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摘要

设计了一种无血清培养基(MCDB153)，在添加两种蛋白质生长因子(胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)和表皮生长因子(EGF)的情况下支持正常人类角质形成细胞(NHK)的克隆生长。我们现在报道了新的克隆生长研究结果，显示三种新的非蛋白质生长因子增强了NHK的克隆生长。新生NHK细胞以500细胞/cm的速度被镀²在无血清的基础培养基中单独添加以下添加剂之一:二丁基环AMP (diBcAMP, 1 × 10⁴M)、氯化锂(10 mM)和前列腺素E1 (10 ug/ml)在仅添加IGF-1或IGF-1 + EGF的培养基中。所有培养皿10天后固定，用结晶紫染色(0.2%)拍照。与添加IGF-1 + EGF的对照培养皿相比，DiBcAMP联合IGF-1增强了克隆生长，表明DiBcAMP可以完全消除EGF这一必要的生长因子。同样，与添加IGF-1的对照相比，单独向SFM添加锂离子与IGF-1结合可以增强克隆生长。最后，在单独添加IGF-1、IGF-1 + EGF、甚至不添加任何蛋白质的培养皿中，与添加IGF-1 + EGF的对照培养皿相比，PGE1增强了NHK克隆生长。PGE1似乎消除了对EGF和IGF-1的需要。第二项研究检查了在6种关键氨基酸(his, met, phe, tryt, ileu和tyr)水平(3X)升高的情况下非蛋白因子的增强效应，这些氨基酸能够获得更高的克隆细胞密度。升高的氨基酸实际上抑制了锂离子对克隆生长的促进作用。相比之下，在添加了PGE1和IGF-1的SFM培养基中，相对于添加了EGF和IGF-1的对照培养皿中，升高的氨基酸表现出更强的克隆生长，表明PGE1和升高的氨基酸可能具有协同作用。这些结果为非蛋白质配体、营养因子和蛋白质生长因子刺激之间的复杂相互作用提供了新的见解。

关键字

3 '，5 ' -环磷酸腺苷，锂离子，前列腺素E1，无血清培养基，非蛋白生长因子，胰岛素样生长因子-1，表皮生长因子，正常人角质形成细胞

简介

正常表皮角质形成细胞的无血清培养成功已有报道[1-8]。NHK的无血清培养对两种蛋白因子表皮生长因子(EGF)和胰岛素(Ins)[9]有严格的要求。胰岛素可被胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)替代[10,11]。NHK的长期培养通常需要进一步补充牛垂体提取物(BPE)，但在早期传代培养中可以避免。消除EGF和胰岛素/IGF-1中的一个或两个将是一个重大的进步，因为它们是确定的SFM中最昂贵的成分，而且对于培养的自体表皮移植物(CEA)的生产成本是望而却步的。

我们研究了几种似乎可以替代EGF和或胰岛素的非蛋白制剂对NHK克隆生长的影响。其中包括锂离子，二丁基环磷酸腺苷(diBcAMP)和前列腺素E₁(PGE1)。以前的研究已经证明了在确定的基础营养介质中需要许多微量元素金属离子，这些元素金属离子包含在上述许多现代SFM成分中。在这里，我们报道了锂离子在无血清化学定义的培养基中刺激人类角质形成细胞的增殖。李锂离子(⁺)可以代替生物系统中的钠离子。它的原子半径更小，形成的离子键更强。锂影响在化学合成培养基[12]中培养的小鼠乳腺外植体的DNA和RNA合成和细胞增殖。我们还研究了二丁酰-环3 ' -5 ' -环磷酸腺苷(dB-cAMP)在无血清化学定义培养基中单独或与锂离子结合对正常人类角质形成细胞克隆生长的影响。cAMP通过cAMP依赖的PKA调节肌动蛋白组织和细胞运动[13]。cAMP不易穿过哺乳动物细胞的质膜。因此，当研究cAMP对培养细胞的作用时，通常使用膜溶性更强的衍生物，二丁醇环AMP (diBCAMP)。一项早期研究报道diBCAMP抑制表皮细胞分裂[14]。添加霍乱毒素，一种强效毒素，诱导细胞内cAMP的增加，实际上促进角化细胞生长[15]。虽然，霍乱毒素对人角化细胞生长在胎儿血清补充培养基[1]没有影响。 These disparate results may also reflect complex interactions and unpredictable consequences attributable to employing serum-containing culture media. cAMP is a necessary growth factor for the clonal growth of uroethelial cells cultures in SFM [16].

