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摘要

灌注心脏的研究表明，流量敏感的g蛋白偶联受体是凝集性的，这表明流量通过调节内皮表层寡糖和凝集性跨膜g蛋白偶联受体之间的相互作用发挥作用。为了验证这一假设，豚鼠颈动脉以11或16 ml/min的流速灌注Krebs-Henseleit。利用血流诱导的缓激肽浓度-血管响应曲线的变化来确定血流对刺激缓激肽受体引起的收缩的影响。流动对缓激肽受体的影响在四个独立的组中进行研究;1组和2组(对照组)内皮表面层糖苷类成分未发生改变，3组灌注了一种不可逆地与内皮表面层结合的寡糖聚合物，4组内皮表面层肝素被水解。结果表明，当血流从11 ~ 16 ml/min增加时，缓激肽的血管反应曲线向上和向左移动。内皮表层低聚糖聚合物结合和肝素去除也得到了类似的结果，但流量从11到16毫升/分钟没有影响。因此，卵磷脂缓激肽受体的流量依赖取决于它与低聚糖环境和肝素基团相互作用的能力。

关键字

内皮，剪切应力，糖萼，g蛋白偶联受体，机械感受器，凝集素，低聚糖

简介

内皮细胞将血流转化为生化反应的分子和物理机制尚不明确[1-5]，因为直接受血流影响的转导分子，即“机制传感器”(mechanosensors)是未知的。流量传感特性可能存在于管腔内皮表面;由细胞膜和由流动作用的糖萼组成[6-13]。我们已经证明，流动诱导反应需要内皮表层低聚糖和低聚糖识别蛋白、凝集素，因为a)内源性低聚糖的特定酶解或它们与外源性凝集素的结合完全改变了流动诱导反应，b)不同外源性低聚糖与内皮表面凝集素的结合改变了流动的作用[8,11,12]。

我们在心脏方面的大量工作已经证实冠状动脉血流调节多种心脏和血管功能，而这些流量感知效应需要各种内皮表面特异性低聚糖和凝集素的存在，其中有几种g蛋白偶联受体[12,14]。有趣的是，单个内皮表面糖和凝集素在血流诱导反应中的作用具有功能偏向性;这种复杂性使得识别每个响应的精确“机械传感器”变得困难[6,8,10-13,15]。相比之下，在g蛋白偶联受体的情况下，其特异性激动剂引发的反应将其识别为起源结构，激动剂-传感器[1,3,4,14]。如果这种激动剂-传感器诱导的反应是由流量调节的，这就意味着这种g蛋白偶联受体也是一种流量传感器，并且由于是卵磷脂的，这种流量调节反应将对内皮表层低聚糖组成的特定变化产生反应，这表明低聚糖环境调节g蛋白偶联受体的流量敏感性。

冠状动脉内皮-心脏细胞系统是一个在活的有机体内复杂的网络与不同的实质细胞群。显然，需要一种更简单的模型，可以直接访问流量和细胞表面，例如以可控流量灌注的孤立血管[7,8]。在本研究中，在豚鼠颈动脉中，血流对缓激肽B2受体的影响;它被[1]直接激活，通过血管活性缓激肽效应的改变来解决，而血管活性缓激肽效应也在寡糖聚合物与内皮表层的不可逆结合或肝素基团的酶去除时发生改变。

在目前的研究中，我们发现血管活性缓激肽效应通过增加血管流量而增强，这取决于内皮表层寡糖的组成。

方法

所有程序都符合照顾和使用动物的国际指导原则，所有协议都得到了大学委员会关于使用动物进行实验的批准。

离体灌注豚鼠颈动脉

选择离体血管制剂是因为其解剖模型简单，常用于研究内皮细胞与相邻平滑肌细胞之间的功能相互作用[16-25]。在我们的研究中，我们选择了内径约0.5 mm，长度1.5±0.5 cm，可控制流量灌注的离体豚鼠颈动脉。

Dunkin Hartley豚鼠被麻醉。做一个颈前纵向外科切口，暴露每根颈总动脉，清除附着组织，全部解剖，切除并放置在含氧Krebs-Henseleit缓冲液的培养皿中。随后，在每根颈动脉中分别插入一根导管，一根在近解剖端，另一根在远解剖端，并确定两根导管之间的血管长度(动脉长度)。远端插管用于在出口形成恒定的流动阻力。随后，近端解剖端的插管连接到含有Krebs-Henseleit (95% O₂， 5% co₂37℃时pH值为7.4)，将动脉置于37℃的封闭湿润气氛室中，并持续监测灌注压力。在实验测量之前，流量保持在16ml /min，平衡周期为20分钟。之后，应用各种实验操作。

