意大利佛罗伦萨大学实验与临床医学系
英国Macro Innovations有限公司
英国Macro Innovations有限公司
免疫生物科技有限公司
DOI: 10.15761 / ICST.1000126
n -乙酰半乳糖胺-糖基化维生素D结合蛋白(galna - dbp)可以刺激巨噬细胞，直接抑制血管生成和癌细胞生长在体外．在本研究中，我们评估了与油酸复合物的GalNAc-DBP对人多发性骨髓瘤和霍奇金淋巴瘤细胞系(分别为KMS-12-BM和L540)的直接作用，以及对同一细胞系先前被油酸复合物的GalNAc-DBP活化的人脾脏巨噬细胞(CRL9853)的作用。
采用四唑蓝染色法和台盼蓝染色法分别测定细胞活力和活细胞数。通过延时摄影研究活化巨噬细胞与癌细胞之间的相互作用。我们的结果表明，与油酸复合物的GalNAc-DBP以剂量依赖的方式抑制骨髓瘤和霍奇金淋巴瘤细胞的增殖。此外，与油酸复合的GalNAc-DBP激活人脾脏巨噬细胞，巨噬细胞进而吞噬癌细胞。此外，我们还观察到GalNAc-DBP与油酸复合物可激活人脾巨噬细胞在活的有机体内通过脾脏的彩色多普勒超声显示。这些结果表明，GalNAc-DBP与油酸复合物对骨髓瘤和霍奇金淋巴瘤细胞有双重作用:直接抑制它们的增殖和生存能力，同时，有效的巨噬细胞激活导致癌症细胞数量显著减少。综上，这些结果表明，GalNAc-DBP与油酸复合物可能在多发性骨髓瘤和霍奇金淋巴瘤的综合免疫治疗中有效。
霍奇金淋巴瘤，巨噬细胞，多发性骨髓瘤，油酸，脾脏，维生素D
维生素D Binding Protein, GalNAc: n - acetyl半乳糖，IDD:本质紊乱结构域，MAF:巨噬细胞激活因子，NO:一氧化氮，Sia:唾液酸
近年来，人们对维生素D和其他营养因子(如油酸)在多发性骨髓瘤和霍奇金淋巴瘤综合治疗中的作用的兴趣增加了[1]。因此，这些癌症被认为对钙和维生素D敏感，有人建议联合补充可能需要最佳的化学预防[2]。另一方面，油酸已经因其抗癌特性而闻名几个世纪，根据最近的一篇综述“油酸在癌症过程中的有益作用不再被怀疑”[3]。
自1988年以来，人们就知道油酸与维生素D结合蛋白(DBP)非共价结合，DBP是在血浆和其他生物液体中构成油酸载体蛋白[4]的蛋白之一。我们最近阐明了油酸、维生素D、DBP和维生素D受体[5]之间的分子相互作用。在这种情况下，值得注意的是，油酸的抗癌作用是由其与牛奶或血浆[6]等生物液体中的蛋白质相互作用介导的。因此，可以推测DBP通过与油酸的络合作用，可能在抗癌免疫监测中发挥的作用超过载体蛋白的作用。
DBP由位于4q12-q13上的一个基因(HGNC: 4187)编码，又称群特异性成分(GC)。DBP存在于不同的异构体中，其中gcs被糖基化，由线性的galna - gal - sia三糖组成，连接在420[7]位置的苏氨酸残基上。在免疫反应和牛奶发酵过程中，唾液酸和半乳糖被酶去除，DBP的gcs亚型与剩余的GalNAc共价结合到苏氨酸420，已知可刺激巨噬细胞[8]。
除了对巨噬细胞功能的影响，GalNAc-DBP，有时也被一些作者指定为DBP-MAF(巨噬细胞激活因子)，已知可以直接抑制肿瘤血管生成和人前列腺和乳腺癌细胞增殖在体外(9 - 11)。
与这些观察结果一致，我们之前证实了GalNAc-DBP刺激Raw 264.7细胞(小鼠巨噬细胞系)在体外吞噬MCF-7细胞(人乳腺癌细胞)[5]。然而，在这些研究中，GalNAc-DBP被用作一种分离的、纯化的蛋白质，在生理条件下不与油酸复合。此外，这些结果是在活化的小鼠巨噬细胞和人乳腺癌细胞的共培养中获得的，因此它们不能直接推断人类肿瘤发生的情况。
因此，我们决定研究GalNAc-DBP配合油酸对人多发性骨髓瘤(KMS-12-BM)和霍奇金淋巴瘤(L540)细胞的作用，以及对已被GalNAc-DBP配合油酸活化的人脾巨噬细胞(CRL9853)的作用。
我们还研究了脾脏巨噬细胞的活化在活的有机体内利用最近发表的观察，GalNAc-DBP与油酸复合激活巨噬细胞，释放血管扩张分子一氧化氮(NO)，从而可以通过彩色多普勒超声直接显示脾脏血流增加[12]。
