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摘要

槲寄生专辑其内生真菌种类凝集素具有抗氧化、抗菌、抗炎和抗癌活性。目前的调查是为了在体外(通过酶抑制)和在活的有机体内内生真菌的抗糖尿病活性，链格孢属物种n -乙酰半乳糖胺，54 kDa蛋白凝集素在四氧嘧啶诱导的大鼠糖尿病中的作用。内生真菌凝集素以400 mg/kg体重(BW)剂量口服四黄化小鼠(血糖>200 mg/dl)。研究了各种糖尿病参数，并与未治疗的小鼠进行了比较。此外，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)研究了多肽的性质和鉴定。经血凝、PAS染色证实，该凝集素为n -乙酰半乳糖胺，64kda糖蛋白。内生真菌凝集素对3种重要的糖尿病酶α-淀粉酶(85.26±1.25)、α-葡萄糖苷酶(93.41±1.27)和蔗糖酶(81.61±1.05)均有较强抑制作用。n -乙酰半乳糖氨基选举素治疗糖尿病大鼠14 d后体重较标准药(9.01%)显著增加(8.50%)。经凝集素处理的大鼠胰腺组织、胰管、胰壁、腺泡、血管、毛细血管、胰岛囊、胰岛细胞均按格式再生，且有恢复。凝集素治疗糖尿病大鼠血清尿素(43.7±5.8)、肌酐(0.32±0.01)、胆固醇(103.54±2.13)、甘油三酯(124.68±2.49)、谷氨酸转氨酶(138)、丙氨酸转氨酶(57)水平均较标准药物降低，证实了糖尿病大鼠的健康状况。研究表明，内生真菌凝集素可通过抗炎作用对β细胞损伤起保护作用，并可通过刺激导管干细胞促进细胞再生。然而，关于凝集素作为糖尿病辅助治疗的更多细节还需要进一步的实验研究。本研究结果表明，内生真菌凝集素具有较强的抗糖尿病活性，可使糖尿病大鼠的细胞或组织再生。

关键字

内生菌，凝集素，体内抗糖尿病，组织病理学，血清分析

简介

植物内生真菌是一种重要的新型天然生物活性产品资源，在农业、医药和食品工业中具有潜在的应用价值[1-3]。在过去的二十年中，人们从内生真菌中成功地发现了许多具有抗菌、杀虫、细胞毒和抗癌活性的生物活性化合物。这些活性化合物可分为生物碱、萜类、类固醇、醌类、木脂素、酚类和内酯类[4,5]。

一种非肽真菌(PseudomassariaSp .)代谢物作为胰岛素模拟物，与胰岛素不同，在消化道中不被破坏，可口服，并导致显著降低血糖水平[6]。内生真菌提取物具有抗糖尿病活性[7,8]。

植物凝集素是一种结合在哺乳动物细胞质膜上的特定碳水化合物基团上的蛋白质，可诱导多种生物效应。植物凝集素具有多种抗糖尿病机制，目前已有较多报道[10-12]。

目前，糖尿病几乎已成为严重的公共卫生问题，特别是在发达国家已成为全球发展的主要威胁[13,14]。这说明了更多替代有效的抗糖尿病药物及其系统研究对糖尿病管理的必要性和重要性。

本研究旨在研究植物内生真菌凝集素在体外而且在活的有机体内并对四氧嘧啶诱导的大鼠凝集素进行了表征。研究了凝集素处理四氧嘧啶诱导的糖尿病大鼠的高血糖、高血脂及组织病理结构的再生。这是对内生植物素抗糖尿病活性的一种尝试在活的有机体内．

材料与方法

内生真菌收集，链格孢属品种和批量生产

内生真菌，链格孢属该物种采自印度卡纳塔克邦图马库鲁市Sira路Shridevi工程技术学院生物技术系的砧木培养，在CzapekDox肉液中进行大规模培养，室温(26±2℃)培养8天。

