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摘要

背景

白癜风是一种获得性皮肤疾病的特点是失去功能的黑素细胞。已经提出的几个理论包括;遗传、自身免疫、神经、凋亡、病毒、自毁和收敛理论。蛋白基因产物9.5 (PGP 9.5)和单链DNA (ssDNA)分别作为一般的神经元标志物和凋亡标志物。

客观的

探讨神经机制或凋亡机制或两者共同作用在全身性和节段性白癜风变型发病中的可能作用。

对象和方法

本研究纳入20例白癜风患者，10例节段性和10例非节段性，20例明显健康对照。每个患者取两次活检;一个来自病变，另一个来自正常色素沉着的病变周围皮肤。每个对照从非暴露在阳光下的皮肤上取一份活检。采用免疫组织化学染色技术对PGP 9.5和ssDNA进行活检。

结果

与对照组相比，病变节段性白癜风和非节段性白癜风的PGP9.5和ssDNA差异有统计学意义(p<0.01)。病变性和非病变性皮肤的PGP9.5和ssDNA差异有统计学意义(p<0.01)。PGP9.5病变节段性白癜风和非节段性白癜风的染色强度比较差异无统计学意义，而ssDNA的染色强度差异有统计学意义(P<0.01)。

结论

节段性白癜风和非节段性白癜风都有相同的神经理论，因为皮肤轴突末梢通过化学突触与表皮黑素细胞接触，对这些细胞产生直接或间接的破坏作用。另一方面，细胞凋亡在非节段型中更为明显，或通过氧化应激、自身免疫机制和/或任何黑色素合成的自毁产物，而在节段型中，神经理论通过细胞凋亡占据上风。

关键字

白癜风,PGP9.5 ssDNA

简介

白癜风是一种获得性皮肤疾病，其特征是功能黑素细胞丧失，导致皮肤脱色[1,2]。

白癜风病变中黑素细胞功能破坏和黑素缺失的机制尚不清楚。然而，一些理论已经被提出和研究，包括;基因假说、自身免疫假说、神经假说(涉及神经肽、肾上腺素能和胆碱能神经递质)、凋亡理论、病毒假说、自我毁灭假说(包括氧化应激通过H₂O₂)和收敛理论(结合以往理论)[3-5]。

白癜风的遗传是不同位点或等位基因的多基因遗传。大多数白癜风易感位点编码免疫系统的组成部分;免疫细胞在病灶周围的皮肤上。白癜风常伴有自身免疫并发症，免疫抑制治疗对白癜风常有反应。因此，自身免疫理论在白癜风中的主张最多。此外，在白癜风的发病机制中活性氧与免疫系统的相互作用也有推测[6-8]。

活性氧可诱导黑素细胞树突状结构的丧失，不仅影响黑素小体的转移，而且可能加剧遗传性粘附缺陷黑素细胞[9]的外伤性经皮丧失。

皮肤轴突末梢与表皮黑素细胞通过人体皮肤的化学突触进行接触。据报道，白癜风区的黑素细胞微环境中，自主神经末梢释放chatecholamine增加。去甲肾上腺素因具有直接和间接的黑色素细胞毒性作用而闻名。直接作用包括与细胞巯基相互作用，酶抑制，损害线粒体钙摄取，形成一些细胞毒性产物，包括自由基。间接作用包括激活小动脉的α受体，引起严重的血管收缩，从而产生缺氧引起的有毒氧自由基[10]。

另一方面，活性氧的积累导致黑素细胞损伤，并通过凋亡[11]产生自身抗原。

蛋白质基因产物9.5 (PGP 9.5)是所有皮肤感觉和自主神经纤维的通用神经元标志物。它已被用于各种皮肤病的皮肤活检。PGP9.5可以识别表皮和真皮神经纤维[12,13]。

Aroni等人使用单克隆免疫球蛋白M (IgM)抗体[14]对抗单链DNA (ssDNA)，该单链DNA特异性染色凋亡细胞，并已用于白癜风中区分凋亡细胞和坏死细胞。