KMS-12-BM;L540:人多发性骨髓瘤(KMS-12-BM)和人霍奇金淋巴瘤(L540)细胞系购自DSMZ (German Collection of微生物与细胞培养，Braunschweig, Germany)，并在RPMI 1640中添加10%胎牛血清和2 mM l -谷氨酰胺(Life Technologies, Paisley, UK)培养。培养物每3-4天传代一次。
5.1.2中。CRL9853:人脾巨噬细胞购自ATCC (American Type Culture Collection, Teddington, UK)，在IMDM中常规培养，添加10%胎牛血清和2mM l -谷氨酰胺(Life Technologies, Paisley, UK)。培养物每3-4天传代一次。在实验之前，将CRL9853细胞在浓度为100ng/mL的GalNAc-DBP与油酸复合的完全培养基中激活培养72h。
在Immuno Biotech有限公司(Guernsey, Channel Island, GBG)，采用之前描述的[12]程序制备了市面上可买到的油酸配体GalNAc-DBP。在制备的最后，GalNAc-DBP与油酸的配合物在Macro Innovations Laboratories (Cambridge, UK)进行了分析，如表1所示。
表1。总结分析
测试 |
规范 |
结果 |
抗dbp蛋白印迹(anti-DBP Western Blot)批量产物鉴定 |
通过 |
通过 |
散装产品的非还原银染色鉴定 |
存在44kDa波段 |
存在44kDa波段 |
用非还原凝集素结合蛋白印迹法鉴定散装产品 |
检测44 kda |
检测44 kda |
膜过滤无菌，符合欧盟和USP药典要求 |
在培养14天后的样品中未观察到生长 |
通过 |
内毒素在最终填充产品上 |
< 0.25 |
0．05 |
最终填充产品的pH值 |
pH值7.0 - -7.9 |
pH值7.4 |
最终填充产品的外观 |
清澈无色液体 |
清澈无色液体 |
人源血浆HbsAG筛查 |
无电抗 |
无电抗 |
人源血浆抗- hcv筛选 |
无电抗 |
无电抗 |
人源血浆抗hbc筛选 |
无电抗 |
无电抗 |
人源血浆筛查抗hiv 1 |
负 |
负 |
人源血浆筛查抗hiv - 2 |
负 |
负 |
纯化源材料的鉴定经抗dbp Western Blot验证 |
通过 |
通过 |
考马斯氏染色凝胶纯化源材料的纯度(目测) |
> 95% |
> 95% |
以四氮唑盐(WST-8)的减少量作为细胞脱氢酶活性的指标，评价细胞增殖和活力。KMS-12-BM和L540细胞以3 × 10的密度接种于96孔板中4细胞/水井在适当的饥饿培养基中(不含胎牛血清)。孵育24h后，用以下不同浓度的galna - dbp与油酸[8-80-800 pM]配合处理24h。处理结束时，用100µL的新鲜饥饿培养基加10µL的WST-8培养基替代培养基。将96孔板37℃孵育3h，在A . C直接测量光密度(od值)450海里采用多扫描FC光度计(Thermo Scientific，米兰，意大利)。
为了证实通过细胞增殖和活力实验得到的结果，进行了活细胞计数。简单地，将KMS-12-BM和L540细胞以2x10的密度镀入6孔板中5细胞处于饥饿培养基中。孵育24h后，将GalNAc-DBP与油酸在增加浓度[8-80-800 pM]下复合物处理细胞24h。处理结束时，收集细胞悬液，台盼蓝染色计数活细胞数。
KMS-12-BM和L540细胞以1x10的密度接种于24孔板中61 mL体积的细胞/孔。在加入之前已被GalNAc-DBP与油酸复合激活的CRL9853巨噬细胞之前，让细胞沉淀至少2h。在放置24孔板之前，将垫片置于37℃，并使其保持平衡(图1)。
图1．微距创新实验室的视频延时摄影设置。
将活化的CRL9853人脾巨噬细胞加入最终浓度为5 × 105每孔加入HEPES (Fisher Scientific, Loughborough, UK)，最终浓度为25 mM，以稳定培养pH。
