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摘要

日本传统的汉布药goshajinkagan已被经验用于治疗与糖尿病神经病变相关的麻木，冷感和肢体疼痛。经验效应的机制之一被认为是由于神经肽水平的局部变化。本研究的目的是研究棉合金吉甘对健康人血浆降钙素基因相关肽(CGRP)-、P-物质和血管活性肠多肽(VIP)样免疫反应物质(is)的影响。7名健康男性口服Gosyajinkigan (4.5 g)或安慰剂。在给药前、给药后20、40、60、90、120、180和240 min采集血样，进行提取，并提交给高灵敏度的CGRP-、P-物质和VIP-IS酶免疫测定系统。与安慰剂相比，单次口服goshajinkigan可显著增加血浆CGRP-和VIP-IS水平。本研究认为，goshajinkagan可能通过释放CGRP和VIP等神经肽来改善周围神经功能障碍。

关键字

日本汉方药，谷沙金基甘，神经肽，酶免疫测定

缩写

CGRP:降钙素基因相关肽;VIP:血管活性肠多肽;EIA:酶免疫测定

介绍

胃肠运动主要受体液激素和来自中枢和外周神经系统的神经递质两大因素调节。神经肽通过内分泌激素和肽能递质对胃肠运动起作用[1]。这些多肽作为调节介质是机体整合的重要组成部分，对胃肠道的生理功能具有重要的调节作用。最近的研究表明，一些手术后胃肠运动障碍和慢性应激与神经肽有关，如血管活性肠肽(VIP)、降钙素基因相关肽(CGRP)、P物质(图1)[2,3]。

图1所示。神经肽的初级结构

图2。口服goshajinkagan 7.5 g(●)或安慰剂(〇)对健康受试者血浆CGRP-IS水平的影响每个点代表平均值±标准差，n=7。**与安慰剂比较P < 0.01

图3。口服goshajinkagan 7.5 g(●)或安慰剂(〇)对健康受试者血浆P-IS水平的影响

每个点代表平均值±标准差，n=7。

图4。口服goshajinkagan 7.5 g(●)或安慰剂(〇)对健康受试者血浆VIP-IS水平的影响每个点代表平均值±标准差，n=7。** P < 0.01， *P < 0.05。

传统草药已经被使用了几千年，对许多主观症状的治疗做出了很大的贡献。Goshajinkigan是一种由十种生药组成的汉方药，传统上用于改善糖尿病神经病变相关的麻木、冷感、肢体疼痛等症状[4]。此外，有报道称，晚期结直肠癌患者服用goshajinkigan可减轻奥沙利铂等抗癌药物引起的周围神经毒性[5]。据报道，goshajinkigan在治疗下肢疼痛控制、麻木、视力模糊、排尿困难和水肿方面的临床疗效得到了特别的评价[5]。有一些报告说，包括附子在内的汉布药已被用来改善体质和新陈代谢较弱的人的健康。乌头的药理作用被描述为正性肌力作用[6]。

近年来，一些汉布药从神经肽水平的角度进行了药理学研究[7-10]。其中，大kenchuto与西沙必利、甲氧氯普胺等促胃肠运动药物类似，具有增强胃肠动力的潜力[11]，并可提高健康人及吗啡所致便秘患者血浆神经肽水平[7-10]。这些结果提示该药具有新的药理作用。目前，关于神经肽与骨沙金基根的时间关系的研究报道也很少。因此，我们推测goshajinkagan可能引起血浆中神经肽的改变，这可能参与神经功能障碍的发病机制。本研究的目的是确定goshajinkagan的临床效果是否与服用goshajinkagan后血浆CGRP-、P-物质和vip样免疫反应物质(IS)水平的变化有关。

