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摘要

25 -羟基维生素D (25OHD)水平被公认为维生素D状况的指标，但其测量仍是一个挑战。本研究的目的是建立一种可靠且易于使用的同时分析25OHD的hplc方法₂和25 ohd_3.采用蛋白质沉淀法、正己烷液-液萃取法对基质物质进行分离，并对其分析性能进行评价。采用高效液相色谱和紫外检测器(Thermo Scientific Spectra System, USA)。采用Synergy反相色谱柱4,6 × 250 mm，粒径4.0 μm，流动相为甲醇/乙腈/水(70/25/5)，等径洗脱，流速1.2 mL/min，紫外检测265 nm。本方法与验证的ID-LC-MS/MS方法和商业免疫化学方法进行了比较。数据采用线性回归分析。每种分析物的线性关系在5-160 ng/ml之间(r²= 0.99)，检测下限为4nmol /L，定量下限为10nmol /L。4个QC水平共10个重复(RSD≤9%)，测定分析精密度。对所有QC样品进行10次重复分析，连续21天测定了分析间精密度(RSD<10%)。所有结果与25OHD LC-MS/MS方法的偏差均在14.2%以内。方法比较表明，HPLC法与LC-MS/MS法具有良好的一致性(r = 0.85)，与商品化免疫分析法的差异(r = 0.48)。该方法线性良好，准确度和精密度可接受，与验证的ID-LC-MS/MS方法吻合良好。样品制备简单，测定简便，适用于临床常规检验。

关键字

HPLC, 25-羟基维生素D, LC-MS/MS，免疫化学分析

介绍

在发现与钙稳态无关的组织中的维生素D受体蛋白质后，建立了众多对维生素D的抗性效应。维生素D缺乏与骨疾病旁边的各种临床疾病相连[1,2]。因此，对维生素D现状的评估对于制定维生素D缺乏的临床管理决定是重要的。众所周度地普遍认为，维生素D，25-羟基维胺D（25Ohd）的循环形式是评估个体维生素D状态的最佳指标[3,4]。在过去的十年中，25Ohd的血液测试中的指数增加。基于两个主要原理 - 间接免疫化学和直接色谱的各种方法如今用于评估维生素D状态。免疫化学方法主要用于常规测试，因为它们的简单性和加速度，而色谱测定更准确，可靠，[5]。免疫化学方法的主要限制是测定中使用的抗体的交叉反应性。另一个限制与他们无法辨别D.₂和D_3.25OH代谢物[6]的形式。色谱方法过于复杂，需要高素质的实验室人员。另一方面，它们表现出优异的分析性能和选择性。最近提出了一种测定血[7]中25OHD的色谱方法——LC-MS/MS法。本研究的目的是建立一种可靠且易于使用的内部hplc同时分析25OHD的方法₂和25 ohd_3.在人体血清中并评估其分析性能。

材料和方法

试剂和标准

所用试剂和标准品均为高效液相色谱级。无水乙醇、甲醇、超纯水、正己烷和乙腈由Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)提供。1- α胆钙化醇作为内标，胆钙化醇(维生素D3)和麦角钙化醇(维生素D2)由美国Sigma Aldrich公司提供。在无水乙醇中制备维生素D3 (2 mg/ml)、维生素D2 (2 mg/ml)和内标液(2 mg/ml)，在−20保存^O.从这些单独的标准溶液中，用甲醇适当稀释制备工作标准。

校准器和控制

25OHD的血清校准和对照(双级I +II)_3.和25 ohd₂均购自德国Chromsystems Instruments & Chemicals GmbH。商业冻干血清对照品和校准品根据制造商的说明书和报价在水中重新配制。aliquots存储在−20^O.C。

血液样本

为了评估分析性能和比较研究，使用了30份来自泌尿科诊所的血清样本和17份来自大学医院儿科病房的血清样本。参与者获得知情同意。使用带有血清凝块激活剂(Greiner Bio One International GmbH)的液泡采集血液样本。血液3000rpm离心10min，血清立即分离，保存于- 20^O.直到分析C。

预分析程序

简而言之，样品制备程序包括:向0.5 ml血清(校正器、对照品)中加入1 ml无水乙醇进行蛋白沉淀。混合1分钟后，在5500 rpm下离心10分钟。用3ml己烷分离干净的上清液，提取2次。联合萃取物在温和的氮气蒸汽下蒸发。将干渣溶解在0.2 ml甲醇中，进行高效液相色谱分析。

高效液相色谱分析

采用高效液相色谱系统(Spectra system, Thermo Scientific, USA)和紫外检测器(UV 2000)进行色谱分析。采用美国Phenomenex公司RP C18色谱柱Synergy hydro-RP 4,6 × 250 mm, 4.0 μm进行分离。流动相为70%乙腈、25%甲醇、5%水，以1.2 ml/min的流速等径洗脱。注射使用Rheodynetype 7125六端口阀，配有20 ul的回路。检测波长为265 nm。通过ChromQuest 4.2.34软件进行仪器控制、数据采集和定量。