一旦加入活化的巨噬细胞和HEPES，显微镜下观察24孔板并选择图像。拍摄了初始帧，并启动了延时电影。每3分钟拍摄一帧，直到拍摄停止。
巨噬细胞活化在活的有机体内通过监测志愿者(MR)给药前后GalNAc-DBP与油酸复合的脾血流量进行评估。因此，众所周知，活化的巨噬细胞释放NO，这是一种引起血管扩张的化合物，似乎与活化的巨噬细胞的某些抗癌特性有关[13,14]。我们使用超声系统(MyLab25Gold, Esaote, Genova, Italy)使用彩色多普勒技术研究了GalNAc-DBP与油酸(440-880 ng溶解在5 mL生理盐水中)复合给药前后的脾脏血流。
通过Tetrazolium染色细胞试验(图2A)和Trypan Blue染色(图2B)评估KMS-12-BM人多发性骨髓瘤细胞增殖和活力(图2)，当细胞被增加浓度的GalNAc-DBP与油酸复合物处理时，细胞增殖和活力下降。特别是，当细胞被GalNAc-DBP与油酸复合物[800 pM]处理时，与未处理的对照细胞相比，细胞活力显著降低(p<0.01)。
板一个．GalNAc-DBP与油酸的络合，缩写为GalOA。结果显示，[8 pM]对细胞增殖有轻微的抑制作用，在[800 pM]时显著增强，表明对细胞增殖有直接影响。面板B．随着GalNAc-DBP与油酸络合浓度的增加，活细胞数量的减少证实了观察到的细胞活力测定数据。结果以平均值±S.E.M.表示。(* p < 0.01)。
在L540人霍奇金淋巴瘤细胞中获得了相同的结果(图3,A和B图)。与油酸复合物的GalNAc-DBP对细胞增殖和活力的抑制甚至比在人多发性骨髓瘤细胞中观察到的更明显。
图3．L540细胞增殖试验和台盼蓝活细胞计数。
板一个．GalNAc-DBP与油酸的络合，缩写为GalOA。结果显示，[8 pM]对细胞增殖有轻微的抑制作用，在[800 pM]时显著增强，表明对细胞增殖有直接影响。面板B．随着GalNAc-DBP与油酸络合浓度的增加，活细胞数量的减少证实了观察到的细胞活力测定数据。结果以平均值±S.E.M.表示。(* p < 0.01)。
图4显示了KMS-12-BM细胞在CRL9853人脾巨噬细胞存在下随时间的选定帧镜头，这些巨噬细胞此前已被GalNAc-DBP与油酸复合物激活，条件描述在“材料和方法，如图1所示。图A为KMS-12-BM悬浮培养的典型生长模式。B图显示加入活化巨噬细胞24h后的KMS-12-BM细胞。CRL9853脾巨噬细胞培养物呈大量悬浮细胞，细胞密集聚集在KMS-12-BM悬浮细胞上。在观察中，活化的巨噬细胞非常活跃，四处移动，清除KMS-12-BM细胞。在吞噬过程中，更小的致密细胞“团簇”脱落并相当迅速地清除KMS-12-BM细胞。C图显示激活的人巨噬细胞加入48h后的KMS-12-BM细胞。可以观察到，CRL9853细胞现在有一些大的细胞团“簇”和许多较小的“簇”(红色箭头)。KMS-12-BM细胞数量减少，细胞清除情况明显。最后，D图显示激活的人巨噬细胞CRL9853添加72h后的KMS-12-BM细胞。 Activated CRL9853 cells are still extremely active with the phagocytic activity and are clearing the KMS-12-BM cells from the culture. This image shows the smaller clusters of cells as indicated by the red arrows. The clusters have become smaller and rapid moving seeking out and destroying the remaining KMS-12-BM cells. Qualitatively identical results were obtained with L540 human Hodgkin’s lymphoma cells (not shown).
