳廓囊泡是内耳发育过程中从耳廓基板的最初形成到前庭和听觉结构分化的中间阶段。耳膜背外侧囊泡形成前庭器官，腹内侧囊泡形成耳蜗。许多决定这种分化的基因在任何明显的形态学变化出现之前就已经定位于耳部囊泡的特定区域[31,32]。我们发现了plexin-A1整个小囊泡(图1a)，而表达受限(背侧)是明显的Npn-1(Figure1c)。但plexin-A2, plexin-A4而且Npn-2在小囊泡中无表达。小囊泡的区域Npn-1(图1c)与该表达相关Dlx5(梅洛et al .,2002)。缺乏这种转录因子的小鼠前庭器官畸形(Merloet al .,2002)。所有这些对发育中的小囊泡的观察表明plexin-A1而且Npn-1在控制前庭神经和听觉神经衍生物的后续形态或其神经支配中起作用。
图1所示。Plexin-As(-A1,A2，和-A4),neuropilins（Npn-1而且Npn-2)在第21阶段(a-e)在鸡胚头和脑干中的表达。黑色和白色箭头分别表示在小囊泡(a和c)和晶状体(a)的表达。所有图像中的比例尺= 250毫米。
鳃裂弓由含有肌肉前体细胞的中胚层核心组成，周围环绕着神经嵴细胞群，这些细胞群将产生骨骼组织和结缔组织[33,34]。我们发现了Npn-2在支弓(图1e)支持弓源肌肉神经支配。后脑中的bm/vm (dMNs)运动神经元支配在鳃裂内分化的神经肌肉，而鳃裂源于从颅旁中胚层腹侧边缘迁移的肌源性细胞[35,36]。类似的情况存在于肢体肌肉组织的前体从躯干体[37]的腹侧边缘迁移的情况，这意味着支配这两种类型肌肉的神经元之间可能存在一些相似之处。然而，支配四肢神经的脊髓运动神经元表达其他LIM除了基因Islet-1．特别是控制四肢神经的脊髓运动神经元LIM-1[38]，在颅运动神经元亚群中均未检测到其表达。sm颅运动神经元群表达相同的曲目LIM基因(Islet-1而且Islet-2)神经支配肌肉，这些肌肉来源于颅旁中胚层或脊髓前板中胚层[35,36]。
神经嵴细胞(Neural crest cells, NCCs)不侵入支弓，产生颅感觉神经节[39]。Npn-2优先表达于从r2迁移的ncc中，并产生三叉神经节[40]，其信号对三叉神经节凝结至关重要(Gammillet al .,2007)。Neuropilins通过NCCs[41]控制颅神经节形成和轴突引导。我们发现了plexin-A4而且Npn-2神经节和运动神经元(三叉神经和迷走副神经，图1c和1e)支持它们在各自脑神经轨迹中的作用。这种配对可能负责神经节产生的信号，以指导运动神经元细胞体及其轴突的迁移和生长[42,43]。
通过轴突引导分子，如神经元的成员，对介导化学吸引或化学排斥的受体的差异调节semaphorin家族可能导致运动核的特征性位置和连接模式[44-47]。运动神经元向其最终目的地的迁移是神经系统发育的一个关键过程。这一过程必须与连接的建立相协调，并要求不同的神经元区室对环境中大量的引导线索做出不同的反应。
脑运动神经元亚群表达不同semaphorin并沿着轴突轨迹做出不同的决定。我们分析了小鸡的表情plexin-As（plexin-A1，a2而且a4),neuropilins（Npn-1而且Npn-2)在发育中的小鸡胚胎的扁平后脑中(图2a-i)。在HH 19，plexin-A1在神经管腹侧纵向表达。然而，在r1和r7-8水平上表达更为突出(图2a)。的表达模式plexin-A2而且plexin-A4在后脑中发现几乎相似(图2d和2g)。两者均表现为两个纵向区域，从r2-8向外侧逐渐扩展。Plexin-A4在r7-8水平上表达更强(图2d)，但在r6-8的情况下plexin-A4(图2g)，两者都在靠近楼板处变窄。在HH 23，plexin-A1，a2而且a4表达向后脑菱形粒内的预期核扩展(图2b, 2e和2h)。