内生真菌中凝集素的分离纯化链格孢属物种

链格孢属通过序贯纯化方案获得Araujo植物凝集素等．[15]和Rocha等．[12]。将粉末状真菌菌丝体垫(10 g)悬浮在0.15 M NaCl (100 mL)中。磁搅拌器均质(4℃16h)，纱布过滤，离心(4000xg, 15min)，以上清液(粗提物)为起始原料。粗提物中的可溶性蛋白用硫酸铵分离，30-60%的沉淀部分(30-60 F)对蒸馏水进行透析(3500 Da切断膜，4°C)(2小时)。将30-60 F (11 mg蛋白质，血凝活性)应用于cm -纤维素层析柱(5.2 cm x 1.6 cm)，平衡于10 mM柠檬酸磷酸盐缓冲液pH 5.5，流速为20 mL/h。未被吸收的蛋白用缓冲液洗脱，直到280 nm处吸光度< 0.05;用0.5 M NaCl洗脱内生真菌凝集素。根据Lowry法测定蛋白质浓度等．[16]以牛血清白蛋白为标准品。

凝集素鉴定试验

血凝和血凝抑制试验:采用2倍连续稀释[17]法在标准微量滴定板中进行血凝试验。取50 ml人红细胞(A +ve, B +ve, AB +ve, O +ve)悬液与50 ml连续稀释的凝集素混合，在~25°C孵育30 min后目测凝集情况。血凝活性单位(HU)表示为显示完全凝集的凝集素的最高稀释度(滴度)的倒数。为了确定凝集素的糖结合特异性，采用不同的糖，包括d -半乳糖、d -甘露糖、d -葡萄糖、麦芽糖、n -乙酰半乳糖胺，测试它们抑制凝集素诱导的血凝的能力。将每种碳水化合物在10mm至100mm范围内连续稀释两倍，并溶解在0.15 M NaCl溶液中，与等体积的含有4单位血凝活性的提取物混合。混合物在室温(26±2℃)下孵育30分钟，之后加入4%的人红细胞悬浮液，整个孵育1小时。测定产生完全抑制血凝作用的低碳水化合物浓度。

周期性酸希夫染色(PAS):PAS染色采用轻微修改的方法[18]进行。在NATIVE-PAGE上分离的蛋白质在7.5% (v/v)乙酸中浸泡30分钟，然后在4°C下用0.2% (w/v)周期酸浸泡1小时。除去周期酸溶液，加入席夫试剂，在4℃下孵育1小时。染红粉红色的糖蛋白条带可见。除去PAS试剂，凝胶在7.5%的乙酸中浸泡1小时，然后在水中保存。

蛋白斑点的凝胶消化:蛋白质消化过程如前所述[19]。从染色的(SDS-PAGE)凝胶中切除斑点并用CH清洗_3.CN: H₂O (1:1, v/v)含25mm碳酸氢铵去除染料。凝胶塞用100%乙腈脱水，真空干燥，在20mm碳酸氢铵中加入10 μg/ml猪胰蛋白酶20 μl, 37℃孵育过夜。产生的胰蛋白酶片段通过扩散洗脱到CH中_3.CN: H₂O (1:1 v/v)和0.5%三氟乙酸。声波浴被用来促进扩散。提取液真空干燥，颗粒溶解于CH中_3.CN: H₂O (1:1 v/v)和0.1%三氟乙酸。提取的胰蛋白酶肽进行质谱分析。

在体外抗糖尿病酶活性

α-淀粉酶抑制活性测定:利用淀粉体系[20]研究了内生真菌凝集素对α-淀粉酶活性的影响。将FRB(1.5%)在烧杯中加入25 mL 4%的马铃薯淀粉搅拌混合;在淀粉溶液中加入100 mg α-淀粉酶，剧烈搅拌，37℃孵育60 min。孵育结束后，加入0.1 MNaOH终止酶活。将混合物离心(3000 g;15 min)，测定上清液中葡萄糖含量。