图4．KMS-12-BM被人脾脏巨噬细胞攻击的视频延时摄影，这些巨噬细胞之前已被GalNAc-DBP与油酸复合物激活。
KMS-12-BM细胞在CRL9853人脾巨噬细胞存在的情况下随时间选择帧拍摄，该巨噬细胞此前已被GalNAc-DBP与油酸复合物激活，条件描述在“材料和方法”。用于图像的解释;请参阅结果”一节。
脾脏的超声检查和脾脏巨噬细胞的活化在活的有机体内
由于上述结果表明，GalNAc-DBP与油酸复合物可激活人脾巨噬细胞在体外，我们决定研究是否可以观察到类似的激活在活的有机体内．为此，我们利用了活化巨噬细胞释放NO[13]的事实。考虑到NO在癌症临床前模型中令人印象深刻的作用，它可以减缓肿瘤生长，并提高化疗和放疗[15]的疗效，我们推断，脾脏巨噬细胞的激活观察在活的有机体内进一步证实了GalNAc-DBP与油酸复合作为综合免疫治疗药物的假设。
因此，我们选择通过雾化给药GalNAc-DBP与油酸(880 ng，溶解在5 mL生理盐水中)复合后，研究脾脏血流的变化。根据我们的假设，与油酸结合的GalNAc-DBP会被吸收到血液中，刺激脾脏[16]中大量的巨噬细胞。因此，我们预计该器官中激活的巨噬细胞会释放大量NO，从而导致血管扩张和血流增加，我们可以通过彩色多普勒超声测量血流。
我们其中一人(MR)通过雾化给药约5分钟，将GalNAc-DBP与油酸(880 ng，溶解在5 mL生理盐水中)复合。之后，受试者(放射科专家)用彩色多普勒超声自检脾脏。
图5 A、B板为雾化前志愿者脾脏的超声图像;形态、大小及超声结构均正常。脾脏血流量可与脾脏门相对应。门部血管平均直径4.4 mm。图5 C、D图显示雾化后15分钟脾血流。可以看出血管舒张和血流增加。门部血管平均直径6.1 mm。假设血管的几何形状是规则的，就像它们是完美的圆形一样，切片面积的增加可以计算为大约85%。我们将这种血管扩张和血流增加解释为脾内巨噬细胞激活并释放NO的结果，NO反过来又负责肺门血管扩张。这种效果至少持续48小时。
图5．GalNAc-DBP复合油酸给药前后脾脏的超声表现。
板一个脾脏的形态、大小和超声结构显示正常:脾脏血流可与脾脏门相对应。面板B(放大):门部血管平均直径4.4 mm。在检查过程中使用超声系统的专有应用进行测量。C组和D组(放大):GalNAc-DBP与油酸复合雾化后15min脾血流量。门部血管平均直径6.1 mm。
与油酸复合的GalNAc-DBP可以被认为是一种生理/天然化合物，在哺乳动物的血浆中产生于[17]免疫反应、在发酵过程中产生于牛奶和初乳中[18,19]。GalNAc-DBP作为一种分离蛋白，已经在许多疾病的实验模型中进行了研究，从骨硬化[17]到癌症[10]和自闭症[20]。
2021年版权燕麦。所有权利reserv然而，GalNAc-DBP与油酸的络合作用尚未在对照实验模型中进行研究。换句话说，所有关于这一课题的研究都集中在分离蛋白的作用上，而不是蛋白质与油酸生理组装的整体作用。因此，在一种可能的综合免疫治疗方法的背景下，我们决定研究galna - dbp与其天然对应物油酸的作用。
在这项研究中，我们证明了GalNAc-DBP与油酸复合物，刺激人脾巨噬细胞，两者在体外和在活的有机体内虽然显示巨噬细胞活化在活的有机体内是间接的。与单独GalNAc-DBP相比，复合GalNAc-DBP油酸的作用更明显;油酸本身未刺激人脾巨噬细胞(未显示)。
经GalNAc-DBP与油酸复合物预激活的人脾巨噬细胞能够识别和吞噬人癌细胞即。多发性骨髓瘤和霍奇金淋巴瘤细胞。