含三种不同单糖的低聚糖聚合物的合成n -乙酰氨基葡萄糖、甘露糖和半乳糖及其作为凝集剂探针的性质

可溶性低聚糖聚合物的合成:采用了我们实验室建立良好的程序[8,12,14,16,26,27]。简单地说，葡萄糖聚合物，70 kDa葡聚糖，溶解在NaCO中_3.(0.5M, pH 11)，与足够的二乙烯基砜(DVS)混合，因此每个葡萄糖分子中的三个-OH基团都与每个DVS中的两个乙烯基中的一个反应，每个DVS分子中留下一个自由乙烯基。随后，在化学计量中加入等量的甘露糖或半乳糖或n -乙酰氨基葡萄糖后，游离乙烯基与甘露糖或半乳糖或n -乙酰氨基葡萄糖的一个羟基发生共价反应，合成了分子量为460 kDa的可溶性低聚糖聚合物。该聚合物还可以用异硫氰酸荧光素(FITC)标记。作为阴性对照，不添加糖进行结合，而是用大量乙醇胺代替。阴性对照聚合物没有生理作用，不与内皮表面层结合[8,12,16,26,28]。

不溶性低聚糖高分子亲和树脂的合成：一旦合成了可溶性低聚糖聚合物，用NaCO将溶液pH提高到11_3.产生不溶性颗粒，这些颗粒被用来填充亲和色谱柱。利用市售植物凝集素，确定了色谱柱保留凝集素的能力和特异性。

管腔内皮膜蛋白的分离及游离管腔内皮膜蛋白的分离

管腔内皮膜蛋白组分的分离:在之前的四篇论文中，由于不同小组开发和改进的方法[8,12,14,26,29,30]，我们已经从冠状动脉腔内皮表面膜和糖萼中可靠地分离出了整个蛋白质部分。该过程包括用阳离子胶体二氧化硅颗粒(直径20- 50nm)包裹管腔内皮膜蛋白，这是由于与糖萼阴离子蛋白有很强的电结合，并用阴离子聚合物聚合管腔内皮膜蛋白结合的二氧化硅。阴离子聚合物交联二氧化硅粒子并中和其所有的自由正电荷。然后，组织均质，然后密度梯度离心和蛋白质分离从二氧化硅产生管腔内皮膜蛋白分数。

卵泡腔内皮膜蛋白组分的分离:用PBS平衡的亲和树脂低聚糖聚合物柱上装载管腔内皮膜蛋白片段，用PBS洗涤，结合的凝集素用三种糖各200mm的混合物洗脱。

乳酸膜蛋白的二维十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE):在pH梯度为3-10的条件下，将凝集管腔内皮膜蛋白加载在11 cm长的条状细胞上。聚焦采用等电聚焦系统和保持电压模式。在聚丙烯酰胺凝胶中按照标准程序进行二维SDS-PAGE，凝胶固定过夜，银染色，显像，并通过其坐标，分子量和等电点对一些蛋白质进行鉴定。

部分蛋白质的免疫斑点杂交和Western Blot检测结果:遵循了明确规定的程序。对于点印迹，负载在硝化纤维素膜上的蛋白质与一抗孵育，与过氧化物酶偶联二抗体反应，用化学发光试剂显影，并在柯达相纸上显示。对于一些蛋白质，这些结果通过Western blot分析得到了证实。

五种不同实验条件下两种不同流量缓激肽浓度-响应曲线

血管内给药激素导致与内皮表层受体的特异性结合，导致作用于实质细胞的内皮信使的化学计量释放[19-25,31-35，]。血管内缓激肽通过激活内皮表层[36]中的缓激肽B2受体而单独和选择性地起作用。尽管缓激肽引起的血管舒张经常被报道，但在豚鼠颈动脉和其他血管中，其反应是受体介导的收缩[19-25]。这种血管收缩反应被Hoe 140，一种特殊的缓激肽B2受体拮抗剂(未显示)[37]阻断。在该制剂中，苯肾上腺素诱导血管收缩，乙酰胆碱产生血管舒张，然而，没有对这些激动剂进行详细的研究。

选择慢激肽丸剂注射(50 μ l容积，0.5秒持续时间)作为一种短时间激活慢激肽受体的方法，以最大限度地减少因过敏反应引起的反应衰减的可能性。该方法允许在同一制剂中重复给药，以便在不同的实验条件下比较同一颈动脉的剂量-反应效应。将高浓度缓激肽原液Krebs-Henseleit溶液作为一个丸注入(50 μ l体积，0.5秒持续时间)，通过稀释估计丸峰值时的浓度。最终测试的缓激肽浓度为;0.05、0.2、0.8、3.5 μ M。在所有实验中，比较了两种流量对缓激肽浓度-血管响应曲线的影响;分别测定了11 ml/min和16 ml/min两种流速下的血管响应曲线。

