埃及开罗，Ain Shams大学农业学院食品科学系
埃及开罗，Ain Shams大学农业学院食品科学系
埃及国家研究中心乳业科技部
埃及国家研究中心乳业科技部
丹麦奥胡斯大学理学院分子生物学系跨学科纳米科学中心
埃及国家研究中心乳业科技部
DOI: 10.15761 / IFNM.1000107
在本研究中研究了在存在或不存在乳清蛋白分离物（WPI）中不同脂肪酸（油酸，elied，CIS-疫苗，反式疫苗和亚麻酸）的配制纳米粒子复合物的细胞毒性。检查用WPI形成的纳米粒子配合物用于表面张力，圆形二色性（CD），浊度和细胞毒活性。用加入脂肪酸向WPI添加表面张力值。这表明WPI可以结合更大的脂肪酸。诸如油酸，顺式 - 疫苗和亚麻等的顺式 - 脂肪酸导致WPI纳米粒子的表面张力降低而不是反式脂肪酸（eledic和反式疫苗酸）。在与脂肪酸结合后，蛋白质（WPI）的三级结构损失并从折叠改变以展开。蛋白质结构的变化将相关，以表现出对肿瘤细胞的细胞毒性活性。所有形成的蛋白质WPI /脂肪酸复合物呈现与脂肪酸相同的浓度相比较低的浊度测量。WPI /脂肪酸纳米复合物的浊度值较低，确认脂肪酸的结合脂肪酸能力较高。所有由WPI /脂肪酸形成的纳米络合物表现出细胞毒性能力作为红细胞中的裂解。 The cytotoxic activity of WPI/fatty acid complexes was almost as found with α-LA complexes. Nanocomplexes can be formed from WPI with good cytotoxic effect to tumer cells using cis-vaccenic and linolenic fatty acids comparable to oleic acid. It was a new interesting observation being that the nanocomplexes formed of WPI with fatty acids has a comparable cytotoxcisty to that of α-LA and β-lg and can be used in tumor therapy.
纳米粒子，乳清蛋白分离物，脂肪酸，表面张力，圆形二色性，浊度，细胞毒性
乳清蛋白是奶酪工业的重要副产品，由于其优越的营养和功能特性，被广泛应用于各种食品中。乳清蛋白凝胶可用作pH敏感水凝胶，用于控制生物活性物质的释放，因为其完全可生物降解，并且在其制备过程中不需要任何化学交联剂[1]。
生物聚合物和较小的有机分子（如脂质）在不同表面之间的相互作用对各种生物过程至关重要。蛋白质和脂质或类脂分子之间的分子相互作用是蛋白质最重要功能之一的核心，即生物界面上的吸附和生物膜的结构[2-4]。在过去几年中，已经描述了人α-LA的无钙形式与油酸（OA）之间的复合物对培养的癌细胞具有显著的凋亡样活性[5]。该复合物可以从母乳中分离出来[6]，也可以在与OA平衡的二乙氨基乙基（DEAE）三萨柱上形成[7]。该复合物被命名为HAMLET（对肿瘤细胞致命的人α-乳清蛋白），定义为部分展开的α-乳清蛋白和油酸之间的复合物。当针对几种不同类型的细胞进行测试时，HAMLET对肿瘤细胞表现出最强的活性，而成熟分化细胞没有受到影响[8]。α-乳清蛋白转化为HAMLET涉及三个分子事件：蛋白质去折叠、脂肪酸结合和生物活性复合物的形成。哈姆雷特是偶然发现的。在研究母乳中的抗粘附分子时，发现肿瘤细胞与酪蛋白混合后会发生实质性的形态学变化。酪蛋白组分中的杀肿瘤活性是在母乳低pH沉淀后获得的，蛋白质组分被鉴定为α-乳清蛋白，α-乳清蛋白作为乳糖合成复合物中指定的底物，但没有已知的杀肿瘤活性。哈姆雷特型复合物具有强大的靶向不良细胞的潜力，20年前才被发现，此后哈姆雷特领域的范围不断扩大，获得了新的成员，丰富了我们对蛋白质自组装和获得新功能的基本原理的理解。