在HH 27时，我们将这些基因的表达模式与运动神经元标记物的表达进行比较Islet-1[48]。我们的研究结果表明plexin-A1滑车核(vMNs)、三叉神经核(dMNs)、面部核(dMNs)和舌下核(vMNs)表达;plexin-A2滑车核(vMNs)、三叉神经核(dMNs)、外展核(vMNs)、舌咽核(dMNs)、迷走神经附属核(dMNs)和舌下核(vMNs)plexin-A4仅在dmn -三叉神经、舌咽部和迷走神经副核(图2c、2f和2i)。的表达式数据neuropilins证明了两者Npn-1而且Npn-2r1-2和r7-8表达强烈(HH 19)。然而,Npn-2表达比以前强烈和广泛得多Npn-1(图3a和3d)。在HH 23，表达分布在后脑菱形边界内的未来核(图3b和3e)。到HH 27时，大部分颅运动神经元迁移到后脑[49]的最终位置。在这里，我们比较了这两个基因的表达(Npn-1而且Npn-2)与运动神经元标记物的表达Islet-1[48]。我们发现Npn-1在滑车核(vMNs)、三叉神经核(dMNs)、外展核(vMNs)、舌咽核(dMNs)、迷走神经附属核(dMNs)和舌下核(vMNs)中表达Npn-2滑车核(vMNs)、三叉神经核(dMNs)、面部核(dMNs)、舌咽核(dMNs)、迷走神经附属核(dMNs)和舌下核(vMNs)(图3c和3f)。这些结果表明plexin-A1而且plexin-A2都由dmn和vmn表示，但是plexin-A4只能通过dmn。除此之外,Npn-1而且Npn-2都由两组后脑运动神经元(dmn和vmn)表达。
图2。的表达plexin-As(-A1,A2和- - - - - -A4)在鸡胚胎(a-i)平装的后脑(打开的书)中。在HH 19，plexin-A1，a2而且a4表达在整个腹侧神经管呈两条纵条纹(a, d和g)。在HH 23时，表达向菱形边界内的未来核扩展(b, e和h)。plexin-A1，a2而且a4所有图像中的比例尺= 200毫米。
图3。Neuropilins（Npn-1而且Npn-2(a-f)在鸡胚平装后脑(打开书)中的表达。在HH 19，两者都有Npn-1而且Npn-2所有图像中的比例尺= 200毫米。
OAT版权所有。版权所有小鼠和鸡胚的表达数据表明，分泌iii类表面受体的多聚体semaphorins是neuropilins和/或plexins(13 50 51)。在小鼠(E10.5-12.5)中，plexin-A2在脊板和腹侧脊髓的中间神经元中发现但在躯干区域的运动神经元中没有发现[52]。除此之外,Npn-2在背侧合神经元、腹侧运动神经元群和底板中表达非常强烈[53,54]。在小鸡,Npn-2在运动神经元池中表达，但在胚胎鸡底板和脊髓背侧未表达。在鸡腰骶脊髓中，迁移前运动神经元表达plexin-A1，plexin-A2，Npn-1但不是Npn-2[13]。在迁徙阶段，Npn-2似乎主要在islet1阳性细胞的背外侧亚群中表达，而plexin-A2分布在腹部角[13]。[55]，证实并扩展了[13]的观测;的动态表达模式plexin-A2而且Npn-2．他们报道了在迁移前阶段的脊髓运动神经元或其祖细胞的表达，而在迁移阶段的运动神经元的内侧和外侧亚群中表达。我们观察到plexins而且neuropilins在后脑发育的早期迁移阶段在腹神经管中表达。在迁移后期，表达出现在背外侧，中间持续表达。大多数脑运动神经元在找到最终位置后，其表达呈现为两个区域，分别产生内侧核(vMNs)和外侧核(dMNs)。内侧核靠近底板，外侧核靠近菱形边界。所有plexins(除了plexin-A4),neuropilins（Npn-1而且Npn-2)在鸡后脑内侧核和外侧核均有检测。Plexin-A2表达类似于Npn-1在颅核中．这些组合和差异的表达模式plexin-As而且neuropilins颅核提示它们在后脑发育过程中选择性脑神经组的神经回路形成中的作用。