组1

缓激肽在两种流量下的浓度-血管响应曲线:颈动脉流量设置为11 ml/min，在达到基础压(49.1±1.9 mmHg)后，给药给定的缓激肽浓度。记录反应，并允许压力恢复到基线。流量增加到16 ml/min，在达到基础压力(74.3±2.6 mmHg)后，给予相同浓度的缓激肽。将缓激肽在11和16 ml/min时的反应与每条颈动脉作为对照进行比较。之后，流量减少到11毫升/分钟，并给予不同剂量的缓激肽。所有缓激肽剂量均重复此循环。响应幅值定义为峰值压力值(mmHg)减去注射时的基础压力除以动脉长度(单位为cm，因为动脉长度在每种制剂中都不同)，响应以mmHg/cm表示(图1)。响应幅值与相应浓度(线性图)或浓度的对数(半对数图，n=45)作对比。

组2

L-NAME治疗:在豚鼠颈动脉中，缓激肽诱导双相反应，主要是血管收缩，随后由于一氧化氮的释放而产生微弱的血管舒张。L-NAME (L-N⁶-硝基精氨酸甲酯)是一种精氨酸的类似物，可抑制一氧化氮的产生，由于扩张被阻止，预计可增强缓激肽浓度-收缩剂响应曲线[19-25,35]。如第1组所述，缓激肽在11和16 ml/min时得到对照剂量-响应曲线。随后，在重复浓度-反应曲线的过程中，持续输注100 μ M L-NAME，流速分别为11(基础压力53.4±2.3 mmHg)和16 ml/min(基础压力77.1±2.3 mmHg) (n=9)。反应振幅值与相应的浓度(线性图)或浓度的对数(半对数图)作对照。

组3

低聚糖聚合物预处理:我们之前的共聚焦显微镜和功能研究表明，低聚糖聚合物(甘露糖、半乳糖和n -乙酰氨基葡萄糖共价结合到葡聚糖的组合)不可逆结合，与内皮表层结构具有高度亲和力，一旦结合，就不会被冲刷掉[8,16,12,26]。如上所述，在11 ml/min(基压51.1±2.9 mmHg)和16 ml/min(基压81.2±4.1 mmHg)条件下得到缓激肽对照浓度-响应曲线。随后，以400 μ M的浓度灌注可溶性低聚糖聚合物5 min，然后洗涤10 min，使灌注液中只有低聚糖聚合物仍与内皮表层结合，且无游离低聚糖聚合物[816,26,38]。浓度-响应曲线分别在11 ml/min(基压46.0±2.1 mmHg)和16 ml/min(基压78.9±3.1)时重复。在每个实验中，将低聚糖聚合物预处理前后11和16 ml/min的浓度-响应曲线相互比较，并与相应的对照曲线进行比较(n=10)。反应振幅值与相应的浓度(线性图)或浓度的对数(半对数图)作对照。

组4

Heparinase治疗:内源性内皮表层肝素基团参与多种流动诱导反应[10,11,13,31]，而这些众多的基团可被血管内肝素酶独家选择性水解[39-43]。为了尽量减少肝素酶经内皮扩散的可能性，我们使用低浓度梯度和极短的暴露时间反复给药[8,11,13,31,44]。如上所述，在11 ml/min(基压52.4±2.6 mmHg)和16 ml/min(基压81.2±6.8 mmHg)条件下得到缓激肽对照浓度-响应曲线。随后，以8 ml/min的流速注入肝素酶(1 U/ml) 0.5 min，然后洗涤3 min。此循环重复6次。随后，分别在11 ml/min(基压46.9±2.4 mmHg)和16 ml/min(基压75.0±5.0 mmHg)流速下重复浓度-响应曲线。在每个实验中，肝素酶预处理前后11和16 ml/min的浓度-响应曲线相互比较，并与相应的对照曲线进行比较(n=11)。反应振幅值与相应的浓度(线性图)或浓度的对数(半对数图)作对照。

统计分析

在所有组中，每根血管都是自己的对照。由于“对照”和“实验”反应是在同一颈动脉内测量的，因此选择配对t检验作为最合适的统计分析，结果与p<以0.05为有统计学意义。

结果

对照组I:血流增强缓激肽诱导的管腔内皮细胞缓激肽B2受体的刺激

缓激肽是一种激动剂，能够引起血管舒张、血管收缩或两者兼有，尽管血管舒张常被报道，但血管收缩发生在各种血管制剂中[19-25,45]。为了说明在不同浓度缓激肽下的血管收缩反应，原始记录如图1所示。静注缓激肽(0.8µM)后血管收缩，在11 ml/min时压力变化(ΔP)，在16 ml/min时压力增强。由于ΔP随相应动脉长度的变化而变化，因此ΔP除以动脉长度(cm)，定义响应为ΔP/cm;毫米汞柱/厘米。显然，对相同浓度缓激肽的反应在16 ml/min时大于11 ml/min时。