材料与方法

材料

Goshajinkigan购自Tsumura株式会社(Tokyo, Japan)，各原料药成分比例如下:生地黄基数(5.0 g);Achyranthis基数(3.0 g);山茱萸果(3.0 g);牡丹皮层(3.0 g);Alismatics根茎(3.0 g);薯蓣属根茎(3.0 g);Plantaginis精液(3.0 g);Hoelen(3.0 g)，加工率块茎(1.0 g)，和、肉桂goshajinkigan的剂量以临床每日最大剂量为标准。安慰剂是结晶纤维素和乳糖，比例为1:1。合成人VIP、CGRP及其片段(8-37)和P物质购自Peptide Institute (Osaka, Japan)。VIP片段肽由H. Yajima教授(京都大学，京都，日本)提供。VIP抗血清(A604/R1B)和CGRP抗血清(CA1132)购自Biogenesis (Poole, UK)， P物质(RA-08-095)购自Cambridge Research Biochemicals (Cambridge, UK)。山羊亲和纯化兔IgG抗体(全分子)(55641)购自ICN Pharmaceuticals (Aurora, OH, USA)。所有其他试剂均为商业来源的分析试剂级。

主题

7名健康男性志愿者(不吸烟)，年龄24-35岁(中位年龄27岁)，体重53-72公斤(中位体重60公斤)。每位受试者都收到了有关该研究的科学目的的信息，该信息已得到大分医科大学伦理委员会的批准，并给予知情同意。在试验前1个月没有受试者接受任何药物治疗，在研究期间没有受试者使用胃肠道运动刺激剂。

学习计划

Goshajinkigan (7.5 g)或安慰剂与100 mL水一起口服。所有受试者都遵循相同的药物-安慰剂顺序。每名受试者每隔四周服用这些药物。在给药前、给药后20、40、60、90、120、180和240分钟取自前臂静脉的静脉血样本(10 mL)。此外，有报道称，14:00 ~ 18:00时血浆CGRP、P物质及VIP密度均无生理变化[12,13]。研究时间为14:00 - 18:00。

血浆提取物的制备

血样在冷冻管中采集，冷冻管中含有抑肽酶(500-钾化肽抑制剂单位/mL)和乙二胺四乙酸(EDTA) (1.2 mg/mL)。离心后，血浆样品用4%醋酸(pH 4.0)稀释，装于Sep-Pak C上₁₈墨盒(Millipore Corp.， Milford, USA)，并用4%醋酸洗涤。血浆中的肽用70%乙腈在0.5%醋酸(pH 4.0)中洗脱，冻干，用测定缓冲液重组到100 μL，进行EIA。对于EIA系统，血浆样品用Sep-Pak C浓缩5倍₁₈墨盒。血浆CGRP-、P-物质和VIP-IS的回收率均>90%。

如前所述，采用延迟加法法[16]对CGRP、物质P、CGRP-[12]、物质P-[14]和VIP- is[15]进行环境影响评价。在抗兔IgG包被免疫板上分离结合抗原和游离抗原。荧光产物4- methylumbellliferon用MTP-100F酶标仪(Corona Electric, Ibaraki, Japan)测定。将人片段VIP(11-28)、人CGRP(8-37)和P物质与β- d -半乳糖苷酶(Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany)和N-(ε-maleimidocaproyloxy)-琥珀酰亚胺按照北川法偶联et al。[17]。VIP、CGRP和P物质的环境影响评价具有特异性和高灵敏度，检测限分别为1.00、0.08和0.40 fmol/well。

统计分析

所有数值均以均数±标准差表示。通过重复测量的方差分析和Dunnet检验来评估统计显著性。p < 0.01或p < 0.05为差异有统计学意义。

结果与讨论

几千年来，人们一直用goshajinkagan来改善胃肠功能。有报道称，goshajinkagan能显著改善周围神经病变。以往的研究表明，外周血流量的影响主要受激素和神经元机制的调节，这可能与神经肽有关。因此，本研究通过检测调节外周血流量的CGRP、P物质和VIP来研究goshajinkigan的作用。

健康受试者给药后血浆CGRP-和P-IS物质水平-时间谱如图2和3所示。与安慰剂组(7.5±0.9 pg/mL)相比，Goshajinkigan在60分钟时显著增加CGRP-IS(15.5±2.4 pg/mL)。但是Goshajinkigan并没有改变P物质的水平。