α-葡萄糖苷酶抑制活性测定:按Honda和Hara[21]法测定α-葡萄糖苷酶抑制活性。将酶液(10 μL)和不同浓度的样品乳剂(10.50 μL)在37℃下孵育10 min，以pH 6.0的马来酸缓冲液配制成210 μL的体积。加入200µL的2 mM开始酶反应p-硝基苯-á-d-glucopyranoside溶液，在37°C下孵育30分钟。在沸水浴中处理5分钟，终止反应。加入1.0 Ml 0.1 M的磷酸氢二钠溶液后，吸收释放p-硝基苯酚在400 nm处读取。

蔗糖酶抑制活性测定:的影响链格孢属按照Honda和Hara[21]的方法测定了植物凝集素对蔗糖酶活性的影响。将酶液(10 μL)和不同浓度的样品乳剂(10.50 μL)在37℃下孵育10 min，加入马来酸缓冲液(pH 6.0)使其体积达到200 μL。加入100 μL蔗糖溶液(60 mM)开始酶反应。30min后，加入200 μL 3,5-二硝基水杨酸试剂，在沸水浴中处理5min，在540 nm处测定吸光度。用以下公式计算抑制活性百分比:

%抑制= (AbsControl-AbsSample) x100/Abs Control

在哪里Abs控制对照反应的吸光度(包含除测试样品外的所有试剂)和Abs的样本是测试样品的吸光度。使用未经处理的酶溶液作为对照。所有实验均重复进行三次。

葡萄糖扩散法

Gallagher描述的方法et al。用[22]评价内生真菌凝集素不同溶剂提取物对葡萄糖运动的影响在体外．这在体外模型由透析管(6 cm x 29.31 mm) (Himedia-LA393-5MT-2010)组成，其中加入6 ml植物提取物和2 ml 0.15 M NaCl，含1.65 mm d -葡萄糖。透析管两端密封，置于含有45 ml 0.15 M NaCl的离心管中。将试管放置在摇轨器水浴中，在37°C下孵育3小时。葡萄糖运动到外部溶液中。在没有植物提取物的情况下，测量透析管内葡萄糖浓度并进行对照试验。葡萄糖氧化酶试剂盒采用酶促法测定葡萄糖浓度。所有试验均进行三次重复，结果以均数±标准差表示。

在活的有机体内实验

动物种类的选择:选用8-10周龄、体重150 - 200 g的健康白化wistar雄性大鼠在活的有机体内抗糖尿病的研究。大鼠采集自印度卡纳塔克邦图姆库尔市Sree Siddaganga药学院动物馆，研究在Sree Siddaganga药学院药学系进行。大鼠被安置在温度为25±2ºC的动物室中，并免费提供标准食物和纯净水随意．动物室按12小时亮和12小时暗的时间表进行调节。

毒性研究(LD)₅₀)：基于的结果在体外抗糖尿病活性，内生真菌链格孢属选择物种凝集素进行动物研究。用0.9% v/v的冷生理盐水溶液溶解，制备干燥浓缩柱馏分悬浮液进行处理。进行了内生真菌的毒性研究链格孢属按照改进的方法Lorke[23]对凝集素进行分离。口服给药最大剂量为1200 mg/kg体重。将动物分为4组，每组5只。第1组:凝集素- 400 mg/kg体重，第2组:凝集素分数- 800 mg/kg体重，第3组:凝集素- 1200 mg/kg体重。在24小时内观察大鼠的临床体征和毒性症状，如行为改变和死亡率。所有程序都按照机构动物伦理委员会(IAEC)的规定进行。致死剂量- 50 (LD₅₀)，然后计算为最低致死剂量与高非致死剂量乘积的平方根。

糖尿病的实验诱导

在给药前，动物禁食16 - 18小时，并自由饮水。一水合物四氧嘧啶是一种环尿素类似物，具有独特的特性，可通过单剂量对朗格汉斯胰岛β细胞的特定细胞毒性作用产生慢性实验性糖尿病。近70只大鼠腹腔注射一水四氧嘧啶120 mg/kg体重，溶解于0.9% v/v冷生理盐水[24]诱导糖尿病。在接下来的24小时内，将大鼠放在笼子里的5%葡萄糖溶液瓶中，以防止低血糖[25]。在约72小时的观察期后，空腹血糖水平高于300 mg/dl的大鼠被认为患有糖尿病。