缓激肽在11 ml/min (Δ)和16 ml/min ()，见图1A及1B。在图1A中，在所有缓激肽浓度下，16 ml/min时的反应显著大于11 ml/min时的反应(每根动脉为独立对照，*表示p < 0.001, n= 45)。图1B为两种流动的对照浓度-响应曲线的半对数图。这些图用两条直线表示(相关系数> 0.98)，其中A和B分别对应截距值和斜率值。在11 ml/min和16 ml/min时，截流量分别为34.0±1.3 < 49.7±1.4，斜率为15.0±1.2 < 24.0±1.4(表2)。在两种流量下，截流量和斜率不同，说明每种流量的浓度-响应曲线不同。在其他4个不同实验条件的对照组中，截距和斜率值与对照组1相似(表2)。在流速为16 ml/min时，斜率值大于11 ml/min时，说明缓激肽浓度的相同变化会导致缓激肽诱导反应发生更大的变化。血流增强内皮介导的血管对缓激肽刺激的反应。

在四种不同的实验条件下进行了相似的试验;但是，为了防止图形过多，没有给出图形，表2只给出了截距值和斜率值。

图1所示。在控制条件下，血流增强了缓激肽对内皮管腔B2受体刺激的反应。

来自一个代表性实验的灌注压力原始记录，以说明响应幅度测量所采用的标准。相同浓度的缓激肽以11 ml/min的流速注射引起的反应，随后以16 ml/min的流速引起的反应。每一次注射都会引起短暂的压力反应;峰值压(Pr)减去基础压(Pb)定义为ΔP (mmHg)，除以动脉长度(单位为cm)。响应的大小(ΔP/cm)表示为mmHg/cm。一个。浓度-反应曲线为线性曲线。纵坐标表示反应振幅，横坐标表示缓激肽浓度(x10)⁶M). (Δ) 11 ml/min的流速响应。（)流速为16 ml/min时的反应。流速为16 ml/min时对缓激肽的反应明显大于流速为11 ml/min时的反应。每条动脉都有自己的控制，＊表示p < 0.001。第1组(n=45)的结果。B．浓度-反应曲线为半对数图。数据与图1相同一个．纵坐标为反应振幅，横坐标为缓激肽浓度的对数。数据用相关系数≥0.98的直线表示。16 ml/min时直线的参数A和斜率分别为49.7±1.9和24.0±1.4，大于11 ml/min时直线的参数A和斜率(34.0±1.3和15.0±1.2)。

第二组:L-NAME对两流量缓激肽浓度-血管响应曲线的影响

缓激肽的剂量-响应曲线如图2所示(n=9)。图2一个显示了在控制条件(Δ)下11 ml/min的流量和L-NAME ()．图2B显示了在控制条件下流量为16 ml/min时的结果()和持续输注L-NAME ()．两种血流的L-NAME显著向上改变了浓度——血管对缓激肽的反应(每条动脉都是自己的对照，＊表示p < 0.001和# p < 0.05)。在半对数图中，这四条曲线也用高相关系数(≥0.98)的直线表示。在L-NAME输注过程中，与对照组相比，截留值分别增加为11 ml/min(40.1±2.0 > 31.1±1.1)和16 ml/min(56.0±2.6 > 42.4±1.5)。相比之下，在11 ml/min时(18.2±2.2≈15.5±0.9)和16 ml/min时(27.5±2.3≈22.8±1.6)的斜率值没有变化(表2)。

图2。连续输注L-NAME对两种血流的影响11ml /min和16ml /min可增强缓激肽对内皮管腔B2受体刺激的反应。一个。浓度-响应曲线为11 ml/min时的线性曲线。纵坐标表示缓激肽浓度的反应振幅和横坐标(x10)⁶M)。对照条件下流量为11 ml/min时的响应用Δ表示，L-NAME给药期间的响应用．L-NAME给药期间对缓激肽的反应明显大于对照组。每条动脉都有自己的控制，＊表示p < 0.001和# p < 0.05。B。在流速为16 ml/min时，浓度-响应曲线为线性图。纵坐标表示反应振幅，横坐标表示缓激肽浓度(x10)⁶M)。在控制条件下，流速为16 ml/min时的响应表示为L-NAME给药期间的用．L-NAME给药期间对缓激肽的反应明显大于对照组。每条动脉都有自己的控制，＊表示p < 0.001和# p < 0.05。第2组(n= 9)的结果。

管腔内皮膜蛋白和分泌管腔内皮膜蛋白组分中存在g蛋白偶联受体

分离出管腔内皮膜蛋白片段，通过低聚糖聚合物亲和柱得到相应的凝集管腔内皮膜蛋白片段，经2D-SDS-PAGE分析(未见图)，共检测出167个蛋白[8,12,14,26]。在2D-SDS-PAGE凝胶中发现缓激肽B2受体和其他各种g蛋白偶联受体的坐标蛋白点。表1列出了这些受体。此外，利用免疫点印迹法确定了这些蛋白在整个腔内内皮膜蛋白和游离腔内内皮膜蛋白组分中的身份。因此，一系列g蛋白偶联受体存在于管腔内皮膜蛋白部分中，并具有凝集性。