方法比较研究采用ID LC-MS/MS和使用DiaSorin Liaison平台的免疫化学发光法。

ID质/女士

采用经过验证的LC-MS/MS法测定25OHD。简单地说，用含内标D3 -25-羟基维生素D3 (d325D3)的乙腈150 μL沉淀100 μL人血浆或血清。然后25 ohd_3.，25ohd.₂，和d325d_3.用1.0ml己烷萃取。在C18分析塔上进行色谱分离，在0.1ml / min的流速下的等物质洗脱，利用由85％甲醇/乙酸铵/甲酸缓冲液组成的流动相。使用25kV和选定的反应监测处的正离子电喷雾电离来遵循主要的过渡：M / Z 401→383的碰撞能量（CE）= 10〜25Ohd_3.对于25OHD，在m/z 413→395时CE=10₂， d325D3为404→386。方法根据FDA指导要求进行验证。使用工业认证的6点人血清校准标准构建校准曲线。质量保证使用内部准备和商业质量控制样品，并参与不间断认证的外部能力测试计划(DEQAS，英国)。方法的选择性评估了6种不同的人血浆来源，并证实基质效应(ME)平均91-93% 25OHD_3.25OHD为82-92%₂d325D3为84-89%，25OHD的相对ME为105-108%_3.25OHD为97-104%₂．准确性和精度（在运行内和运行之间）均为7.5％。25Ohd的提取回收率平均为57-64％_3.25OHD为69-73%₂，55-56％的D325D_3.；25OHD的线性范围_3.和25 ohd₂为1.2 ~ 120.0 ng/ml, R²> 0.99。确定每次持续24小时的三个循环的冻融稳定性，后制备稳定性在10时被记录96小时^O.C，环境温度下的短期稳定性在黑暗中24小时，在日光下2小时;贮存液稳定性和血浆长期稳定性-在4-8天^O.在零下20度的温度下工作99天^O.C.仪器在无人值守的情况下，运行时间小于10分钟，每24小时的吞吐量超过100个样品。

DiaSorin联络自动化系统

根据制造商的说明书[8]，使用商业对照品和校正器测量患者样本中的25OHD水平。

结果

校正器和病人样本的典型色谱图，说明25OHD的分离_3.，25ohd.₂内部标准1alpha-25OHD_3.图1和图2所示。25OHD的保留时间为9.14 min_3.， 10.08分钟，25OHD₂内标16.03分钟。总的分析时间为常规高效液相色谱法典型的22分钟。

图1。一种商用血清校准器的高效液相色谱。

25Ohd._3.= 37 ng / ml;25Ohd.₂= 28.2 ng / ml;峰1 - 25OHD_3.，保留时间= 9.14分钟;峰值2 - 25OHD₂，保留时间= 10.8分钟;ISTD -内标1- α - ohd3，保留时间= 16.03 min。

图2。患者样本的高效液相色谱图。

25Ohd._3.= 14.30 ng / ml;峰1 - 25OHD_3.，保留时间= 9.10分钟;ISTD内标1- α - ohd3，保留时间= 15.71 min。

采用精密度、定量限、检出限、线性度和平均加样回收率对分析性能进行评价_3.和25 ohd₂使用商业控制​​血清。估计分析精度为两个靶浓度：37ng / ml和51ng / ml。相对误差百分比分别为1.08％和1.27％。表1中总结了精确数据。两种分析物的LOQ为10ng / ml，LOD-4ng / ml。测定为25Ohd的线性形式5-160ng / ml_3.具有以下回归方程Y = 0,04318^＊X + 0,08295 (r²= 0.9996)。25 ohd₂线性范围为5 ~ 160 ng/ml，回归方程为y = 0,04464^＊x + 0,1430（r²= 0.9935)。在每种情况下，x代表加入血清样本的浓度，y代表分析结果。根据患者样品的标准添加量计算浓度范围为10-100 ng/ml，每个浓度重复3次。25OHD的分析回收率在82 ~ 110%之间_3.25OHD表格87-101%₂．

表1。提出的HPLC-UV方法的精确特性。

RSD，相对标准偏差;在运行精度范围内计算出每个浓度水平的10个重复;在运行精度范围内，每个浓度水平连续21天计算。

化合物(ng / ml)	精度（RSD％）
	在跑步中	之间的运行
25Ohd.3.
12.7	8.52	8.92
25.4	6.67	8.02
50．8	4.33	5.20
One hundred.	3.52	4.66
25Ohd.2
11．4	8.45	8.72
22.8	6.79	8.01
45.7	5.28	7.53
One hundred.	2.38	4.53

为了确保我们参与维生素D外部质量评估计划（DEQAS）的方法的分析可靠性。在浓度范围内，19ng / ml至40ng / ml我们的结果是平均值±1SD。最低测试浓度的目标值为11,7 ng / ml，接近我们的测定的LOQ。在这种情况下，所得结果在范围平均值+ 2SD内。

方法比较研究了我们的室内测定法、ID LC-MS/MS(一种候选参考方法)和DiaSorin Liaison常规免疫化学发光测定法(图3和图4)。两种色谱方法获得了可接受的一致性(n = 30;r²= 0.85)。将我们的方法获得的数据与DiaSorin Liaison的数据进行比较，我们发现一致性较低(n=17;r²= 0.48）。