实验协议:观察72 h后，空腹血糖高于300mg /dl的大鼠被认为是糖尿病大鼠，分为5组，每组10只。

将夜间禁食的动物随机分为5组:

组1:	NC:	正常对照组，仅口服生理盐水(2.0 ml)。
组2:	DC:	糖尿病控制
第三组:	STD:	参考药物格列本脲治疗糖尿病大鼠，剂量为0.5 mg/kg体重。
第四组:	EAsL:	用提取的凝集素治疗糖尿病大鼠链格孢属品种，口服剂量为400毫克/公斤体重。

用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶反应条带(Dextrostix, Bayer Diagnostics)和Accu-chek血糖仪估计空腹血糖水平。每隔1天、7天和14天，通过切断尾巴尖端收集血液样本。血液结果报告为mg/dl。血糖水平以mg/dl表示为平均值±SEM。第14天测定大鼠体重、血清胆固醇和血清甘油三酯。在实验过程中，所有的老鼠都可以随时免费获得标准的鼠粮和水。按公式计算体重和血糖变化;

体重变化(bw) (%) =	体重为14th天-初始体重)x 100
	初始体重

%血糖变化=	(葡萄糖浓度14th天-空腹血糖1圣天)x 100
	空腹血糖1圣一天

数据采用方差分析，并与对照组进行多重比较。p<0.05或<0.05为显著值。

血脂

在14页末尾^th实验期第1天，经眶后丛Eppendorf管采血。采用REMI-24型离心机在4ºC下离心，分离血浆，取血清。血脂即,在自动分析仪Olympus AU 400上测量血清胆固醇和血清甘油三酯。

组织病理学

研究内生植物素对胰腺细胞结构的影响具有重要意义。在14页末尾^th当天，所有动物都被氯仿蒸汽麻醉致死，并切除胰腺，用冰冷的生理盐水冲洗。将部分组织用10%福尔马林固定，切成5 μm厚的切片，苏木精-伊红染色，进行组织病理学观察。

内生植物素对生化指标的影响

正常对照组、糖尿病诱导对照组、凝集素处理大鼠和标准药物处理大鼠血液样本在4℃下以2500 g离心15分钟(REMI, c24冷却离心机，印度)。取血清，在化学自动分析仪[12]中用酶比色法测定尿素、肌酐、谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)水平。

抗糖尿病素的MALDI-TOF-MS分子表征

将干燥的提取物溶于0.1%三氟乙酸(TFA) 10 μl中，用Zip Tip C18针尖纯化后进行质谱分析。洗脱液与10 mg ml-1的2,5 -二羟基肉桂酸(DHB)在50%乙腈和0.1% TFA中混合，在样品板上点样，并干燥用于MALDI-TOF-MS分析。MALDI-TOF-MS分析使用4700蛋白质组学分析仪(Applied Biosystems, Framingham, MA, USA)进行，配备ND:YAG激光器(355 nm)，脉冲3-7 ns，发射速率200 Hz。在反射正离子模式下进行MALDI-TOF-MS分析。用于MS和MS/MS分析的离子源加速电压分别设置为20和8 kV，使用4000系列软件的内部算法分别检测峰值，MS的信噪比参数设置为30，在印度班加罗尔的IISc进行分析[26]。

结果

从3个部位(茎、叶和果)鉴定出5种不同的内生真菌槲寄生专辑[26]来自我们之前的报道。的链格孢属所有使用的三个部分都存在物种。本研究以叶片内生真菌为主链格孢属通过凝集方法证实其含有25 mM的血凝蛋白，并证实该凝集素是d -葡萄糖和d -半乳糖胺特异性的。我们选择了d -半乳糖胺electin，在分子量测定中显示了64 kDa[26]的单条带。在PAS的NATIVE-PAGE中，用Schiff试剂将凝集素染色为紫粉红色，确认为糖蛋白凝集素。