表1。冠状动脉腔膜中蛋白质的2D-SDS坐标值分子分子量(x 103)等电点

描述图1-5所示流量数据的直线(对数浓度-响应曲线)的参数。参数一个对应于该线与x轴和的交点B对应于直线的斜率。的值一个而且B分别为11 ml/min和16 ml/min两种流速下5种不同条件下的流量图;对照，L-NAME，低聚糖聚合物(Sac-Pol)和肝素酶处理。只有control和L-NAME组是参数一个而且B在16 ml/min时比在11 ml/min时要大。即两种流动处的直线是不同的。在低聚糖聚合物和肝素酶处理后，流动不能改变这些参数。

分子	分子量(x 103.）	等电点(pl)
B2R	41.56	8.88
AT1	45-48	6.7
ETAR	48.58	8.68
PRL-R	66	5.66
TXA2R	37.1	10
A1-R	36.64	8.77
A2A-R	44.88	8.68
B1-AR	47.06	6.78
A1A-AR	78	5.9

第3组:低聚糖聚合物对两流量缓激肽浓度-血管响应曲线的影响

我们实验室的大量工作已经证实了这一点在活的有机体内低聚糖聚合物与管腔内皮膜蛋白具有高亲和力和凝集性结合。短暂输注后，共聚焦显微镜显示，低聚糖聚合物仍然结合在腔内内皮膜上，即使在广泛的冲洗后。在绑定[31日,43岁,46-49]。因此，低聚糖聚合物在与内皮表层凝集素(如缓激肽B2受体)结合后，可能会与内源性低聚糖竞争结合。

缓激肽的剂量-响应曲线如图3所示(n=10)。图3一个显示了在控制条件下流量为11 ml/min的结果(Δ)以及寡糖聚合物结合到内皮表层的后续结果()．图3B显示了在控制条件下流量为16 ml/min时的结果()及寡糖聚合物与内皮表层结合后的结果()．在两种血流中结合的内皮表层低聚糖聚合物显著地导致了浓度的上升——血管对缓激肽的反应增强了两种血流中缓激肽的作用(每条动脉都是自己的对照，＊表示p < 0.001)。在半对数图中，这四条曲线也用高相关系数的直线表示(≥0.98)(表2)。由于寡糖聚合物与内皮表层结合，与对照相比，在11 ml/min(69.2±2.3 > 37.9±2.2)和16 ml/min(76.3±2.1 > 50.0±6.2)时，截距值增加。相比之下，当低聚糖聚合物与内皮表层结合时，斜率值仅在11 ml/min时增加(25.3±3.0 > 19.3±1.9)，而在16 ml/min时斜率值相同(26.1±2.5≈28.4±6.8)，与低聚糖聚合物存在时的11 ml/min相似;25.3±3.0(表2)。低聚糖聚合物在流量为11 ml/min和16 ml/min时，会使相应的对照浓度-响应曲线向上位移到相同的水平。但在低聚糖聚合物存在的情况下，两种流动的浓度-响应曲线是相同的，因为两种流动的斜率和截距值没有差异(表2)。

图3。

结合寡糖聚合物(Sac-Pol)对两流内皮表层的影响;11ml /min和16ml /min可增强缓激肽对内皮管腔B2受体刺激的反应。一个。浓度-响应曲线为11 ml/min时的线性曲线。纵坐标表示反应振幅，横坐标表示缓激肽浓度(x10)⁶M)。控制条件下11 ml/min流速下的反应用Δ表示，低聚糖聚合物(Sac-Pol)给药、洗涤和与内皮表面层结合后的反应用Δ表示．当低聚糖聚合物(Sac-Pol)与内皮表面层结合后，对缓激肽的反应明显大于对照组。每条动脉都有自己的控制，＊表示p < 0.001。B．在流速为16 ml/min时，浓度-响应曲线为线性图。在控制条件下，流速为16 ml/min时的响应表示为而低聚糖聚合物给药后与内皮表层结合后的则表示为．低聚糖聚合物与内皮表面层结合后，对缓激肽的反应明显大于对照组。每条动脉都有自己的控制，＊表示p < 0.001。第3组结果(n= 10)。

第4组:肝素酶对两流缓激肽浓度-血管响应曲线的影响

我们实验室和其他许多实验室的工作表明，肝素酶灌注到血管中去除内皮表层肝素官能团[10,11,31,13,39,40,42]。肝素是一种支化寡糖，已知与内皮表层功能性[40]结合。