健康受试者服用goshajinkagan后血浆VIP-IS水平-时间曲线见图3。与安慰剂(30分钟4.0±1.0 pg/mL, 60分钟3.7±0.6 pg/mL, 120分钟3.5±0.7 pg/mL)相比，Goshajinkigan在30、60和120分钟显著增加VIP-IS(30分钟5.7±0.4 pg/mL, 60分钟5.5±0.6 pg/mL, 120分钟5.0±1.1 pg/mL)。

CGRP具有多种有效的生物活性，包括血管舒张，在胃肠道粘膜中，其受外源性感觉神经刺激释放后的血管舒张作用被认为是维持粘膜完整性的重要保护机制[18]。此外，CGRP也存在于肠神经元中[19]，对胃肠道运动和分泌有重要影响[20]。已有研究报道，介导粘膜刺激蠕动反应的内在感觉通路利用CGRP作为感觉递质[21]。此外，CGRP在有意识的狗体内是一种有效的肠道血管扩张剂，导致肠道血流量增加[22]。血液中的CGRP主要来自肠道和血管。CGRP可通过应激、肠缺血再灌注损伤等器官刺激从血管周围的神经末梢广泛释放进入循环。在本研究中，goshajinkagan显著提高血浆CGRP-IS水平。因此，goshajinkagan基于人血浆中CGRP- is水平增加的机制可能包括CGRP介导的肠道和外周血流量增加。Gosyajinkigan通过抑制脊髓瞬时受体电位香草样蛋白1 (TRPV1)来预防奥沙利铂诱导的急性周围神经病变。TRPV1在脊柱水平调控的P物质和CGRP参与奥沙利铂诱导的神经性疼痛[23]。 It might be thought that goshajinkigan prevents peripheral neurotoxicity by chemotherapy via CGRP.

VIP广泛分布于中枢和周围神经系统。这种肽具有血管扩张作用，增加外周血流量。VIP也是哺乳动物肠道运动的主要调节因子，可诱导回肠纵肌预收缩松弛，并介导蠕动反射[24]。在我们的研究结果中，goshajinkagan增加了血浆VIP-IS水平。这种作用可能与附子管中所含的附子管有关。附子的制剂已被用于治疗，以提高周围体温。该草药含有乌头生物碱(乌头碱、中乌头碱等)作为其生物活性成分。在先前的一项研究中，有报道称，梅乌头碱在离体大鼠主动脉中引起强烈的松弛，这种松弛主要是内皮依赖的，由一氧化氮(NO)介导，一氧化氮是一种强大的血管舒张剂[25]。Suzuki等人报道，goshajinkigan已被证明通过增加NO的产生来增加外周血流量并表现出镇痛作用[26]。已知NO是VIP/胆碱能血管舒张的神经元共介质，并与VIP共定位于肌肠丛[27]。 Although it has not been demonstrated previously whether Aconiti tuber directly stimulates VIP-containing nerves, this herb or others combinations might be closely related to the release of VIP in autonomic nervous system.

在本研究中，生命体征如血压(舒张压和收缩压)和脉搏在服用goshajinkigan或安慰剂后没有改变(数据未显示)。

我们认为goshajinkagan可能通过显著提高血浆中CGRP-和VIP-IS水平来改善周围神经功能障碍。然而，由于目前的结果对于案例数量较少，因此很难简单地比较效果，因此需要在未来进一步考虑。goshajinkagan对神经肽的影响是在健康受试者中发现的，因此从本质上讲，goshajinkagan对病理状态和局部部位神经肽水平的研究是必要的。

版权所有OAT。版权所有

利益冲突

作者声明他们与这项研究没有利益冲突。

致谢

作者感谢大分大学医院所有协助收集数据的药学人员。

伦理批准

本研究是按照大分医科大学伦理委员会通过并经日本政府通知的人体研究护理指南进行的。

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