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摘要

骨形态发生蛋白4 (BMP4)是转化生长因子- β超家族的一员，与肝细胞癌(HCC)的发病机制有关。我们利用人类HCC组织、邻近的非肿瘤组织和三种HCC细胞系(Huh-7、HepG2和PLC/PRF/5)评估BMP4和BMP I型(BMPR1A和BMPR1B)和II型(BMPR2)受体mRNA的表达。此外，我们进一步研究了Huh-7细胞，以记录毒素诱导损伤对BMP4 mRNA和蛋白表达的影响。测定外源性BMP4对Huh-7 Smad 1和ERK 1/2信号通路、增殖和分化的影响。本研究结果显示，在大多数HCC和恶性肝细胞细胞系中，BMP4 mRNA表达上调，而BMP I型和II型受体mRNA表达变化较大。d -半乳糖胺诱导Huh-7细胞损伤导致BMP4 mRNA和蛋白表达显著上调。最后，外源性BMP4诱导Smad 1和ERK 1/2磷酸化而不改变细胞增殖或分化。这些结果表明，BMP4参与了HCC的发病机制，但其机制并非调控恶性肝细胞增殖或分化。

关键字

骨形态发生蛋白4，肝细胞癌，d -半乳糖胺，基因调控

简介

肝细胞癌(HCC)是当今世界第五大常见癌症，也是癌症相关死亡的第三大常见原因。不幸的是，肝移植和手术切除等潜在的治愈性治疗只能提供给少数HCC患者。然而，只有当我们对HCC的致癌机理有了更全面的了解，才能发现更有效的治疗干预措施。

骨形态发生蛋白4 (Bone morphogenetic protein 4, BMP4)最初在20世纪60年代被发现，属于转化生长因子β (tgf - β)超家族的成员。目前已发现15种bmp和4种相关的生长分化因子(gdf)具有相似的结构[1,2]。生物活性bmp是30-38 kDa的同源二聚体，在细胞[3]中合成为含有400-525个氨基酸的前肽。bmp的二硫连接成熟二聚体将与膜受体相关联，这些膜受体已被确定为I型受体- BMPR1A(或激活素受体样激酶3 - ALK3)和BMPR1B(或ALK6)，以及II型受体- BMPRII[1]。BMP二聚体与其II型受体结合可激活I型受体。然后由每种类型的两个受体形成异四聚体。受体的接近性允许II型受体在GS结构域磷酸化I型受体。接下来是Smads和/或丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)的磷酸化。磷酸化的Smads和MAPKs随后诱导细胞内事件，导致调控靶基因转录[3]。BMP4的生物学活性涉及细胞增殖、分化、凋亡和一般器官发生。 Recently studies reveal that BMP4 may induce migration and invasion of colon [4,5], ovarian [6] and pancreatic cancer cells [7]. In addition, inhibition of BMP4 in hepatocellular carcinoma and melanoma cells resulted in reduced migration and invasion [8,9]. Moreover, BMP4 mRNA and protein were found increased in HCC tumor tissues compared to adjacent cirrhotic tissues and may be related to poor prognosis in patients with HCC [10].

然而，BMP4在HCC中的功能和作用尚不清楚。因此，在本研究中，我们记录了BMP4 mRNA在HCC组织和细胞系中的表达。此外，我们还证实了BMP4在HCC细胞系(Huh-7细胞)中的表达调控以及BMP4对Huh-7细胞内信号转导、增殖和分化的影响。

材料与方法

材料

HCC细胞株(Huh-7、HepG2和PLC/PRF/5细胞)购自ATCC。所有细胞培养试剂(Dulbecco 's modified Eagle培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶- edta)和TRIzol试剂均购自Invitrogen公司(Burlington, ON)。聚合酶链式反应(PCR)引物采用Oligo 7计算机软件设计，Invitrogen公司合成。驴抗兔IgG、兔抗小鼠IgG和增强化学发光(ECL) Western blotting试剂盒购自GE Health Science (Baie d’urfe, Quebec)。iScript™cDNA Synthesis Kit和iQ™SYBR®Green Supermix购自Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd. (Mississauga, Ontario)。d -半乳糖胺(D-gal)和其他化学品购自Sigma-Aldrich Co. (Oakville ON)。