缓激肽的剂量-响应曲线如图4所示(n=11)。图4一个显示了在控制条件下(Δ)， 11 ml/min流量下的结果和去除内皮表层肝素组()．图4B显示了在控制条件下流量为16 ml/min时的结果()和去除内皮表层肝素组()．在流量为11 ml/min时去除内皮表层肝素基团显著改变了血管对缓激肽的反应浓度。在流速为16ml /min时，也会发生类似的向上位移，尽管与低聚糖聚合物相比，位移的程度较小(每条动脉都是自己的对照，＊表示p < 0.001和# p < 0.05)。在半对数图中，这四条曲线也用高相关系数的直线表示(≥0.98)(表2)。灌注肝素酶后，与对照相比，在11 ml/min(47.9±2.3 > 32.3±2.1)和16 ml/min(53.2±1.8 > 45.4±1.3)时，截距值都增加了。相比之下，内皮表层肝素去除后，与对照相比，斜率值仅在11 ml/min时增加(22.4±3.0 > 16.3±2.0)，而在16 ml/min时，斜率值相同(22.2±2.1≈23.2±1.3)，与肝素去除后11 ml/min时相似;22.4±1.9(表2)。在11 ml/min和16 ml/min的肝素酶预处理时，相应的对照浓度-响应曲线都向上移位到相同的水平。但在用肝素酶处理后，两种流动的浓度-响应曲线是相同的，因为两种流动的斜率和截距值没有区别(表2)。显然，低聚糖聚合物与管腔内皮膜蛋白结合并去除其肝酰化基团具有相似的定性效果，尽管在数量上存在差异。

图4。两流内皮表层肝素基去除的影响11ml /min和16ml /min可增强缓激肽对内皮管腔B2受体刺激的反应。一个。浓度-响应曲线为11 ml/min时的线性曲线。纵坐标表示反应振幅，横坐标表示缓激肽浓度(x10)⁶M)。对照条件下11 ml/min流速下的反应用Δ表示，肝素酶输注、洗涤和内皮表层肝素组去除后的反应用Δ表示．内皮表层肝素基团去除后，对缓激肽的反应明显大于对照组。每条动脉都有自己的控制，＊表示p < 0.001和# p < 0.05。B．在流速为16 ml/min时，浓度-响应曲线为线性图。在控制条件下，流速为16 ml/min时的响应表示为肝素酶输注、洗涤和内皮表层肝素组去除后的用．内皮表层肝素基团去除后，对缓激肽的反应明显大于对照组。每条动脉都有自己的控制，＊表示p < 0.001和# p < 0.05。第4组(n= 11)的结果。

比较四种不同实验条件下流量对缓激肽浓度-血管响应曲线的影响

图1-4所描述的四种不同条件下流动直接效应的结果在图5中进行了比较。图5一个,5B, 5C和5D分别比较控制、持续输注L-NAME、与管腔内皮膜蛋白结合的低聚糖聚合物和去除管腔内皮膜蛋白肝磷脂的两种流动的效果。在对照组和持续输注L-NAME时，流量为11 ml/min时的曲线(图5)一个Δ和5B)显著低于16 ml/min时的相应曲线(而且)．显然，在这两种情况下，血流增强了缓激肽的作用(每条动脉都有自己的控制，＊表示p < 0.001)。然而，低聚糖聚合物与管腔内皮膜蛋白结合后，在11 ml/min和16 ml/min流速下得到的曲线(图5)C，)和管腔内皮膜蛋白肝素组被移除(图5D，)彼此并无不同。显然，在这两种情况下，心流不能增强缓激肽的效果。在半对数图中，这8条曲线均用高相关系数≥0.98的直线表示，其截距(A)和斜率值(B)如表2所示。

图5。四种不同实验条件下血流对内皮表层缓激肽B2受体对缓激肽刺激反应的影响(浓度-响应曲线)。一个．控制条件。纵坐标表示反应振幅，横坐标表示缓激肽浓度(x10)⁶M). Δ=反应流速为11 ml/min。=反应流速为16 ml/min。流速为16 ml/min时对缓激肽的反应明显大于11 ml/min时的反应。在这种情况下，流动增强了对缓激肽的反应。每条动脉都有自己的控制，＊表示p < 0.001。第1组(n= 4)的结果。B。持续注射L-NAME时浓度-反应曲线为线性曲线。纵坐标表示反应振幅，横坐标表示缓激肽浓度(x10)⁶米)。=反应流速为11 ml/min。=反应流速为16 ml/min。缓激肽在流速为16 ml/min时的反应明显大于在流速为11 ml/min时的反应。在这种情况下，流动增强了对缓激肽的反应。每条动脉都有自己的控制，＊表示p < 0.001。C.低聚糖聚合物(Sac-Pol)与内皮表面层结合后。纵坐标表示反应振幅，横坐标表示缓激肽浓度(x10)⁶米)。=反应流速为11 ml/min。=反应流速为16 ml/min。两种流对缓激肽的反应是相同的。在这种情况下，血流不能增强对缓激肽的反应。每条动脉都有自己的控制。第3组结果(n= 10)。D。内皮表层肝素组去除后。纵坐标为反应振幅，横坐标为缓激肽浓度(X 10- 6m)。=反应流速为11 ml/min。=反应流速为16 ml/min。两种流对缓激肽的反应是相同的。在这种情况下，血流不能增强对缓激肽的反应。每条动脉都有自己的控制。第4组(n= 11)的结果。在半对数图中，所有这些浓度-响应曲线都得到相关系数≥0.98的直线，描述这些直线a和斜率(B)的参数如表II所示。

