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摘要

流行病学研究和干预试验的结果似乎表明，饮用绿茶可以预防2型糖尿病。抗糖尿病作用最常见的原因是绿茶中的多酚部分。绿茶含有儿茶素;然而，它们也含有黄酮醇及其苷。在这里，我们用NSY(名古屋-柴田-安田)小鼠在2型糖尿病小鼠模型中比较了普通茶树和富含黄酮醇的茶树的抗糖尿病作用。从4周龄到13周龄，NSY小鼠单独饮用由普通(对照茶，TeaC)或富含黄酮醇(富含黄酮醇的茶，TeaF)品种制成的水或茶输液。12周龄时，喝TeaF的小鼠空腹血浆胰岛素浓度明显低于喝水的小鼠。相对于水，TeaC对血浆胰岛素水平无显著影响。因此，在维持葡萄糖稳态方面，普通茶树和富含黄酮醇的茶树品种之间存在显著差异;因此，茶黄酮醇很可能对预防糖尿病有好处。

关键字

富含黄酮醇的茶树品种，槲皮素糖苷，糖耐量试验，NSY糖尿病小鼠

介绍

糖尿病是一个严重的公共卫生问题，其相关疾病造成了日益严重的潜在巨大的经济负担。虽然已经开发了有效的手术和药理方法来治疗糖尿病相关症状，但这些治疗可能成本高昂，并不是没有潜在的不良反应[1-4]。开发预防糖尿病的膳食制剂可能是解决公共卫生问题的一种具有成本效益和安全的方法。流行病学调查结果表明，饮用绿茶可以预防2型糖尿病，非胰岛素依赖型糖尿病5,6]，越来越多的证据表明，饮用绿茶可以改善人类[7]和糖尿病小鼠[8]的糖代谢。绿茶含有特有的多酚化合物，即儿茶素，这被认为是绿茶产生生理作用的主要原因。然而，茶[10]中也存在黄酮醇及其苷，茶中主要黄酮醇之一的槲皮素在糖尿病小鼠模型中也具有抗糖尿病作用[11-13]。我们之前测量了不同品种茶叶中黄酮醇苷的浓度，并鉴定出黄酮醇含量高的品种[14]。在这里，我们比较了普通茶树品种和富含黄酮醇的品种之间的抗糖尿病作用，以检查茶黄酮醇是否可以改善2型糖尿病小鼠模型中的葡萄糖耐受不良。此前，通过选择性ICR小鼠菌群生成NSY(名古屋-柴田-安田)小鼠，建立2型糖尿病[15]小鼠模型;这些小鼠会自发地出现类似糖尿病肾病的肾脏病变，但在任何发育阶段都不会变成严重的肥胖。 These characteristics are similar to the pathophysiologic features of human type 2 diabetes patients; therefore, NSY mice were used as a model of type 2 diabetes in the present study.

材料与方法

NSY小鼠(4周龄，雄性)购自Hoshino实验室动物株式会社(日本茨城)。小鼠被给予标准的实验室饮食(CRF-1，查尔斯河实验室公司。Wilmington, MA)，环境控制的房间(24˚C, 60%相对湿度，12小时明暗循环)。本研究由日本NARO蔬菜和茶叶科学研究所动物实验伦理委员会(no. h26 -01)批准，所有动物实验均按日本国立蔬菜和茶叶科学研究所动物实验伦理委员会(no. h26 -01)的规定进行。105及通知书编号日本政府的6分。

“Sofu”绿茶茶叶(富含黄酮醇的茶叶:TeaF)来自日本鹿儿岛Makurazaki的NARO种植园，对照“Yabukita”茶叶(对照茶:TeaC)来自日本静冈县金谷的NARO种植园。将每个品种的干绿茶分别浸泡在冷水中1小时;滤液的等份被冷冻，直到用于实验。在将原液喂给小鼠之前用水稀释，每两天向所有小鼠提供新鲜的饮用水。LC/MS用于测定前面[14]所述稀释茶水中的黄酮醇苷水平。采用高效液相色谱法测定儿茶素和咖啡因水平，如前所述[17]。