然而，GalNAc-DBP与油酸复合，除了激活杀瘤巨噬细胞的作用外，还对人骨髓瘤和霍奇金淋巴瘤细胞培养产生直接作用，并抑制其增殖和活力。这些结果与格雷戈里之前报道的结果一致等．和Paciniet al。分别作用于人前列腺癌和乳腺癌细胞[10,11]。
我们假设，该蛋白与油酸相关时所发挥的多种生物学效应可以用最近发现的所谓“内在无序结构域”(IDDs)来解释。目前人们普遍认为，具有IDDs的蛋白存在于生物的各个领域，在真核生物中具有广泛的生物学功能，包括调节和信号转导[21]。这些域缺乏固定或有序的三维结构，覆盖了从完全非结构到部分结构的状态谱，可能包括随机线圈、熔融球体和由柔性连接器连接的大的多个域。它们的移动灵活性和结构不稳定性是由其氨基酸序列[22]编码的。
因此，idd的特征是疏水氨基酸与带正电和负电的氨基酸相互点缀。因此，这些结构域无法掩埋足够的疏水核心，从而像稳定的球状蛋白[23]一样折叠。然而，当一个庞大的疏水分子，如油酸分子，与含有IDD的蛋白质区域结合时，IDD的分子构型发生了巨大的变化，同时与其他靶分子相互作用的特异性也发生了变化。
利用基于主要序列组成的无序预测算法，我们在GalNAc-DBP中发现了两个IDD(图6)，有趣的是，其中一个IDD(由于其在氨基酸序列中的位置而被指定为IDD2)位于油酸结合的同一区域。油酸结合的疏水浅裂缝位于域II和域III之间，位于288和371位置之间，因此包含位于298-325位置之间的IDD2。
图6．提出了具有两个本质无序域的GalNAc-DBP的三维结构。
两个本质紊乱域(IDD)被证明为蓝色(IDD1)和红色(IDD2)。IDD2序列中氨基酸(298-325氨基酸)的特征在插入物中描述。黄色表示疏水氨基酸。红色的是带负电荷的氨基酸。浅蓝色是赖氨酸，一种带正电的氨基酸。虚线箭头表示油酸结合的疏水浅裂缝。脂肪酸结合位点位于II域和III域之间，位于288和371位之间，因此包含IDD2。
因此，我们假设该蛋白的多种效应，特别是当它与天然对应物油酸复合时，是由于这种特殊的IDD2与疏水分子(如油酸)的非共价结合而修饰的。
这一发现在基于分子结构的癌症综合免疫治疗的背景下可能特别有趣。例如，人类主要的致癌基因之一，myc，编码了一种内在无序的蛋白质，它可以通过形成动态复合物[21]而被小分子结合和抑制。
因此，我们可以假设galna - dbp与油酸复合物结合Myc(和/或其他癌基因或肿瘤抑制基因的产物)，从而在分子水平上抵消癌蛋白的作用。油酸结合附近正电荷和负电荷氨基酸的存在使分子复合物高度动态，从而有利于与具有类似IDDs[24]的多个靶蛋白(如Myc或p53)相互作用。
利益冲突:MR先生担任Immuno Biotech, Ltd(分离纯化n -乙酰半乳糖胺-糖基化维生素D结合蛋白并生产油酸配合物)的外部咨询科学总监至2015年2月。然而，MR没有事先了解实验方案，他没有参与实际的计划和执行在体外实验描述在本文中。只有在结果得到其他作者的验证和验证之后，以及在超声研究中，他才参与了结果的分析和分子建模。
音)山口
埃默里大学医学院
研究文章
收稿日期:2015年2月24日
录用日期:2015年3月14日
发布日期:2015年3月17日
布兰卡JJV©2015。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可协议的条款下发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。