讨论

对于我们目前的研究，我们选择离体豚鼠颈动脉灌注控制流量，因为它的特点包括:一个小的均匀的血管圆筒;具有设定血流速率的能力，其内皮表面层可直接访问，且糖萼完好[48,49]。此外，血管平滑肌收缩反应的振幅是内皮旁分泌信号的直接指标[20-25]。这种准备构成了一个更类似于体内模型这使其成为一种适合于定量研究内皮表层流动激活机制的敏捷系统，内皮过程以血管平滑肌收缩的变化为研究对象[20-25]。

在这篇手稿中，我们表明:

1)在对照条件下，血流可增强内皮表面层缓激素受体的激活。

2)两段血流中与管腔内皮膜凝集素结合的寡糖聚合物显著向上改变了缓激肽的浓度-血管反应。低聚糖聚合物对两种流动中缓激肽的增强作用远高于流动的增强作用，使流动效应为零(图4，表2)。低聚糖聚合物被用作亲和树脂分离凝集素内皮表面层缓激肽B2受体，在输注时，仅与凝集素管腔内皮膜蛋白结合，包括缓激肽B2受体原位(8、12、26)。

3)使用肝素酶去除管腔内皮膜蛋白肝素，在两个流量，导致浓度-血管对缓激肽的反应明显上升，与对照组相比。肝磷脂基团是内皮表层最丰富的寡糖成分，可能与邻近的凝集蛋白相互作用[10,40,42,50]。肝素去除对缓激肽在两种流动中的作用的增强效应几乎与流动的增强效应相似，使流动效应为零(图5，表2)。由于寡糖聚合物和肝素酶的大小和短暂给药，它们各自针对内皮表面层凝集素和肝素，都是限制其作用于内皮表面层以改变其寡糖组成的药物。

4)在L-NAME存在的情况下，两组血流对缓激肽的浓度-血管反应明显高于对照组。但L-NAME对血流的增强作用与对照组一样有效，这与低聚糖聚合物和肝素酶的作用相反(图2、表2)。L-NAME的这种作用可以归因于对基础硝酸合酶活性的单独抑制，而不依赖于B2缓激肽诱导的信号传导。然而，抑制基础一氧化氮合成将表现为基础灌注压力的增加，在对照组11 ml/min和16 ml/min时，基础灌注压力分别为49±1.9 mmHg和74.2±2.6 mmHg，在L-NAME期间为53.4±2.3 mmHg和77.1±2.3 mmHg。因此，L-NAME的作用可能是与缓激肽信号相互作用的结果。

表2:两流不同处理后log-浓度-响应曲线参数的比较。Y = A + Bx;x =日志-,浓缩的。

在二维SDS-PAGE (2D-SDS-PAGE)模式中，发现了含有在腔内凝集内皮蛋白片段中所列g蛋白偶联受体坐标值的蛋白点。受体凝集素为:B2R;缓激肽B2, AT1R;血管紧张素ⅱ,ETAR;内皮素。PRL-R;催乳素,TXA2R;血栓素A2 A1-R;腺苷1、A2A-R;腺苷2,β1-AR; Adrenergic β1, α1-AR; Adrenergic α1. In addition, identification of bradykinin B2R and the others listed proteins was performed by inmuno-Dot and found to be present in both the whole endothelial luminal membrane fraction and in the luminal lectinic endothelial fraction. Modified from Perez-et al Am. J. Physiol Heart Circ Physiol 306:H699-H708, 2014.

流	11毫升/分钟		16毫升/分钟
组#	一个	B	一个	B
控制	34.0±1.3	15.0±1.2	* 49.7±1.4	“24.0±1.4
控制	31.1±1.1	15.5±0.9	“42.4±1.5	“22.8±1.6
L-NAME	“40.1±2.0	18.2±2.2	#“56.0±2.6	27.5±2.3
控制	37.9±2.2	19.3±1.9	* 50.0±6.2	* 28.4±6.8
ZSac-Pol	* 69.2±2.3	* 25.3±3.0	“76.3±2.1	26.1±2.5
控制	32.3±2.1	16.3±2.0	“45.4±1.3	* 23.2±1.3
Heparinase	* 47.9±2.3	“22.4±1.9	53.2±1.8	22.2±2.1
*大于其对应的控制参数 #大于流量为11 ml/min时的对应参数