凝集素对葡萄糖穿过透析膜进入外部溶液有显著的抑制作用。凝集素在透析膜内的葡萄糖扩散为41.37±0.59，增量运动为12.54±0.87%(表1)。

表1。凝集素提取物对透析管内葡萄糖扩散3h的影响

提取	葡萄糖扩散到透析膜外	运动增加(%)
植物血凝素	41.37±0.59	12.54±0.87

*重复实验三次，数据为三次重复的平均值±标准差*p<0.01(请显示凝集素效应的显著数据)

采用α-淀粉酶星型重构体系对凝集素的α-淀粉酶抑制活性进行了研究，抑制活性为85.26±1.25。凝集素对α-葡萄糖苷酶有显著抑制作用，抑制系数为93.41±1.27。凝集素对α-葡萄糖苷酶抑制活性的显著增强。凝集素中蔗糖酶受抑制程度较高(81.61±1.05%)(图1)。

图1所示。凝集素α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶及蔗糖酶活性的影响

毒性研究(LD)₅₀）

真菌内生菌，链格孢属采用物种凝集素经口给药的方法对大鼠进行毒性研究。真菌凝集素在1200 mg/kg体重的大鼠体内没有观察到毒性。我们还研究了毒性的临床体征和症状，如行为变化，包括运动活动和触觉敏感性，以及24小时内的死亡率，也记录了给药48小时后的死亡率。内生真菌凝集素没有引起大鼠死亡或任何异常行为改变，存活率为100%。在试验浓度下，内生凝集素被认为是无毒的。

对体重的影响

正常对照组体重有轻微增加，这可能是正常生长造成的。糖尿病对照组大鼠体重降低5.28%。糖尿病大鼠经标准药物格列比奈酰胺治疗后体重增加9.01%。经凝集素处理的大鼠体重显著增加8.50%(表2)。

表2。凝集素提取物对糖尿病大鼠平均体重的影响

集团	剂量(mg/kg体重)	平均体重(gm)
		第一天	第七天	第14天	bw变化(%)
组1:	生理盐水	192.34±3.21	203.54±3.05	209.53±5.31	8.20
组2:	120毫克/公斤体重	198.14±4.52	181.56±2.82	175.81±4.49	-11.26
第三组:	0.5 mg/kg体重	203.03±3.44	210.23±3.61	221.33±5.02	9.01
第四组:	40毫克/公斤体重	193.05±3.09	199.59±4.14	209.47±4.69	8.50

*重复实验3次，数据为3个重复的平均值±标准差注:1组:正常对照组，2组:糖尿病对照组，3组:格列本脲标准组治疗糖尿病大鼠，4组:凝集素提取物治疗糖尿病大鼠*p<0.01(请显示凝集素作用的显著数据)

内生真菌凝集素的降糖作用

的链格孢属真菌凝集素具有显著的降糖作用。14日血糖下降60.76%^th每天400 mg/kg浓度。结果表明，与标准药物格列本脲相比，凝集素处理后血糖水平降低64.04%。治疗最后一天血糖分别为:正常对照组101.33±4.46 mg/dl、糖尿病对照组386.44±10.48 mg/dl、标准药格列本脲组115.34±5.45 mg/dl、凝集素组129.62±9.10 mg/dl(表3)。

表3。凝集素提取素对糖尿病大鼠血糖水平的影响

集团	剂量(mg/kg体重)	血糖浓度(mg/dl)
		第一天	第七天	第14天	血糖变化(%)
组1:	生理盐水	98.40±5.01	96.14±4.50	101.33±4.46	2.97
组2:	120毫克/千克体重	323.03±09.10	352.14±11.50	386.44±10.48	19.62
第三组:	0.5 mg/kg体重	320.80±10.45	209.46±09.52	115.34±05.45	-64.04
第四组:	400毫克/公斤体重	OAT版权所有。版权所有	215.46±8.41	129.62±09.10	-60.76

*每个实验重复3次，数据为3个重复的平均值±标准差注:组1:正常对照组，组2:糖尿病对照组，组3:标准格列本脲治疗的糖尿病大鼠，组4:凝集素提取物治疗的糖尿病大鼠*p<0.01(请显示凝集素作用的显著数据)