最后，我们研究了前列腺素E的作用₁(铂族元素₁)的无性系生长。其对表皮角质形成细胞增殖的影响尚不清楚。人类皮肤产生类二十烷类化合物，据报道可调节上皮细胞的生长和分化，但在炎性皮肤病[17]中不发挥核心作用。铂族元素₁是一种强力的血管扩张剂和抗血栓剂，注射它已广泛应用于皮肤溃疡和各种胶原蛋白疾病的循环障碍。PGE1对烧伤创面[18]有临床疗效。PGE1刺激结肠上皮细胞系中的氯离子分泌，这与环AMP水平[19]的增加有关。此外,铂族元素₁据报道，能增加三维培养的人环空细胞[20]中EGF的产生。羊催乳素(0.1微克/毫升)和PGE的组合₁支持早期传代人类乳腺上皮细胞在无血清化学定义的合成培养基中克隆生长，并已被包括在角质形成细胞和成纤维细胞[4]的选择性培养基中。

材料和方法

材料

所有化学品都购买自Sigma- Aldrich (St. Louis, MO)。培养皿来自康宁(Corning, NY)。MCDB153无血清基础营养培养基如前所述[11]制成新鲜培养基。

克隆生长试验/细胞培养

分离和培养一代和二代正常人新生儿正常人角质形成细胞(NHK细胞)的方法是先前使用的[9]。克隆生长试验按照前面描述的[9]进行。二次连续传代培养在重复的无菌一次性35mm中进行²500细胞/厘米的培养皿²在MCDB153 SFM基础培养基中单独添加以下添加剂:diBCAMP (1 × 10⁴M)、LiCl (10 mM)和PGE1(10µg/ml)分别添加或不添加胰岛素样生长因子(IGF-1, 5 ng/ ml)和表皮生长因子(EGF, 5 ~ 10 ng/ ml)。所有培养皿在10天后固定，用结晶紫染色(0.2%)并拍照以备分析。

结果

单加DiBcAMP和Li Cl对NHK生长的促进作用

图1展示了四种不同的克隆生长试验培养皿(A-D)的照片。单次添加diBcAMP (C)或氯化锂(D)对仅添加IGF-1并在克隆生长第10天后固定染色的SFM的影响，与同时添加EGF和IGF-1并在克隆生长第1天(A)和第10天(B)后固定染色的SFM相比。结果表明，dBcAMP和氯化锂在取代EGF时不仅具有类似EGF的活性，而且相对于EGF + IGF-1的组合，它们实际上促进了克隆生长。这些结果的一个重要意义是，用氯化锂或diBcAMP替代昂贵的EGF作为低成本的非蛋白生长因子的潜在好处。

图1所示。显示二丁基环磷酸腺苷(diBcAMP)和锂离子(Li⁺)克隆生长的正常人角质形成细胞。A)对照克隆生长试验培养皿:(左上)，标记IGF-1+EGF, d1(第一天)和(右上)，标记IGF-1+EGF, d10(第10天)。B)实验克隆生长试验培养皿:含有IGF-1 (5 ng/mL)的培养基中添加diBcAMP (0.1 mM)(左下)，标记为IGF-1 + diBcAMP;C)添加IGF-1 (0.1 mM)和Li的培养基⁺离子(右下角)。所有培养皿用戊二醛固定，用0.2%结晶紫染色。盘子被拍照(IX，放大)。

单次添加前列腺素E1对NHK克隆生长的促进作用

图2展示了5种不同的克隆生长试验培养皿的照片。在添加了EGF + IGF-1的对照SFM培养皿中，仅在生长1天后克隆生长就可以忽略不计(A)，而在10天后克隆生长要大得多(D)。的铂族元素₁在添加了EGF和IGF-1 (B)的SFM培养皿(10 D后进行固定和染色)中克隆生长明显强于对照培养皿(D)。实验培养皿(C)中添加了PGE1和IGF-1而不添加EGF。相对于对照培养皿(D)，它大大增强了克隆生长，这表明PGE1可以取代EGF作为必要的生长因子，并且比仅向已经添加了EGF和IGF-1的SFM中添加PGE1表现出更强的克隆生长。最后，我们在不添加任何蛋白质生长因子(E)的情况下测试了PGE1单独加入SFM的效果。SFM与EGF和IGF-1联合时，表现出与PGE1相同的克隆生长，这表明PGE1与EGF和IGF-1联合时的完全增强可能是由于PGE1单独。