人肝细胞癌组织样本

从人肝细胞癌HCC和邻近非肿瘤组织中获得的总RNA来自我们之前的研究[11]。这项研究得到了曼尼托巴大学人类和动物实验联合伦理委员会的批准。

人肝细胞癌细胞及细胞培养

所有肝癌细胞在37ºC、5% CO2和95%空气的湿环境中，在添加110 mg/L丙酮酸钠、10%胎牛血清(FBS)、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM中培养。Huh-7细胞在10 cm培养皿中传代培养进行实验。治疗前一天，取出培养基，在上述培养基中添加不同浓度的D-gal，按指示进行不同时间间隔的培养。

RNA提取及实时逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)性能研究

组织和/或细胞总RNA按照制造商手册用TRIzol试剂分离。第一条cDNA由iScript™cDNA Synthesis Kit合成，如前所述[12］．PCR使用iQ™SYBR®Green Supermix进行，寡核苷酸由Invitrogen合成。本研究的具体引物如表1所示，使用Oligo 7软件从GenBank中提取相应的序列进行设计。PCR扩增通过30个循环进行，包括:94ºC变性1分钟，不同退火温度30秒，72°C延伸2分钟，然后使用MiniOpticon™实时PCR检测系统(Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd.)在72ºC进行最终延伸8分钟。安大略省米西索加)。PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳分析。

细胞蛋白提取及Western blot分析

细胞蛋白提取液(1 X=50 mM Tris pH8.0, 0.5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.5% NP-40和1X蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma-Aldrich, Oakville ON)分离细胞蛋白。BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度。然后从不同样品中提取20微克细胞蛋白与4X凝胶加载缓冲液混合，在还原条件下用12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(sds -聚丙烯酰胺)凝胶分离，转移到Nitroplus-2000膜上(Micron Separations Inc.)。位于马)。通过在含有5%脱脂牛奶的1X tris缓冲盐水(TBS)中室温孵育1小时，可以阻断非特异性抗体的结合。膜分别在含0.1% Tween-20和2%脱脂牛奶的1X TBS中，用针对不同蛋白的抗体- BMP4单克隆抗体(1:500稀释)、Smad1单克隆抗体(1:500稀释)、磷酸化-Smad1多克隆抗体(1:70稀释)、ERK1/2多克隆抗体(1:80稀释)、磷酸化-ERK1/2多克隆抗体(1:400稀释)和b-actin单克隆抗体(1:60稀释)在4ºC下孵育过夜。洗净后，分别与驴抗兔IgG或绵羊抗小鼠IgG按1:1000稀释室温孵育1小时。根据制造商的说明，使用增强型化学发光试剂盒来观察条带。

细胞增殖试验

细胞增殖用细胞增殖试剂WST-1测定，如前所述[13]。将200µl培养基中的Huh-7细胞(2x103)接种到96孔板中。孵育24小时后，将培养基换成100µl含有不同浓度D-gal或BMP4或D-gal和BMP4组合的新鲜培养基。媒体和药物每隔一天更换一次。治疗1、3、6、9天后观察细胞增殖。处理结束时，井中加入WST-1试剂10 μl，孵育3 h。使用Synergy HT微板阅读器(BioTek Instruments)以420nm作为检测波长/650nm作为WST-1测定的参考波长，测量处理样品对空白对照的吸收能力。每个处理组有8个孔，每个实验重复3次。

统计分析

为了分析对照组和治疗组之间的差异，我们使用StatView (version 5.0)软件(SAS Institute Inc.)进行ANOVA和Fisher's PLSD检验作为事后检验。卡里,NC)。p值< 0.05为差异有统计学意义。

结果

虽然BMP4在HCC中的表达已被报道，但与BMP4相互作用的蛋白，如其受体，尚未被描述。我们之前在其他项目中对人类HCC肿瘤的研究允许我们同时研究BMP4、BMPR1A、BMPR1B和bmpr2mrna的表达。BMP4及其受体在来自12例HCC样本的5例HCC及邻近非肿瘤组织中的表达谱见图1。BMP4、BMPR1A、BMPR1B、BMPRII在HCC中均有表达。与邻近非肿瘤组织相比，BMP4 mRNA和BMPR1A在HCC肿瘤组织中的表达均显著升高。BMPRII mRNA水平也升高，但差异无统计学意义。BMPR1B mRNA在肿瘤与邻近非肿瘤组织间无明显变化。

图1所示。HCC组织与邻近非肿瘤组织中BMP4和BMPRs mRNA的比较在我们之前的研究中，我们收集了12例人HCC，从HCC组织和邻近的非肿瘤组织中提取总RNA，用RT-PCR方法检测BMP4 mRNA的表达。图A显示5个成对样本，图b显示12个成对样本中BMP4的丰度。数据以均数±SE表示，*表示HCC组织与邻近非肿瘤组织有显著差异。