Branca JJV, Smith RJ, Ward E, Ruggiero M(2015)糖基化维生素D结合蛋白与油酸复合物对人骨髓瘤和霍奇金淋巴瘤培养的影响。整合癌症科学治疗。2:DOI: 10.15761/ICST.1000126
表1。总结分析
测试 |
规范 |
结果 |
抗dbp蛋白印迹(anti-DBP Western Blot)批量产物鉴定 |
通过 |
通过 |
散装产品的非还原银染色鉴定 |
存在44kDa波段 |
存在44kDa波段 |
用非还原凝集素结合蛋白印迹法鉴定散装产品 |
检测44 kda |
检测44 kda |
膜过滤无菌，符合欧盟和USP药典要求 |
在培养14天后的样品中未观察到生长 |
通过 |
内毒素在最终填充产品上 |
< 0.25 |
0．05 |
最终填充产品的pH值 |
pH值7.0 - -7.9 |
pH值7.4 |
最终填充产品的外观 |
清澈无色液体 |
清澈无色液体 |
人源血浆HbsAG筛查 |
无电抗 |
无电抗 |
人源血浆抗- hcv筛选 |
无电抗 |
无电抗 |
人源血浆抗hbc筛选 |
无电抗 |
无电抗 |
人源血浆筛查抗hiv 1 |
负 |
负 |
人源血浆筛查抗hiv - 2 |
负 |
负 |
纯化源材料的鉴定经抗dbp Western Blot验证 |
通过 |
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考马斯氏染色凝胶纯化源材料的纯度(目测) |
> 95% |
> 95% |
图1．微距创新实验室的视频延时摄影设置。
板一个．GalNAc-DBP与油酸的络合，缩写为GalOA。结果显示，[8 pM]对细胞增殖有轻微的抑制作用，在[800 pM]时显著增强，表明对细胞增殖有直接影响。面板B．随着GalNAc-DBP与油酸络合浓度的增加，活细胞数量的减少证实了观察到的细胞活力测定数据。结果以平均值±S.E.M.表示。(* p < 0.01)。
图3．L540细胞增殖试验和台盼蓝活细胞计数。
板一个．GalNAc-DBP与油酸的络合，缩写为GalOA。结果显示，[8 pM]对细胞增殖有轻微的抑制作用，在[800 pM]时显著增强，表明对细胞增殖有直接影响。面板B．随着GalNAc-DBP与油酸络合浓度的增加，活细胞数量的减少证实了观察到的细胞活力测定数据。结果以平均值±S.E.M.表示。(* p < 0.01)。
图4．KMS-12-BM被人脾脏巨噬细胞攻击的视频延时摄影，这些巨噬细胞之前已被GalNAc-DBP与油酸复合物激活。
KMS-12-BM细胞在CRL9853人脾巨噬细胞存在的情况下随时间选择帧拍摄，该巨噬细胞此前已被GalNAc-DBP与油酸复合物激活，条件描述在“材料和方法”。用于图像的解释;请参阅结果”一节。
图5．GalNAc-DBP复合油酸给药前后脾脏的超声表现。
板一个脾脏的形态、大小和超声结构显示正常:脾脏血流可与脾脏门相对应。面板B(放大):门部血管平均直径4.4 mm。在检查过程中使用超声系统的专有应用进行测量。C组和D组(放大):GalNAc-DBP与油酸复合雾化后15min脾血流量。门部血管平均直径6.1 mm。
图6．提出了具有两个本质无序域的GalNAc-DBP的三维结构。
两个本质紊乱域(IDD)被证明为蓝色(IDD1)和红色(IDD2)。IDD2序列中氨基酸(298-325氨基酸)的特征在插入物中描述。黄色表示疏水氨基酸。红色的是带负电荷的氨基酸。浅蓝色是赖氨酸，一种带正电的氨基酸。虚线箭头表示油酸结合的疏水浅裂缝。脂肪酸结合位点位于II域和III域之间，位于288和371位之间，因此包含IDD2。