图2。照片显示在存在或不存在表皮生长因子(EGF)的情况下，前列腺素E1 (PGE1)与IGF-1或胰岛素(Ins)联合对正常人角化细胞克隆生长的增强作用。A)对照培养皿:(左上)，标记EGF + IGF-1， (d1，第1天);(中下)，标记EGF + IGF - 1 (d10，第10天)。B)实验培养皿:(上中)，标记EGF + IGF-1 + PGE1, d10(第10天);(右上)，标记为IGF-1 + PGE1 (d10);右下标记PGE1 (d10)。所有盘子用5%戊二醛固定，用0.2%结晶紫染色。盘子被拍照(IX，放大)。

关键氨基酸水平升高对PGE1和Li的影响⁺离子诱导的克隆生长增强

在一项独立研究中，我们检测了MCDB153基础营养培养基中6种关键氨基酸(his、ileu met、phe、tryt和tyr)以正常浓度的3倍升高对氯化锂和PGE1作用的影响。图3(右图)显示，仅提高6种关键氨基酸(B)对复制SFM培养皿((a, C)添加氯化锂、EGF和IGF-1，相对于重复对照和含有1倍氨基酸水平的氯化锂培养皿(左图)的克隆生长有负面刺激作用。这可能表明李⁺离子被隔离在含有高水平氨基酸的介质中。

相比之下，当在EGF和IGF-1蛋白生长因子的存在下培养时，在添加了PGE1的培养基中，克隆生长显著增强，PGE1含有高于低水平氨基酸(1X)的6种关键氨基酸(右侧)。这一结果表明，PGE1的刺激作用的强度依赖于氨基酸水平升高的营养作用。

图3。克隆生长试验培养皿的照片显示，PGE1与EGF和胰岛素联合培养，在1X氨基酸水平(左图)和3X氨基酸水平(右图)的存在下，对正常人类角化细胞的克隆生长有增强作用。A)对照培养皿中添加I+/E+;b)实验性的，辅以I+/E+/PGE1。所有培养皿用5%戊二醛固定，用0.2%结晶紫染色。盘子被拍照(IX，放大)。

讨论

一种具有成本效益的无血清培养人表皮角质形成细胞是至关重要的在体外通过细胞疗法形成克隆人类组织，并最终实现再生医学方法的成功，以取代患病、受伤、“磨损/老化”和丢失的宿主组织。这可以通过从完整的培养培养基中去除EGF或IGF-1来实现。在这里，我们描述了三种不同的非蛋白促生长因子。每一种都是添加剂，可以添加到化学定义的无血清培养基中，适合快速生长的正常人类角质形成细胞的生长和增殖。锂离子作为盐、氯化锂、很容易溶于水相的介质,可以添加无菌1:10 0倍稀释和终端组件从1米氯化锂集中储备溶液10毫米的最终浓度。同样的,一个100毫米的股票解dibutryl-cAMP溶解在酒精可以稀释1:1000无菌收益率最终浓度为0.1毫米,作为终端组件添加到最终的基础营养培养基。最后，1 mg/mL前列腺素E原液₁可无菌稀释1:1000，在培养基中得到10µg/mL的终浓度作为培养基的终端成分。

图4。克隆生长试验培养皿的照片显示了锂离子(Li⁺)与EGF和IGF-1结合，在1X氨基酸存在下培养(左图)，在3X氨基酸存在下培养(右图)，对正常人角质形成细胞的克隆生长没有增强。A)对照组培养皿中添加胰岛素⁺)和EGF (E⁺);B)实验培养皿中添加I⁺和E⁺加上PGE1。所有培养皿用5%戊二醛固定，用0.2%结晶紫染色。盘子被拍照(IX，放大)。