虽然BMP4在HCC肿瘤组织中较邻近非肿瘤组织表达增加，但BMP4在HCC中的作用尚待研究。由于恶性肝细胞经常暴露于缺血、冷热物理消融和/或化疗，我们设计了额外的实验，其中在Huh-7细胞中记录了毒素诱导损伤对BMP4表达的影响。如图2所示，暴露于4.0 mM的肝毒素- d -半乳糖胺后，BMP4 mRNA表达的增加在6小时达到峰值，然后在24小时恢复到基线水平。BMP4蛋白表达在12小时时显著增加，并持续增加至48小时实验结束。这种对BMP4 mRNA和蛋白表达的影响也依赖于浓度，暴露于0.4 mM d -半乳糖胺后，没有观察到明显的影响，但暴露于4.0 mM d -半乳糖胺时，BMP4 mRNA和蛋白表达的影响显著增加，而暴露于8.0 mM毒素时，影响最大(图3)。

图2。D-gal诱导骨形态发生蛋白4 (BMP4)在Huh-7细胞中随时间的表达。图A显示D-gal处理后BMP4 mRNA显著增加，图B显示BMP4蛋白丰度。上面的面板显示了BMP4 mRNA和蛋白的代表性凝胶。底部面板显示这些波段的直方图。数据以四个不同实验的平均值±SEM表示。*表示D-gal处理细胞与未处理细胞之间的差异有统计学意义。

图3。D-gal诱导骨形态发生蛋白4 (BMP4)在Huh-7细胞中的表达与D-gal浓度的关系。图A显示不同浓度处理后BMP4 mRNA显著升高，图B显示不同浓度处理后BMP4蛋白水平显著升高。上面的面板显示了BMP4 mRNA和蛋白的代表性凝胶。底部面板显示这些波段的直方图。4个不同实验的数据以均数±SEM表示，*表示处理细胞与未处理细胞之间的差异有统计学意义。

为了确定BMP4表达的增加是否可能与细胞信号通路的改变有关，我们记录了外源性BMP4对两个关键BMP信号通路的影响;Huh-7细胞中的Smad 1和ERK 1/2。如图4所示，BMP4处理导致Smad 1磷酸化在0.5和1小时显著增加，而ERK 1/2磷酸化在所有三个时间点(0.5、1和2小时)均有增加。

图4。骨形态发生蛋白4 (BMP4)处理Huh-7细胞后诱导Smad 1和ERK 1/2磷酸化。用针对相应蛋白的抗体进行Western blot分析，记录了Smad1、磷酸化Smad1、ERK1/2和磷酸化ERK1/2的表达。左图显示代表性的Western blot凝胶，右图显示条带密度直方图。数据以四个不同实验的平均值±SEM表示。*表示治疗到基线(0小时)的不同时间间隔之间有统计学差异。

据报道，BMP4可改变恶性细胞的增殖活性。据报道，它还能增强细胞分化。在我们的研究中，d -半乳糖胺以剂量依赖的方式显著抑制Huh-7细胞增殖(图5A)。然而，不同浓度的BMP4单独作用对Huh-7细胞增殖无影响(图5B)， BMP4或BMP4抗体联合作用不改变d -半乳糖胺对Huh-7细胞增殖的抑制作用(图5C)。从白蛋白(肝细胞分化标志物)和CK-19(胆管细胞分化标志物)的表达来看，D-gal对细胞分化无影响(数据未显示)。

图5。骨形态发生蛋白4 (BMP4)对Huh-7细胞增殖的调控。A图为D-gal对Huh-7细胞增殖的影响。图B显示BMP4对Huh-7细胞增殖的调控。C图为D-gal (4 mM)、BMP4 (50 ng/ml)、BMP4抗体(400 ng/ml)及D-gal联合BMP4对Huh-7细胞增殖的影响。数据以6个不同井和2个不同实验的平均值±SEM表示。*表示D-gal处理细胞与未处理细胞的差异有统计学意义。