与人乳形成鲜明对比，在牛奶中没有发现类似的天然存在的活性。然而，已经可以使牛α-La和OA之间的复合物成为Bamlet（牛α-乳白致死至肿瘤细胞），能够在体外诱导细胞中的细胞死亡。同时，OA复合物在用密切相关的氨基酸序列替换人α-LA时保留其活性。例如，人α-LA可以由牛，马，猪或己碱α-LAS代替，蛋白质与人蛋白共享76-79％的序列同一性[9]。因此，研究可以潜在地调节细胞生长的BAMLES样活性的病症是有意思的。
因此，本研究的目的是研究乳清蛋白作为纳米颗粒基质的潜在用途及其在生物活性化合物输送中的效率。研究了牛乳清蛋白与具有细胞毒性活性的不同不饱和脂肪酸形成纳米复合物的能力。因此，本研究计划从全乳清蛋白（WPI）制备和不同脂肪酸（油酸、eledic、顺式真空酸、反式真空酸和亚麻酸）制备纳米复合物，并对其性质进行研究。
乳清蛋白孤立（WPI）购自Arla Foods Imba。nnvium。DK-6920 videbaek。丹麦。本研究中使用的所有脂肪酸（Oueic，Eliedic，CIS-VACCCENIC，Trans-Vaccenic和亚麻酸）购自Sigma-Aldrich Co.，St Louis，美国。
在这项研究中(在丹麦实验室)乳清蛋白分离物(WPI)溶于双蒸馏水在4°C.用分光光度计在280 nm处测定WPI浓度。将悬浮脂肪酸和热处理的WPI溶液样品在pH为9、最终浓度为1.516 M甘氨酸的缓冲液中稀释至最终浓度为1 mg/mL。
油酸在碳酸钠(Na2有限公司3.）0.1米，虽然以浓度为5mg / ml溶解在乙醇中的ELIEDIC，CIS-VACCENIC，转染液和亚麻酸脂肪酸并搅拌直至完全溶解。
如Kamimima所述制备具有不同脂肪酸的WPI溶液的混合物等[10]将不同的脂肪酸以摩尔比直接悬浮在不同浓度的（WPI）蛋白质溶液中。这些混合物在60℃下加热°培养15分钟后，将混合物冷却至室温（20℃）°C） 。
所有样品的表面张力均在室温（20℃）下测量°C)使用悬挂下降(KSV仪器，CAM 101)。测量重复六次，得到平均值。
用jascoJ-810分谱（Jasco Spectroscopic Co. Ltd.，Jascoji City，Japan），测量CD的光谱，配备jasco PTC-348WI温度控制单元。光学杯杯的通过长度为250-320nm（接近紫外线）和190-250（远UV）的1mm，分别为37°C.波长设置为;响应时间2秒;扫描速率为100 nm/min。记录了八次扫描，并对每个光谱取平均值。近紫外和远紫外的WPI分别为38.62 μM和3.862 μM。
使用分光光度计在400nm下测量蛋白质溶液和蛋白质脂肪酸混合物的浊度。
如Dobrovolskaia所述，检测不同蛋白质/脂肪酸复合物对红细胞的相互作用效应，作为皮肤毒性活性的指示等．[11]。
采用[12]统计分析系统对三个实验的数据进行分析。