Lithiun离子资格本身作为一个独立的增长因素。MCDB153作为SFM的例子是几种SFM培养基组合之一，可以通过添加一种或多种命名的非蛋白生长因子的组合来改善SFM培养基的组成，这些非蛋白生长因子可用于设计角化细胞的商用无血清培养基。早期的研究报道了碳酸锂在体外正常人体皮肤外植体[21]中刺激角质形成细胞的增殖。该效应发生在添加10%胎牛血清的培养基中，这引起了对血清混淆效应的怀疑，角化细胞增殖的证据是间接显微镜观察细胞拥挤。在另一个组织中，人乳腺上皮细胞的无血清生长由垂体提取物[22]支持。不幸的是，这种添加违背了只有明确的生长促进成分的目的。其他非人类细胞研究表明，锂可以干扰黏菌Dictyostelium discoideum[23]的形态运动和基因表达，以及海胆[24]和两栖动物胚胎[25]的胃形成等胚胎学过程。锂离子干扰细胞运动的一个可能机制是通过稳定细胞骨架F-actin纤维[26,27]。与细胞生长影响更相关的是李的一份报告⁺在浓度大于4 mM时，锂离子会引起哺乳动物细胞系[28]的形态改变。锂离子的作用机制尚不清楚，但它可以通过消耗中间的肌醇三磷酸来影响细胞内的磷酸肌醇信号通路(见图5)。此外，当添加到纤毛虫ble法利玛的培养基中时，它对该细胞的光反应[29]有抑制作用。将15 mM的锂离子添加到原生寄生虫Herpetomonas的培养基中，可以刺激其生长[30]。锂离子浓度为20 mM时，可抑制大鼠肝脏中葡萄糖的合成。与本报告最相关的是，2-20 mM浓度的锂离子对在化学合成培养基中培养的小鼠乳腺外植体的胰岛素诱导α-氨基丁酸的摄取、DNA和RNA的合成以及细胞增殖具有刺激作用。

图5。锂离子(Li+)、二丁酯3 ' -5 '环磷酸腺苷(dBcAMP)和前列腺素E1 (PGE1)激活细胞增殖的作用模式的假设模型。Symbola:等离子体-

环AMP是由ATP由腺苷环化酶合成的，腺苷环化酶是一种质膜酶，通常由激素配体占用特定的细胞表面激素受体，如配体胰岛素激活。cAMP是细胞内第二信使，参与信号级联，通过cAMP依赖蛋白激酶(PKA)作用，磷酸化核DNA结合蛋白，从而打开选定的DNA序列进行基因表达。cAMP还激活钙通道，提供了一个小途径，cAMP通过这个途径导致生长激素的释放。在非人类系统中，cAMP是黏液霉菌细胞的化学引诱剂。与锂离子一样，cAMP通过依赖于cAMP的PKA调节肌动蛋白的组织和细胞运动[13]。

我们还报告了dBcAMP增强角质形成细胞增殖的基础是克隆生长10天后菌落数量和大小的急剧增加。早期的研究人员发现，SFM[32]在批次培养的7天内，数量增加了不到1倍。与这些发现相反，另一位作者发现dBcAMP对角化细胞增殖[33]没有直接影响。他们的5-Brdur DNA合成检测方法可能遗漏了细胞增殖中的一个小刺激。

在此之前，PGE1和PGI及其类似物被证明在含有成纤维细胞释放到培养基中的细胞因子的条件培养基中处理时会刺激角化细胞增殖[34,35]。相比之下，我们发现在IGF-1存在和完全不添加任何蛋白质生长因子的情况下，PGE1直接刺激无血清克隆生长。

综上所述，我们提出了(见图5)锂离子、diBcAMP和PGE1在冲击影响细胞分裂周期的基因表达时作用模式的假设模型。我们认为非蛋白质生长因子是第一信使或细胞外物质，包括蛋白质生长因子。由于第一信使不能物理地穿过磷脂双层细胞膜而直接在细胞内引发变化，因此需要第二信号转导机制将第一信使转导为第二信使，从而使细胞外信号在细胞内传播并引发增殖。由锂离子触发的第二信使是已知的磷酸肌醇信号通路(A)的一部分，该通路激活磷酸肌醇激酶，产生三种第二信使，肌醇三磷酸，二酰基甘油和钙。DBcAMP和PGE1通过激活cAMP第二信使通路起作用(B和C)。cAMP第二信使信号级联涉及下游的多环激酶，这些激酶与丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)和促进细胞增殖的转录因子如MYC相连(见图5 (A-C))。

确认

这项工作得到了美国国家卫生研究院计划项目# PO1-CA340968的资助，资助对象是阿拉巴马州伯明翰南方研究所斯隆-凯特林部门生物化学系。

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