自主神经系统功能与细胞凋亡有关，支持白癜风中功能性黑素细胞的破坏可能是不同相互作用的致病机制的最终结果，如细胞凋亡和神经纤维/轴突[14]的积累。

我们的目的是研究神经机制或凋亡机制，或两者共同作用在全身性和节段性白癜风变异体发病中的可能作用。通过免疫组化研究PGP9.5作为白癜风的神经机制证据，ssDNA作为凋亡机制证据。

对象和方法

本研究纳入白癜风患者20例(男11例，女9例)，按临床类型分为节段(10例;男4例，女6例)、非节段性(10例;7男3女)。他们的年龄在21-35岁之间。研究包括年龄和性别匹配的20岁健康对照组。男性10例，女性10例，年龄24-45岁。

所有患者和对照组均接受病史、全身检查和局部皮损检查。获得参与研究的知情同意书，并获得当地伦理委员会的批准。

每个患者取两次活检;一个来自脱色的病变区域，另一个来自同一区域外围正常着色的皮肤。对照组的每个受试者在未暴露于阳光下的皮肤上取一个活组织。收集活检标本，用10%的福尔马林固定，直到研究开始。

采用免疫组织化学染色技术对PGP 9.5和ssDNA进行活检。

Immunohistochmemical染色

所有皮肤标本行PGP9.5和ssDNA免疫染色。免疫组化染色采用标记链霉亲和素生物素(LSAB)法，酶标链霉亲和素与生物素化二抗体反应。本方法的底物采用美国加州Carpinteria Dako®LSAB+System-HRP提供的试剂盒。纯化的小鼠PGP9.5单克隆抗体(BIOCARE MEDICAL, LLC.， PGP9.5, CM 329 AK, Concord, California, USA)作为一抗检测组织切片中的PGP9.5。纯化的口腔ssDNA单克隆抗体(Enzo life sciences, International, INC, ssDNA, mAb (F7-26)R, ALX-804-192R, Plymouth Meeting, Pennsylvania, USA)作为一抗检测组织切片中的ssDNA。切片在Streptavidin-HRP溶液(Dako®，Carpinteria, California, USA)中室温孵育1小时。随后用PBS冲洗两次，每次3分钟。应用底物-显色剂溶液(Buffererd底物- dab Chromogen, Dako®，Carpinteria, California, USA)，与组织切片孵育10分钟。随后用蒸馏水冲洗两次，时间为3分钟。将载玻片置于苏木精浴中2分钟，然后用蒸馏水冲洗2分钟。 Dehydration of the sections was done through 95% ethanol for 1 minute then 100% ethanol for 2 minutes. This was followed by clearance in xylene for 2 minutes. The sections were mounted and coverslipped. The sections became ready for examination. A light microscope (Olympus CX5Japan) was used to examine the tissue sections under different magnification.

免疫染色强度采用任意标度进行半定量评估，该标度根据染色强度从1到3进行分级:1=弱染色，2=中染色，3=强染色。三位作者阅读了每个病例的幻灯片，并在将结果应用于统计分析之前计算了每个患者发现的平均值。

统计分析

利用SPSS 15.0.1 for windows软件对收集到的数据进行修改、编码、制表和导入计算机。SPSS公司，芝加哥，IL, 2001)。给出了数据，并根据得到的每个参数的数据类型进行了适当的分析。参数数值数据的平均标准偏差(±SD)和范围。非数值数据的频率和百分比。采用学生T检验评估两研究组均数差异的统计学意义。卡方检验:用于检验两个定性变量之间的关系。Fisher精确检验:当超过20%的细胞中预期计数小于5时，用于检查两个定性变量之间的关系。Wilcoxon符号秩次检验:用于评估同一研究组两次测量的序数变量(得分)差异的统计学意义。P值:显著水平P>0.05:不显著(NS)， P< 0.05:显著(S)。