为了研究茶输注是否会影响葡萄糖耐受不良，NSY小鼠单独饮用TeaC和TeaF组(分别为TeaC组和TeaF组)8周。对照组NSY小鼠给予水(水组)代替茶水。每周分别测量一次体重和两次食物摄入量。葡萄糖耐量试验(GTTs)通过腹腔注射葡萄糖(2 g/kg体重)到禁食过夜的小鼠，并已饮用实验液体4或8周;这些动物分别为8周龄或12周龄。分别于葡萄糖注射后0、30、60、120、240 min尾静脉采血。使用glucose Pilot系统(Iwai Chemical Co.， Tokyo, Japan)测量血糖浓度。在i.p. GTT过程中，分别于0和30min采集尾静脉全血，测量胰岛素水平。每个血液样本立即被离心(3000xg， 5min, 4°C)分离血浆。Libs小鼠胰岛素ELISA试剂盒(Shibayagi Co.， Ltd，群马，日本)根据制造商的方案来测量血浆胰岛素水平。实验结束时，这些小鼠已经13周龄;他们禁食一晚，然后用异氟醚麻醉。从每只麻醉小鼠的腋下动脉采集血液样本到肝素化管中。胰腺、肝脏和附睾脂肪垫被迅速从每只动物身上取出并称重。甘油三酯测试Wako试剂盒(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.， Osaka, Japan)用于酶法测量血浆甘油三酯水平。

所有数据均以均数±标准差表示。采用单因素方差分析(ANOVA)和随后的Scheffe事后检验(post-hoc test)比较各组间的均值。当数据非正态分布时，采用Kruskal-Wallis检验。与a的区别p值小于0.05为显著性。值得注意的是，为了确定茶对血糖和胰岛素水平的影响的显著性(图1)，进行了重复测量方差分析，然后，如果该分析检测到统计学显著性，则对每个测量时间进行进一步的组间统计比较，采用单向方差分析和后续的Scheffe检验。

图1．茶冲剂对NSY小鼠糖耐量和胰岛素反应的影响。在8 (A, C)或12 (B, D)周龄时进行葡萄糖耐量试验(gtt)。测量gtt期间的血糖浓度(A, B)和血浆胰岛素(C, D)。所有值均为平均值±SEM (n = 4或5)p< 0.05;在每个时间点上与Water组有显著差异，由单向方差分析确定，然后进行Scheffé的检验。

结果与讨论

使用我们之前研究[14]的方案，我们确定了每种茶冲剂中两种杨梅素、五种槲皮素和三种山奈酚苷的浓度(表1)。在测量的槲皮素苷中，槲皮素-3-O-葡萄糖-鼠李糖-葡萄糖苷在两种茶泡茶中都是最丰富的，TeaC和TeaF，就像之前的研究[14]一样。槲皮素-3-的水平O-葡萄糖-鼠李糖-葡萄糖苷在TeaF中明显高于TeaC。TeaF中总苷元含量也高于TeaC中所测量的所有苷元。如表2所示，虽然TeaC和TeaF中儿茶素的组成略有差异，但TeaF中儿茶素和咖啡因的总量与TeaC中相似。TeaC组和TeaF组的日摄入量分别约为700 μg和1500 μg。对于两个茶输液组，每天的总儿茶素和咖啡因摄入量分别约为7.0毫克和1.3毫克。

黄酮醇苷(µg/ml)	问题	TeaF
Myricetin-3 -O -配糖体	13.0	20.7
Myricetin-3 -O -半乳糖苷	29.8	44.6
Quercetin-3 -O -葡萄糖苷(异槲皮苷)	的留言	3.4
Quercetin-3 -O -半乳糖苷(Hyperoside)	6.1	15.1
Quercetin-3 -O -rutinoside(芦丁）	1.4	20.6
Quercetin-3 -O -glucosyl-rhamnosyl-glucoside	93.4	325.9
Quercetin-3 -O -glucosyl-rhamnosyl-galactoside	80.0	90.4
Kaempferol-3 -O -rutinoside	2.5	10.4
Kaempferol-3 -O -glucosyl-rhamnosyl-glucoside	36.4	93.4
Kaempferol-3 -O -glucosyl-rhamnosyl-galactoside	96.1	73.2
总苷元(µg/ml)
杨梅酮	28.4	43.3
槲皮素	72.6	185.2
山柰酚	51.3	68.1

表1。茶水中黄酮醇苷的含量

对照茶(TeaC)由普通茶树品种制成，富黄酮醇茶(TeaF)由富黄酮醇茶树品种制成。总苷元含量由相应苷的浓度计算。N.d:未检测到。

儿茶素(毫克/ 100毫升)	问题	TeaF
儿茶素	1.9	3.2
儿茶素没食子酸盐	的留言	0.2
儿茶素	2.9	4.4
儿茶素没食子酸盐	的留言	的留言
表儿茶素	16.6	25.4
表儿茶素没食子酸盐	5.5	5.4
儿茶素	81.8	78.8
儿茶素没食子酸盐	42.5	26.2
总计	151.2	143.6
咖啡因(毫克/ 100毫升)	30.7	23.8