内生植物素对生化指标的影响

正常对照、糖尿病(诱导)对照、凝集素处理和标准药物处理的大鼠血液样本在4°C下以2500 g离心15分钟(REMI, c24，冷却离心机，印度)。获得血清，尿素、肌酐、天门冬氨酸转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)水平在化学自动分析仪(Rocha等, 2013)。

治疗14天后，大鼠被要求检测血清胆固醇和血清甘油三酯，并注意到两者的不同水平。凝集素处理大鼠血清胆固醇(mg/kg bw)和血清甘油三酯(98.51±2.02)分别为90.04±0.92和90.04±0.92。糖尿病患者血清胆固醇和甘油三酯分别为153.26±1.45和176.64±2.62。凝集素处理后的糖尿病大鼠血清胆固醇(103.54±2.13)和血清甘油三酯(124.68±2.49)降低，而标准格列苯烯酰胺处理后的血清胆固醇和血清甘油三酯分别为98.44±1.28和110.44±2.02(图2)。

*每个实验重复3次注:第1组为正常对照组，第2组为糖尿病对照组，第3组为格列本脲标准组，第4组为凝集素提取物组。*p<0.01(请显示凝集素效应的显著数据)

图2。凝集素提取物对糖尿病大鼠第14天血脂谱的影响

组织病理学

经凝集素处理的大鼠细胞结构分化良好。正常对照组胰岛、腺泡、毛细血管、胰管细胞分布正常。正常对照组腺泡细胞、朗格汉斯岛和血管数量、质地良好，组织良好，与结缔组织连接良好。除了红细胞外，还发现了2-3种可区分的胰岛细胞。未见炎性胰腺及血管。糖尿病诱导大鼠出现明显异常，可见明显血管炎症和毛细血管破裂。胰腺叶、腺泡、胰岛、外分泌腺、结缔组织和毛细血管衰竭，胰岛和胰管细胞数量减少。糖尿病作用导致胰岛畸形，呈淀粉样和萎缩。在内分泌和外分泌中，红细胞间分散(图3A-3B)。

图3。大鼠胰腺组织病理学概述，A)糖尿病控制大鼠炎症血管和胰岛细胞损伤B)凝集素处理的大鼠胰腺细胞(bv -血管，pd -胰管，isl -胰岛)

标准药物格列本脲治疗糖尿病大鼠胰腺导管、腺泡和结缔细胞再生。小叶间隔、血管壁和胰管与正常对照组一样正常。可见胰岛、朗格汉斯细胞、腺泡细胞、胰管细胞分布均匀，均正常(图4A-4B)。内生真菌，链格孢属植物凝集素治疗糖尿病大鼠对氧化应激对胰腺细胞的损伤有明显的抑制作用。经凝集素处理的大鼠胰腺结缔组织和细胞、腺泡、血管和毛细血管、胰管及其壁、胰岛包膜的数量、质地和分布规律良好。可区分胰岛细胞个体，可见2-3种胰岛细胞与RBC细胞并存。凝集素处理后的糖尿病大鼠胰腺组织学结构正常，与正常对照相似(图5A-5F)。

图4。四氧嘧啶诱导的大鼠胰腺组织显微视图，A) facini细胞壁损伤，B)胰岛细胞及其壁破裂，C)朗格汉斯胰岛和外分泌细胞衰竭，D)朗格汉斯胰岛毛细血管破裂，E)炎性血管，F)胰管和血管周围结缔组织在4µm切片内衰竭

图5。凝集素提取物对大鼠胰腺组织影响的显微视图，A)正常腺泡细胞，B)胰岛细胞和血细胞的恢复，C)改善胰管和血管周围的结缔组织，D)恢复血管和正常结缔组织E)搭建的朗格罕血管和胰岛，F)结缔组织在4µm切片中正常流动

图6。用内生真菌凝集素治疗14天后，糖尿病大鼠血清尿素(A)和肌酐(B)水平*p<0.01(请显示凝集素作用的显著数据)