结果

在病灶活检中，3例(15%)PGP9.5阳性染色+2,17例(85%)PGP9.5阳性染色+3，而在非病灶活检中，11例(55%)PGP9.5阳性染色+1,9例(45%)PGP9.5阳性染色。病变活检显示ssDNA +2阳性12例(60%)，+3阳性8例(40%)，非病变活检显示ssDNA +1和2阳性18例(90%)，ssDNA +1和2例(10%)(表1和图1-6)。

表1。研究病例中对病变性和非病变性PGP9.5和ssDNA的描述

		N	％
Lesional PGP9.5	＋1	0	0％
	+ 2	3.	15.0%
	＋３	17	85.0%
Lesional ssDNA	＋1	0	0％
	+ 2	12	60.0%
	＋３	8	40.0%
非lesional PGP9.5	＋1	11	55.0%
	+ 2	9	45.0%
	＋３	0	0％
非lesional ssDNA	＋1	18	90.0%
	+ 2	2	10.0%
	＋３	0	0％

图1所示。1例非病变性节段性白癜风皮肤PGP9.5阳性染色(免疫组化染色，x400)。

图2。1例病变节段性白癜风皮肤PGP9.5阳性染色(免疫组化染色，x400)。

图3。1例病变性非节段性白癜风皮肤PGP9.5阳性染色(免疫组化染色，x400)

图4。1例非病变性节段性白癜风中凋亡表皮细胞+1 ssDNA阳性(免疫组化染色，x400)

图5。病变节段性白癜风病例中凋亡表皮细胞+2 ssDNA阳性(免疫组化染色，x400)。

Figure 6。病变性非节段性白癜风病例中凋亡表皮细胞+3 ssDNA阳性(免疫组化染色，x400)。

节段性白癜风病灶与非病灶皮肤PGP9.5染色强度比较，差异有统计学意义(P<0.01)。非节段性白癜风患者的皮损与非皮损性皮肤比较也发现了相似的结果，P<0.01(表2、3)。

表2。节段性白癜风病变性与非病变性PGP9.5的比较

Lesional节段PGP9.5

非病变节段PGP9.5

P

团体

＋1

+ 2

＋３

＋1

+ 2

＋３

N

％

N

％

N

％

N

％

N

％

N

％

0

0％

3.

30.0%

7

70.0%

6

60.0%

4

40.0%

0

.0%

0.004

海关

*Wilcoxon签名rank Test

表3。非节段性白癜风病变性与非病变性PGP9.5的比较

病变性非节段PGP9.5

非病变性非节段PGP9.5

P

团体

＋1

+ 2

＋３

＋1

+ 2

＋３

N

％

N

％

N

％

N

％

N

％

N

％

0

0％

0

.0%

10

100．0%

5

50.0%

5

50.0%

0

0％

0.004

海关

*Wilcoxon签名rank Test

在所有白癜风病例中，皮损性皮肤与非皮损性皮肤PGP9.5阳性差异具有高度统计学意义(85%的皮损性皮肤+3阳性，而非皮损性皮肤无阳性)p <0.0(表4)。

表4。白癜风病变性与非病变性PGP9.5的比较

Lesional PGP9.5

非lesional PGP9.5

P

团体

＋1

+ 2

＋３

＋1

+ 2

＋３

N

％

N

％

N

％

N

％

N

％

N

％

0

0％

3.