图3。比较25 ohd_3.所提出的HPLC-UV法和ID LC-MS/MS法得到的值。

N = 17例患者样本，r²= 0.48，回归方程y = 0.82*x + 7.00

图4。比较25 ohd_3.采用HPLC-UV法和DiaSorin联络25OH维生素D总含量法测定。

N = 30例患者样本，r²= 0.85，回归方程y = 0.70*x + 5.15

讨论

在过去的二十年中，世界范围内不仅成人而且儿童的维生素D缺乏率都很高。据估计，在美国和欧洲，超过一半的儿童和成人处于危险之中。因此，维生素D状态的估计引起了许多研究者和临床医生的关注。维生素D状态的最佳决定因素是维生素D 25OHD[5]循环形式。两种形式的25OHD可以在循环中检测到，25OHD_3.，主要在皮肤日晒后形成;25OHD₂来源于饮食。使用维生素D类似物和补充剂治疗维生素D缺乏需要对维生素D状况进行后续评估。因此，需要一种简单、精确和实验室间一致的方法来测量25OHD水平。

25OHD是一种亲脂化合物，通过血液与维生素D结合蛋白(DBP)的复合物进行运输。竞争性结合从大鼠血清中提取的DBP是第一次用免疫分析法测定25OHD水平的基础。最近，许多竞争性的免疫化学检测方法在结合剂和检测方法上有所不同[10,11]。这些方法的一个共同缺点是它们对25OHD的选择性有限_3.，25ohd.₂和其他极性维生素D代谢物[12]。免疫化学分析方法以其简便、快速、快捷、成本高等优点，已广泛应用于实验室的日常工作中。

大多数免疫化学方法的缺点是通过直接色谱方法克服。这些测定定量和选择性地测量25Ohd₂和25 ohd_3.[6、14]。

在过去的几年里，保加利亚对检测25OHD水平的兴趣呈指数级增长。因此，一些临床实验室引入了常规免疫化学分析。在保加利亚，2012年国家药物监测参考实验室首次开发了一种使用液相色谱-串联质谱的色谱方法。由于LC-MS/MS方法相当复杂，需要熟练的人员和昂贵的设备，因此需要另一种更传统的色谱法来可靠地测定维生素D状态。在我们的内部方法中，基于蛋白质沉淀和液-液萃取的简单样品制备程序确保了25OHD从结合蛋白中有效释放，并获得“明显”清洁的提取物。该方法的最小样本量为0.5 mL, LLQ均为10 ng/mL_3.和25 ohd₂．线性范围(5-160 ng/mL)涵盖了检测维生素D缺乏、不足和充足的临床显著间隔。25OHD的RSD范围在(12.7 ng/ml -100 ng/ml)之间_3.25OHD的RSD为(11.4 ng/ml - 100 ng/ml)₂．25OHD的RSD介于(100 ng/ml - 12,7 ng/ml)之间_3.25OHD的RSD (100 ng/ml - 11.4 ng/ml)₂．本方法在定量限、定量限、线性度、精密度等方面的分析性能与其他已发表的高效液相色谱方法[5]的分析性能基本一致。

最近，美国国家标准与技术研究所(NIST)开发了一种同位素稀释(ID) - LC-MS/MS联用测定血清25OHD的方法_3.和25 ohd₂- 25OHD测量的候选参考方法。使用与分析物相同的稳定同位素标记内标，保证了ID LC-MS/MS方法的最高分析精度，也是选择该方法作为参考的基础[5,15,16]。

我们将我们的内部HPLC方法与保加利亚国家药物监测参考实验室开发的ID LC-MS/MS方法进行了比较。比较研究显示非常接近的值(r²= 0.85)。HPLC和ID LC-MS/MS分析之间有很好的相关性²其他人也报告了= 0.99 [16]。

免疫化学方法简单、快速、周转时间短，是临床实验室分析25OHD最常用的方法。用于25OHD联络总检测的最新改良的DiaSorin被认为是[16]中最可靠的免疫化学检测方法之一。HPLC法与DiaSorin联络总法测定结果的相关性较差(r²= 0.48）。DiaSorin联络总方法估计总共250多次浓度平均为7％，记住，在我们的样品中25Ohd_3.是血清中唯一的一种这种较差的一致性可能是由于免疫测定的典型抗体的交叉反应性，以及与抗体结合或基质效应相关的随机错误，而这些限制在直接色谱方法中不是问题，因为它们的高选择性。HPLC与Liaison分析相关性差(r = 0.735;N = 203)也有报道[17,18]。

总之，我们的高效液相色谱法能够可靠地定量25OHD_3.和25 ohd₂．相对较短的分析时间使其适用于常规的临床检验实践。高效液相色谱法由于具有较高的选择性和较好的分析性能，将成为测定这两种代谢物的首选技术。使用商业血清校准和控制减少了不同色谱技术获得的结果的可变性，并允许更好的可追溯性。

确认

这项研究得到了保加利亚瓦尔纳医科大学科学基金的支持。

相互竞争的利益

没有利益冲突

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