图6清楚地显示了四氧嘧啶诱导的糖尿病大鼠血清中不同水平的尿素和肌酐(肾功能标志物)明显升高。治疗14天后尿素和肌酐水平明显下降。凝集素(40 mg/kg)可使大鼠血清尿素和肌酐水平分别降低15.9%和0.08%。

凝集素处理四氧酮诱导的糖尿病大鼠，40 mg/kg处理后血清AST和ALT显著降低。凝集素处理大鼠的AST和ALT分别降低了26%和5%(图7和8)。

图7。用内生真菌凝集素治疗14天后，糖尿病大鼠血清曲霉转氨酶水平*p<0.01(请显示凝集素作用的显著数据)

图8。用内生真菌凝集素治疗14天后，糖尿病大鼠血清丙氨酸转氨酶水平*p<0.01(请显示凝集素作用的显著数据)

的MALDI-TOF-MS分析链格孢属物种凝集素中存在8种不同的多肽，其中7种肽强度最大。凝集素的肽指纹图谱链格孢属物种被鉴定为核糖体失活蛋白相当商美国．7个肽分别为2100.09、1716.86、1365.72、1838.95、893.51、2329.15、1179.65、1765.81，并有匹配肽。所鉴定的蛋白质与商美国据报道，它们属于核糖体失活蛋白家族，具有抗病毒活性。

讨论

从内生真菌中分离出的凝集素，链格孢属种槲寄生专辑以血凝为特征，它是我们早期的64 kDa凝集素，显示出非常有效的重要糖尿病酶抑制剂即,-淀粉酶报告是上述文献的确证结果。葡萄糖扩散的结果与其他提取物在同一模型体系中对葡萄糖运动的抑制作用和抑制葡萄糖扩散的能力进行了验证在体外方法采用不同植物提取物。

一些抗糖尿病植物可能通过刺激β细胞的功能或数量，增加胰岛素的释放来发挥作用。在其他一些植物中，这种效应是由于酶活性降低导致血糖合成降低。在其他植物中，这种活性是由于碳水化合物吸收缓慢和葡萄糖转运抑制[31]。

α-淀粉酶负责将膳食淀粉水解成麦芽糖，麦芽糖在吸收前分解成葡萄糖。Sinceá-amylases在人和动物的淀粉同化中起着重要作用，食物或植物提取物中这种抑制剂的存在可能会导致淀粉消化受损[32]。α-淀粉酶抑制剂可能是一种有价值的新型治疗药物。

α-葡萄糖苷酶在许多生物过程中起着至关重要的作用，包括可食用碳水化合物的分解，也参与了多种代谢疾病，如糖尿病[34]。因此，有效和选择性的葡萄糖苷酶抑制剂有许多有趣的潜在应用，特别是在治疗糖尿病[34]。α-葡萄糖苷酶是位于肠细胞刷状表面膜的葡萄糖苷酶之一，是消化碳水化合物的关键酶。α-葡萄糖苷酶抑制剂阻断小肠内酶的作用，限制低聚糖转化为胃肠道吸收所必需的单糖的速率。餐后葡萄糖峰值可因葡萄糖吸收延迟而减弱。α-葡萄糖苷酶抑制剂的主要好处是降低餐后血糖水平和餐后葡萄糖水平的总范围[35]。

用凝集素治疗四氧酮诱导的大鼠，14 d后体重、血糖、血脂及胰腺组织学特征均恢复正常。随着糖尿病进展，大鼠体重逐渐下降。凝集素处理后大鼠体重显著增加，结果与Ahmed的研究结果相关等．[37]和Channabasava等．[38](未发布数据)。

萨拉瓦南等．[39]和Quiong等．[40]已报道四氧嘧啶诱导的糖尿病大鼠出现高血糖和高血脂。Marles和Fornsworth[41]和Grower等．[42]使用植物提取物降低血糖水平。治疗14 d后，内生植物素具有显著的高血糖和抗高血糖活性。Harikiran也报告了类似的结果等．[43]与木棉melabaricum, Tyagi等．[44]与Anacyclus除虫菊, Channabasava等．[38]与桑micranthus提取(未发布的数据)。凝集素从中分离出来的凝集素荨麻属pilulifera种子也表现出类似的活性[45]。在高脂血症中，血清甘油三酯在I型糖尿病[46]患者肾脏疾病的发生发展中起重要作用。脂代谢失活和紊乱是糖尿病[47]的重要决定因素。