讨论

本研究结果证实了先前的报道，BMP4在大多数HCC组织和恶性肝细胞细胞系中表达增加或丰富。与之前的报道一致的是BMP受体表达的可变性，在各种HCC组织和恶性肝细胞细胞系中，BMP I型和II型受体表达增加、减少或不变。该结果还扩展了我们对BMP4调控的理解，证明除了缺氧外，毒素诱导的损伤也会上调BMP4的表达。最后，尽管BMP信号通路显著增加，但我们无法证实先前关于BMP4改变恶性细胞增殖和/或分化的报道。

关于人类HCC中BMP4和BMP受体表达的报道很少。在迄今为止发表的三份此类报告中的第一份中，Maegdefrau等．描述了39对来自HCC患者的组织标本中BMP4的表达，发现62%的组织标本中BMP4的表达上调[8］．此后不久，郭等．120/156 (77%) HCC组织中BMP4蛋白表达高于19/156(12%)相邻非肿瘤组织[10］．最近，Chiuet al。在71对HCC组织中，60%的实时PCR结果显示BMP4 mRNA表达增加[14］．在同一项研究中，Chiu发现，在30/71(43%)个标本中，BMPR1A mRNA表达上调，而所有71个标本中BMPR1B表达下调(他们的研究中未报道BMPR2表达)。虽然本研究中成对的HCC标本数量要少得多(N=15)，但我们的结果与上述结果一致，大多数HCC标本中BMP4 mRNA表达增加，而BMP I型和II型受体表达变化较大。鉴于目前已知的BMP4调控，在未来研究中确定BMP4和/或BMP4受体表达之前，记录与样本采集相关的条件(如术中缺血、近期化疗、消融等)将是很重要的。

在唯一报道BMP4在恶性肝细胞细胞系中表达的研究中，Maegdefrau等人描述了相对于原代人肝细胞[8]，Hep3B、HepG2和PLC细胞中BMP4 mRNA表达上调4-5倍。由于我们在本研究中没有培养原代人肝细胞，因此无法进行这样的比较。然而，我们确实在Huh-7细胞和PLC/PRF/5细胞中发现了大量的BMP4表达。为什么在HepG2细胞中表达如此有限尚不清楚。同样，鉴于目前已知的BMP4表达，培养条件、细胞传代数量、细胞活力等的差异必须被认为是这些不一致发现的可能解释。

d -半乳糖胺是一种强效的肝毒素，通过引起肝脏中udp -半乳糖胺衍生物的积累而诱导肝细胞损伤[15]。这些进而导致肝脏UTP的消耗和大分子生物合成的停止，如RNA、蛋白质、糖蛋白、糖原等。因此，细胞损伤的许多机制都是由这种毒素代表的。结合先前的数据表明缺血导致恶性肝细胞中BMP4表达上调，我们的d -半乳糖胺实验结果表明，无论损伤的性质如何，BMP4表达上调。我们很容易推测，这一发现可以解释缺血性损伤(如经动脉化疗栓塞)和/或全身化疗通过激活BMP4激活抗化疗的癌干/祖细胞或肿瘤组织内的血管生成而导致肿瘤复发的高发生率。

细胞内信号分子在细胞因子调控细胞增殖和分化中起着重要作用。细胞内有两条信号通路介导BMP4信号转导——Smad 1和ERK1/2。bmp4激活的Smad 1易位进入细胞核，招募共激活子cAMP响应元件结合蛋白(CREB)和p300的转录，随后诱导肝干细胞[16]中肝分化基因的表达。本研究结果表明，BMP4在Huh-7细胞中诱导了Smad 1的显著磷酸化。BMP4的另一个胞内信号通路是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路。该途径包括ERK1/2，它介导细胞增殖和分化[17]。fgf激活的ERK1/2信号通路在胚胎内胚层细胞[18]中启动肝脏基因表达相关分化。在本研究中，我们发现除了Smad 1的激活外，d -半乳糖胺诱导的Huh-7细胞损伤也激活了ERK1/2信号通路。

尽管诱导了这些信号通路，我们没有观察到外源性BMP4治疗后肝细胞增殖或分化的改变。对增殖的无影响与Maegdefrau等人[8]报道的结果一致，但与Chiu等人[14]的结果相反。然而，应该指出的是，在后一项研究中，增殖活性被描述为增加，但增加是有限的，并应用了统计分析。在细胞分化方面，本研究中BMP4不改变白蛋白和CA19 mRNA的表达，分别反映了肝细胞和胆管细胞的分化。也许与这一发现最相关的是使用Huh-7细胞，这种细胞被认为是分化良好的，因此不太可能进行进一步分化，而不是去分化。