我们实验室最近的一项研究强调了内皮表层寡糖和流动对内皮表层受体激动剂激活的重要性[14]。内的假丝酵母glabrata一种病原体，通过甘露糖链接到内皮表面层，改变了三种不同g蛋白偶联受体的流量调节功能反应和激动剂诱导反应;缓激肽，血管紧张素II型1和α1肾上腺素能受体。此外,如果假丝酵母glabrata被用作亲和甘露糖树脂，凝集内皮表层g蛋白偶联受体;分离到缓激肽、血管紧张素II型1、α1-肾上腺素能和内皮素2受体。低聚糖聚合物和假丝酵母glabrata它们的生理效应和结合凝集管腔内皮膜g蛋白偶联受体的能力都类似，如果同时注入相应的游离单糖，它们的作用就会被阻止(Torres-Tirado等，2016)[14]。显然，内皮表面层大量多样的凝集结合位点是内皮表面层共同的而不是独特的[8,12,16,26]。

我们的假设是，流动响应要求在特定低聚糖环境中由凝集素转导蛋白组成的传感器通过凝集素-低聚糖相互作用检测流动/机械应力[1,2,8,12,14,26,51]。这一概念也适用于表3所列的其他对血流敏感的管腔内皮膜蛋白结构。这些结构具有假设所要求的大多数列出的特性;存在于管腔内皮膜蛋白组分(全膜组分，WMF)中的凝集素，独立于激动剂对流动产生反应，对其激动剂产生反应，流动诱导构象变化。

表3．对流动和管腔不可知激活反应的管腔内皮膜凝集蛋白

在管腔膜中的内皮蛋白是分泌的，被管腔激动剂激活，并通过改变其分子构象对血流作出反应。

我们目前的研究结果进一步支持了这一概念，即血管腔内的糖萼成分，低聚糖(O)和信号转质跨膜蛋白(l)，由于它们的亲和性和邻近性，形成可逆络合物(●L阿)通过以下动态平衡:O + L●L阿．通过与内源性低聚糖竞争或用酶(如肝素酶)去除内源性低聚糖而加入外源性低聚糖，如低聚糖聚合物，肯定会改变该系统的平衡。如果l是一种g蛋白偶联受体，与缓激肽一样被血流激活，这意味着血流和相应的激动剂应该协同作用，而血流只是增强了激动剂的浓度依赖性作用。这种平衡决定了由血流调节的内皮生化通路所达到的激活水平，而它的干扰决定了真正血流传感器的“响应幅度”;O而且l．很可能O它是水化程度最高的结构，直接吸收流动(水和运动中的离子)的更多能量●L阿或O + L正在启动。如果这个解释是正确的，它表明跨膜转导Ls，如g蛋白偶联受体缓激肽，不是孤立的，是完全化学敏感的分子，而是分子复合体的一部分，其功能由其特定的寡糖环境的相互作用决定和渐变。这个直观的概念在图6中得到了说明，图6表示一个内皮细胞和跨膜信号蛋白具有几个凝集位点，嵌入在低聚糖环境中，暴露在水和离子的流动中。寡糖凝集位点可逆结合，通过一种无法解释的物理机制，部分或全部被调节，导致细胞信号转导。这个分子复合物就是“受体”，每个部分都决定信号输出，使“受体”具有多种功能[52,53]。在我们看来，我们的建议是唯一提供了一个机制的流动信号的机械转导。

图6。图示内皮细胞和两种跨膜信号蛋白。这些蛋白质有一些凝集位点，被糖基化，并被不同寡糖的密集网络所包围。Lectinic (l)位点与邻近的寡糖(O)并形成配合物(L●O)，其平衡由水和离子的流动调节。

然而，我们的假设是，当低聚糖聚合物与管腔内皮膜的缓激肽受体结合时，它改变了其对缓激肽的流动诱导反应，即直接的因果关系。然而，低聚糖聚合物结合到其他信号蛋白也是流量敏感的，可能间接调节血管平滑肌张力，改变对缓激肽的反应。因此，除了直接的因果关系之外，其他机制可以解释我们关于心流的结果。可能的解释包括:1)血管紧张素II和肾上腺素能α1受体对血流敏感，可间接改变肌肉张力，从而引起缓激肽反应。2)血流通过激活管腔内皮膜ATP合酶来刺激ATP的释放。ATP反过来刺激嘌呤能P2X4通道，导致一氧化氮的释放。如果低聚糖聚合物抑制ATP的产生或其对P2X4通道的影响，这将通过这种机制抑制流动诱导的扩张，这将倾向于通过缓激肽增加收缩作用。未来必须探索这些替代方案。

最后，假设激素和电刺激作用于细胞膜(脂双分子层)中的跨膜效应蛋白是不准确的，该细胞膜被剥离了细胞外特异性锚定结构，即“光头”膜[1,2,46]。这些普遍存在的模型是一种概念上的过度简化，因为电子显微镜、生化和现在的功能研究表明，许多跨膜蛋白是凝集素，并被包围和结合到特定的低聚糖复合体的密集网格中。

综上所述，我们认为血流的作用是调节寡糖-凝集素受体位点之间的相互作用水平，这是受体机械感应的机制之一。然而，另一种不同的原理可能适用于其他机械感应结构。

资金

由conacy - sep 00223350资助。a . E. Jiménez-Corona是中国科学院博士后研究项目CONACYT 290917。

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