15.0%

17

85.0%

11

55.0%

9

45.0%

0

0％

0.0001

海关

*Wilcoxon签名rank Test

损伤性和非损伤性皮肤的ssDNA也有高度统计学差异(60%的损伤性皮肤显示+2染色，而非损伤性皮肤只有10%)，(p <0.01)(表5)。

表5所示。白癜风病变与非病变ssDNA比较

Lesional ssDNA

非lesional ssDNA

P

团体

＋1

+ 2

＋３

＋1

+ 2

＋３

N

％

N

％

N

％

N

％

N

％

N

％

0

0％

12

60.0%

8

40.0%

18

90.0%

2

10.0%

0

0％

0.0001

海关

*Wilcoxon签名rank Test

病变性节段性白癜风与非病变性节段性白癜风比较，ssDNA差异有统计学意义(P<0.01)，非节段性白癜风组的结果相似(表6、7)。

表6所示。节段性白癜风病变性与非病变性ssDNA比较

病变节段l ssDNA

非损伤节段ssDNA

P

团体

＋1

+ 2

＋３

＋1

+ 2

＋３

N

％

N

％

N

％

N

％

N

％

N

％

0

0％

10

100．0%

0

0％

10

100．0%

0

0％

0

0

0.002

海关

*Wilcoxon签名rank Test

表7所示。非节段性白癜风病变性与非病变性ssDNA比较

损伤性非节段ssDNA

非损伤性非节段性ssDNA

P

团体

＋1

+ 2

＋３

＋1

+ 2

＋３

N

％

N

％

N

％

N

％

N

％

N

％

0

0％

2

20.0%

8

80.0%

8

80.0%

2

20.0%

0

0％

0.004

海关

*Wilcoxon签名rank Test

比较节段性白癜风和非节段性白癜风病变皮肤PGP9.5染色强度，差异无统计学意义。节段性白癜风与非节段性白癜风病变皮肤ssDNA比较，差异有统计学意义(P<0.01)(表8、9)。

表8所示。节段性与非节段性白癜风病变PGP9.5的比较

		类型				P *	团体
		节段性白癜风		非节段性白癜风
		N	％	N	％
lesional PGP9.5	＋1	0	.0%	0	.0%	.211 * *	NS
	+ 2	3.	30.0%	0	.0%
	＋３	7	70.0%	10	100．0%

表9所示。节段性与非节段性白癜风病变ssDNA的比较

		类型				P *	团体
		节段性白癜风		非节段性白癜风
		N	％	N	％
lesional ssDNA	＋1	0	.0%	0	.0%	措施* *	海关
	+ 2	10	100．0%	2	20.0%
	＋３	0	.0%	8	80.0%

节段性白癜风与非节段性白癜风非病变性皮肤PGP9.5和ssDNA染色强度比较，差异无统计学意义(表10)。

表10。非病变节段性白癜风与非节段性白癜风PGP9.5、ssDNA比较:

		类型				P *	团体
		节段性白癜风		非节段性白癜风
		N	％	N	％
非lesional PGP9.5	＋1	6	60.0%	5	50.0%	1.00 * *	NS
	+ 2	4	40.0%	5	50.0%
	＋３	0	.0%	0	.0%
非lesional ssDNA	＋1	10	100．0%	8	80.0%	.474 * *	NS
	+ 2	0	.0%	2021年版权燕麦。所有权利reserv 2	20.0%
	＋３	0	.0%	0	.0%

讨论

白癜风的发病机制涉及多种理论[1,3-5]。在节段性白癜风中，神经元机制表明，中枢神经系统通过产生抗炎的儿茶酚胺来抑制过度的炎症反应，炎症是由神经肽的分泌局部调节的。因此，神经元假说可能被解释为炎症的旁观者效应，而不是引发黑色素细胞凋亡的触发因素。然而，节段性白癜风的病理生理机制仍存在争议。

我们对节段性和非节段性白癜风以及神经元和凋亡理论在两者发病机制中的作用进行了研究，旨在了解节段性白癜风是否是单一的神经元理论疾病，还是有其他病理生理机制导致了这种临床表现。

我们的发现与Aroni的发现一致et al .,[14]表明，皮损性与非皮损性PGP9.5阳性差异有统计学意义。然而，与刘的不同et al .,报告18例白癜风患者皮损性与非皮损性PGP 9.5阳性神经纤维差异无统计学意义．这可能是由于疾病持续时间和疾病活动度的差异，我们患者的疾病持续时间为1.3 - 7.6年，与Liu相比et al .,他们的研究组病程从2个月到38年不等。此外，他的患者中有超过30%(18例患者中有6例)患有活动性白癜风，在研究前3个月出现新的病变，而我们的研究中所有患者都选择了稳定型白癜风。可能白癜风的稳定性越高，病变皮肤中PGP9.5阳性的神经纤维越少，疾病持续时间越长，病变皮肤中PGP9.5阳性的神经纤维越多，这意味着随着时间的推移，先前受影响的神经可能有机会部分再生和恢复一些失去的功能。