通过观察血清胆固醇和血清甘油三酯的升高，凝集素处理的糖尿病大鼠高脂血症参数显著降低。凝集素显示出类似的活性，梁注意到等．[48]与猴头菌属erinaceus．

四氧嘧啶破坏胰岛β细胞，使血糖升高，蛋白质含量降低，胆固醇和甘油三酯升高。在几乎所有的抗糖尿病活动中，常使用四氧嘧啶，与糖尿病患者[49]相似。四氧嘧啶产生氧化还原电位并形成超氧自由基，这些增加的胞质钙浓度迅速破坏β细胞。糖尿病诱导的大鼠通常表现为胰岛细胞数量减少、细胞损伤和细胞死亡[38,51]。在四氧嘧啶诱导的大鼠中，血管变厚、透明化，引起缺氧，导致变性、坏死[52]的改变，胰腺结构紊乱，胰岛素产生细胞耗损导致结构和功能改变[38,53]。

内生真菌凝集素诱导四氧嘧啶诱导大鼠胰腺、腺泡、血管、毛细血管、胰岛胶囊和细胞的结缔组织、导管和壁的再生，并改变其组织、数量、质地和分散[38,54]。凝集素还表现出β细胞再生和血糖下降[38]。经凝集素处理的糖尿病大鼠尿素和肌酐水平明显降低。我们的结果与Rocha最近的报道一致等．[12]和Omara等．但是他们使用了不同的植物次生代谢物。

经凝集素处理的大鼠AST和ALT显著降低，证明其健康状况良好。我们的结果与Mansour的结果一致等．[56]和Rocha等．[12]，他们通过使用不同的植物代谢物来减少这些。糖尿病诱导大鼠血清AST、ALT水平降低是凝集素作用的结果。肝脏问题或疾病是世界范围内的一个高健康问题，当细胞和线粒体提示损伤时，细胞内局部标记酶如AST和ALT释放到血液中，表明肝细胞损伤[57]。在MALDI-TOF-MS中鉴定出分子量为64 kDa的n -乙酰半乳糖氨基电子素，与核糖体失活蛋白相似商美国．在凝集素中鉴定出7个多肽，分别为，2100.09,1716.86,1365.72,1838.95,893.51,2329.15,1179.65,1765.81，与凝集素II族相似，存在于p .美国并具有核糖体失活和抗病毒活性。现在我们在这里报道，同样的凝集素在四氧嘧啶诱导的糖尿病大鼠中表现出强烈的抗糖尿病活性。

结论

凝集素对三种糖尿病酶均有抑制作用在体外四氧嘧啶诱导的大鼠组织病理结构的再生在活的有机体内通过改变胰腺导管、β细胞、胰岛、腺泡等组织的结构和功能，显示出一定的保护作用。在此，我们在国内外首次报道了从内生真菌中分离出的凝集素曲霉属真菌这两种植物都显示出很强的抗糖尿病活性在体外而且在活的有机体内．凝集素可降低糖尿病大鼠血清尿素、肌酐、胆固醇、甘油三酯、谷氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶水平。在MALDI-TOF-MS中鉴定出分子量为64 kDa的n -半乳糖氨基电子素糖蛋白，与核糖体失活蛋白相似商美国并且显示出很强的抗糖尿病活性。此外，这种内生真菌凝集素可用于糖尿病治疗。

确认

我们感谢Sri Shridevi慈善信托基金管理受托人MR Hulinaykar博士，印度卡纳塔克邦图马库鲁市SreeSiddaganga药学院院长S. M. Shashidhara博士和印度卡纳塔克邦班加罗尔IISc分子生物物理单元在研究期间的鼓励和建议。我们还要感谢Prasad S Koka博士，他是印度新德里政府生物技术部门的Ramalingaswami研究员。

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