神经元亚型(dmn和vmn)的分化受神经网络控制Phox而且LIM同源域因子[56,57]。在这方面，值得注意的是，舌咽(nIX)和迷走神经(nX)似乎融合在一起Nkx2.9缺失小鼠和脊髓附属(nXI)运动神经元不能迁移到背外侧位置，它们的轴突不能离开神经管[58]。我们的表达数据显示，这些颅运动神经元(dMNs)表达强烈plexin-A4而且Npn-2．这就有可能Nkx2.9起到维持功能的作用plexin-A4而且Npn-2在后脑dmn的轴突引导中。的损失Nkx6.1, Nkx6.2而且Pax6在体细胞运动神经元发育过程中，外展和舌下运动神经元[59]被删除。我们发现plexin-A2而且Npn-1共表达于外展和舌下(vMNs)运动神经元。从这一观察来看，……的行动很可能是plexin-A2而且Npn-1外展神经(nVI)和舌下神经(nXII)在轴突引导中受到调节Nkx6而且Pax6基因。dmn的分化是必需的Phox2a / b表达式[56]。Lhx3而且Lhx4对vMN分化和内侧运动柱[57]的形成都很重要。这些报告也与我们的表达数据相关，这表明Phox而且Lhx基因可能控制的功能plexins而且neuropilinsdmn和vmn的轴突引导。结合上述已有的报道，结合我们的观察，我们可以说的选择功能plexins而且Neuropilins很可能是运动神经元的差异表达的结果，介导对扩散和接触依赖信号的反应。这种表达可能是参与脑神经轴突引导的转录因子差异激活的结果。
综上所述，该基因的表达模式plexins而且neuropilins在头盖骨和后脑中呈现无疑将进一步揭示配体定位的更精细的受体组合。目前的研究强调了几种可能的作用plexins而且neuropilins指导早期颅骨发育，特别是早期轴突束的模式，同时也指导细胞迁移和形态变化。进一步的研究可以探索它们在头部和大脑发育中的功能作用。
作者宣称他们之间没有利益冲突。
音)山口
埃默里大学医学院
研究文章
收稿日期:2016年2月1日
录用日期:2016年2月11日
出版日期:2016年2月15日
©2016 Haque z .这是一篇根据创作共用署名许可条款发布的开放获取文章，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
Haque Z, Pu Q, Huang R(2016)鸡胚头盖骨和脑干中神经丛蛋白和神经囊蛋白mrna的分布。整合Mol医学3:DOI: 10.15761/ im .1000198。
查尔斯斯特大学动物和兽医科学学院，澳大利亚新南威尔士州沃加沃加2678。
电子邮件:zhaque@csu.edu.au
我们感谢美国爱荷华市发育研究杂交瘤银行提供的抗体。我们也感谢Michael Pankratz博士对这项工作提出的宝贵建议。非常感谢Sandra Gräfe的技术支持。
图1所示。Plexin-As(-A1,A2，和-A4),neuropilins（Npn-1而且Npn-2)在第21阶段(a-e)在鸡胚头和脑干中的表达。黑色和白色箭头分别表示在小囊泡(a和c)和晶状体(a)的表达。所有图像中的比例尺= 250毫米。
图2。的表达plexin-As(-A1,A2和- - - - - -A4)在鸡胚胎(a-i)平装的后脑(打开的书)中。在HH 19，plexin-A1，a2而且a4表达在整个腹侧神经管呈两条纵条纹(a, d和g)。在HH 23时，表达向菱形边界内的未来核扩展(b, e和h)。plexin-A1，a2而且a4所有图像中的比例尺= 200毫米。
图3。Neuropilins（Npn-1而且Npn-2(a-f)在鸡胚平装后脑(打开书)中的表达。在HH 19，两者都有Npn-1而且Npn-2所有图像中的比例尺= 200毫米。