就我们目前所知，之前没有对节段性白癜风和PGP9.5的研究支持或反对我们的发现。在所有白癜风病例中，皮损性和非皮损性PGP9.5差异均有统计学意义。这表明自主/感觉神经纤维在节段组中更多地直接参与了白癜风的发病过程，这与神经元机制在节段性白癜风发病过程中发挥作用的观点一致。

病变节段性和非节段性白癜风患者的PGP9.5与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)，而Al’abadie等人12例白癜风患者的病变和边缘皮肤乳头真皮层[17]与对照组比较差异无统计学意义(P<0.01)。同样，这种差异可能归因于疾病活动度的差异，在他们的研究中，58%的患者是活跃的。这些发现可能反映出病变边缘的真皮层有一种更具破坏性的机制，也可能反映出病变皮肤的真皮层有一种再生新纤维/轴突的尝试，特别是在节段性白癜风病例中。

我们还检测到PGP9.5在节段性白癜风和非节段性白癜风的皮肤病变方面没有显著差异。节段性白癜风和非节段性白癜风都有相同的神经理论，但细胞凋亡在非节段性白癜风中更为明显，因为节段性白癜风和非节段性白癜风的病变皮肤差异有统计学意义，且在非节段性白癜风中更为明显。

我们的结果显示，在所有白癜风病例中，病变性(节段性和非节段性)皮肤与非病变性皮肤之间的ssDNA差异具有统计学意义，而非病变性节段性和非节段性白癜风患者与对照组之间的差异具有统计学意义(p>0.05)。我们无法将我们的结果与他人进行比较，因为之前没有研究比较过ssDNA在损伤性和非损伤性皮肤中染色强度的意义。我们的研究结果支持细胞凋亡在两种白癜风发病机制中的作用。

在我们所有的白癜风病例中，节段性和非节段性白癜风病变均完全无黑色素细胞，这与两组病变部位(病变与非病变)ssDNA染色差异具有统计学意义是一致的。因此，我们可以认为，凋亡机制在白癜风的诱导中起主导作用，而在白癜风的诱导区域中，其他机制可以增强凋亡机制。在所有病例中，ssDNA作为一种凋亡标志物的高强度和中度染色强调了这种凋亡机制的重要性。

在我们的研究中，节段性白癜风和非节段性白癜风病变皮肤ssDNA染色强度差异有统计学意义，非节段性白癜风病变皮肤ssDNA染色强度更高。这可能是由于凋亡理论在非节段性白癜风中发挥的作用高于节段性白癜风。另一方面，节段性白癜风通过凋亡的神经机制变得更加活跃，以维持凋亡细胞与正常细胞之间的平衡。这意味着任何来自干细胞的新再生或转化的黑色素细胞，变得更容易受到凋亡破坏，这解释了节段性白癜风的抗性过程。然而，就我们目前所知，之前并没有对节段性白癜风和非节段性白癜风的ssDNA进行比较来支持或反对我们的发现。

最后，基于皮肤PGP 9.5阳性神经纤维和ssdna阳性(凋亡)细胞的增加，我们得出并支持自主神经系统功能与凋亡之间可能存在关系，支持白癜风中功能性黑素细胞的破坏可能是不同相互作用的致病机制的最终结果，如细胞凋亡和神经纤维/轴突产物的积累。神经理论通过诱导细胞凋亡在节段性白癜风中起主导作用。因此，节段性白癜风不是一个单一的理论实体，其发病机制的活跃神经成分是通过另一个理论(凋亡)起作用的。

尽管节段型罕见，但仍需要在大规模人群中开展进一步研究，以找出导致该疾病的确切事件顺序，使其呈现出与非节段型不同的分布和病程。

参考文献

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