综上所述，本研究结果支持BMP4参与HCC发病的假设。然而，BMP4所起的确切作用尚不清楚。考虑到尽管BMP4的表达和信号通路显著增加，但恶性肝细胞增殖和分化仍未改变，未来的研究应关注BMP4对癌干/祖细胞或血管生成等非肝细胞肿瘤特征的影响。

确认

本研究由中国自然科学与工程研究委员会授予龚跃文博士(RGPIN/355304-2010)和中国国家留学基金委授予王晓彤女士研究生奖学金资助。

参考文献

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1. 王志刚，王志刚，王志刚(1996)骨形态发生蛋白受体。骨19日:569 - 574。(Crossref］
2. aldingg, Herr G, Küsswetter W, Reis HJ, Thielemann FW，等。(1991)骨形态发生蛋白的研究进展。Int .15: 169 - 177。(Crossref］
3. Wozney JM(1998)骨形态发生蛋白家族:胚胎和成人的多功能细胞调节。欧洲口腔科学106: 160 - 166。(Crossref］
4. 邓海红，杨伟，董华，等。(2007)骨形态发生蛋白-4在结肠腺癌中过表达，促进HCT116细胞迁移和侵袭。Exp Cell Res313: 1033 - 1044。(Crossref］
5. 邓华，杨伟林，杨伟林(2009)骨形态发生蛋白4的过表达增强了smad4缺失的人结直肠癌细胞的侵袭性。癌症列托人281: 220 - 231。(Crossref］
6. Thériault BL, Shepherd TG, Mujoomdar ML, Nachtigal MW (2007) BMP4诱导人卵巢癌细胞EMT和Rho GTPase激活。致癌作用28日:1153 - 1162。(Crossref］
7. Gordon KJ, Kirkbride KC, How T, Blobe GC(2009)骨形态发生蛋白通过涉及基质金属蛋白酶-2的smad1依赖机制诱导胰腺癌细胞侵袭。致癌作用30: 238 - 248。(Crossref］
8. Maegdefrau U, Amann T, Winklmeier A, Braig S, Schubert T，等(2009)骨形态发生蛋白4在肝细胞癌中缺氧诱导并促进肿瘤进展。中草药218: 520 - 529。(Crossref］
9. Rothhammer T, Poser I, Soncin F, Bataille F, Moser M, et al.(2005)骨形态发生蛋白在恶性黑色素瘤中过表达并促进细胞侵袭和迁移。癌症Res65: 448 - 456。(Crossref］
10. 郭欣，熊玲，邹玲，赵娟(2012)骨形态发生蛋白4上调与肝细胞癌患者预后不良有关。Pathol Oncol Res18: 635 - 640。(Crossref］
11. 张敏，龚玉玲，张晓霞，等。(2007)人肝细胞癌中肝细胞膜电位差降低与GABAA-beta3表达的关系。肝脏病学45: 735 - 745。(Crossref］
12. 沈华，黄刚，张敏，蔡平，等。(2003)转化生长因子β - 1下调大鼠肝星状细胞Smad1基因表达。是J Physiol胃肠测试肝脏物理285:G539-546。(Crossref］
13. 沈华，黄国军，龚玉文(2003)转化生长因子β和骨形态发生蛋白对大鼠肝星状细胞增殖和转分化的影响。世界肠胃醇9: 784 - 787。(Crossref］
14. 赵春春，郭桂奎，郭丽丽，李国栋，程克华(2012)骨形态发生蛋白4激活MEK/ERK信号通路促进肝癌细胞增殖和迁移。Mol Cancer Res10: 415 - 427。(Crossref］
15. 李志强，李志强，李志强(1998)D-半乳糖胺诱导实验性肝炎。Exp Mol Pathol9: 279 - 290。(Crossref］
16. Suzuki A, Raya A, Kawakami Y, Morita M, Matsui T，等(2006)Nanog与Smad1结合并阻断骨形态发生蛋白诱导的胚胎干细胞分化。美国国立自然科学研究院103: 10294 - 10299。(Crossref］
17. Kim J, Adam RM, Freeman MR (2002) Erk丝裂原激活蛋白激酶通路的激活刺激LNCaP细胞的神经内分泌分化，独立于细胞周期退出和STAT3磷酸化。癌症研究62: 1549 - 1454。(Crossref］
18. 张志刚，王志刚，王志刚，等。(2006)胚胎内胚层细胞中FGF基因诱导的研究进展。Dev细胞11: 339 - 348。(Crossref］