表2．茶中的儿茶素和咖啡因含量

N.d:未检测到

在整个实验过程中，各组之间的体重或摄食量均无显著差异(表3)。因此，相对于水，TeaC和TeaF均未显著影响NSY小鼠的体重增加或摄食量。gtt的结果如图1所示。在Water组，12周龄时胰岛素对葡萄糖的反应(图1b, 1D)相对于8周龄时受损(图1A, 1C)。这一结果与先前的研究结果一致，即NSY小鼠自发地以年龄依赖的方式发展糖尿病[16,18]。12周龄时，虽然各组间GTT期间的血糖波动无显著差异(图1B)，但TeaF组空腹血浆胰岛素浓度明显低于Water组(图1D)。TeaC组空腹血浆胰岛素浓度与Water组无显著差异(图1D)。这些结果表明，摄入TeaF可改善NSY小鼠的胰岛素反应受损，而不是TeaC。

	水	问题	TeaF
体重(g)
4 w	22.08±1.08	21.46±0.52	21.36±0.38
8 w	33.98±1.21	33.76±0.40	32.70±0.63
12 w	36.48±1.47	35.70±0.62	35.04±0.39
日摄食量(克/天/头)	4.31±0.10	4.62±0.18	4.52±0.13

表3。体重和食物摄入量的变化

所有数值均为均值±SEM (n = 4或5)。在整个实验过程中，各组间体重和摄食量无显著差异。

在实验期结束时，13周龄小鼠处于禁食状态，各组之间的体重、胰腺重量或肝脏重量没有显著差异(表4)。然而，TeaF组附睾脂肪垫重量明显低于Water组。TeaC组的平均脂肪垫重量也低于Water组，但这种差异不显著(p< 0.1)。既往研究发现NSY小鼠存在轻度肥胖[16,18]，Water组的平均脂肪垫质量大于年龄匹配的非亲代ICR小鼠(484.1±60.6 mg, n = 4，未发表数据)，从NSY小鼠中选择性培养葡萄糖耐受不良。因此，这些茶水，特别是茶af，被认为可以抑制NSY小鼠的脂肪积累。大量研究表明，绿茶及其提取物在糖尿病小鼠模型中具有抗肥胖作用[8,19]。对于NSY小鼠的三个治疗组，空腹血浆甘油三酯水平明显高于年龄匹配的ICR小鼠(85.5±9.0 mg/dl, n = 4，未发表数据)(表4)。然而，对于NSY小鼠，三个治疗组(Water, TeaC和TeaF)之间的甘油三酯水平没有显著差异;这表明TeaC和TeaF不影响NSY小鼠的血浆甘油三酯水平。

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	水	问题	TeaF
体重(g)	32.83±1.17	32.98±0.53	32.34±0.36
胰腺(毫克)	169.1±7.0	168.5±5.4	172.4±7.4
肝脏(g)	1.250±0.029	1.298±0.043	1.254±0.034
附睾脂肪垫(mg)	1006.2±135.3	726.6±54.5	647.6±48.8*
血浆甘油三酯(mg/dl)	135.0±15.6	149.6±9.3	119.7±16.0

表4。茶冲剂对NSY小鼠体重、器官重量及血浆甘油三酯水平的影响

在13周龄时，动物们被剥夺食物过夜，然后在禁食状态下接受这些测试。所有值均为平均值±SEM (n = 4或5)p< 0.05;与Water组有显著差异，由单向方差分析确定，然后进行Scheffé的测试。

在本研究中，我们发现普通茶树品种和富含黄酮醇的茶树品种在NSY小鼠的葡萄糖稳态方面存在显著差异，并且茶黄酮醇可能对预防糖尿病有益。茶黄酮醇与糖尿病的关系有待进一步研究;例如，这些研究旨在获得饮用富含黄酮醇的茶后血浆中黄酮醇及其衍生物水平升高的直接证据，并研究黄酮醇改善2型糖尿病小鼠模型胰岛素敏感性的机制。

确认

在此，我们要向博士们表示衷心的感谢。NARO蔬菜和茶叶科学研究所的Atsushi Nesumi和Katsuyuki Yoshida提供了茶叶样本。

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