图1中绘制了复合物中含有不同脂肪酸的WPI纳米颗粒溶液的表面张力值，作为在60℃加热后存在或不存在WPI时脂肪酸的函数°不含油酸的WPI纳米颗粒(缓冲液)的表面张力为68.7 mN/m，而缓冲液的表面张力为71.9 mN/m。由图1可以看出，在甘氨酸缓冲液中加入浓度为0.25 MR的油酸(OA)使WPI溶液的表面张力值由68.7 mN/m降低到57.1 mN/m。另一方面，在缓冲液中加入相同浓度的OA只使表面张力值从71.9降至71.1 mN/m。随着添加脂肪酸浓度的增加，WPI溶液的表面张力值降低。通过添加不同的脂肪酸，数据显著降低，反映了WPI纳米颗粒与脂肪酸结合的亲和力。
这些发现被注意到与不同的脂肪酸在降低表面张力值的作用。图1所示的数据还表明，与甘氨酸缓冲溶液(pH 9)中使用的任何脂肪酸复合物相比，WPI与脂肪酸复合物的表面张力值降低。从0.25 MR到3.5- 4.0 MR，脂肪酸添加的第一阶段，表面张力值的变化更为明显。从所获得的数据可以观察到其他两个阶段。
中阶段从4.5 MR高达25 MR，从中，表面张力继续降低，随着脂肪酸的增加比例而不是比第一阶段的较低速度降低。第三阶段开始于50 MR的30 MR至最终滴定过程，表面张力值的降低速度非常慢。这些观察结果证实了前一种发现，即在第一个阶段，在第三阶段的第一个阶段发生了表面张力的变化显着更快。表面张力的更快的减少速率直接反映了更快的吸附;并且结合位点仍然不饱和，可以从脂肪酸中结合更多的浓度。图1中呈现的数据也称，WPI纳米颗粒具有高亲和力来结合不同的脂肪酸以及油酸。它可能也是高于伊丽西酸或任何反式构象脂肪酸的油酸的能力也很高。
与油酸相比，图1展示了不同脂肪酸对改变甘氨酸缓冲溶液中WPI纳米颗粒表面张力值的影响。可以看出，顺式疫苗酸和亚麻酸与WPI结合时大多接近油酸，降低表面张力值的作用相似。一般来说，脂肪酸与WPI纳米颗粒复合物结合的增加反映了复合物杀灭癌细胞或具有更强的抗癌作用的可用性增加。
将脂肪酸加入WPI纳米颗粒（1mg / ml）表面张力上的效果依赖于脂肪酸浓度。通常，与没有WPI纳米颗粒的溶液相比，加入WPI纳米粒子的加入将更快地减小表面张力（顺式脂肪酸具有比反式脂肪酸的WPI纳米粒子结合的能力更高）。表面张力值的降低总是高于WPI纳米颗粒复合物的张力，而不是没有WPI的。因此，WPI /脂肪酸复合物的能力较高，仅杀死癌细胞比脂肪酸更高。
顺式脂肪酸在双键周围呈u形，两个碳链向一个方向突出。由于双键两侧的碳链，Tran脂肪酸在双键周围呈棒状。这可能解释了顺式脂肪酸比反式脂肪酸更能与WPI纳米颗粒结合。结果表明，顺式构象使脂肪酸具有紧密的立体特异性配合，而脂肪酸的另一个关键特征是碳链的长度。费尔南德斯发现，当乳清分离蛋白(WPI)与饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸[13]一起制备薄膜时，表面张力显著降低。
顺式脂肪酸在双键周围呈u形，两个碳链向一个方向突出。由于双键两侧的碳链，Tran脂肪酸在双键周围呈棒状。这可能解释了顺式脂肪酸比反式脂肪酸更能与WPI纳米颗粒结合。结果表明，顺式构象使脂肪酸具有紧密的立体特异性配合，而脂肪酸的另一个关键特征是碳链的长度。费尔南德斯发现，当乳清分离蛋白(WPI)与饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸[13]一起制备薄膜时，表面张力显著降低。
牛奶系统的表面张力在很大程度上取决于牛奶混合物和表面活性剂的浓度;在界面处吸附表面活性剂;蛋白质的展开和变性。这些可以证实只需要临界浓度的表面活性剂来产生最大表面活性。过量临界浓度的表面上表面活性剂的浓度将由空气 - 水界面屏蔽，因此不会有助于测量的效果[14]。乳蛋白，乳脂肪和游离脂肪酸是影响牛奶表面张力的主要表面活性组分。这些部件在表面上的增加将导致表面张力降低。相反，当蛋白质不再是有效的表面活性剂时，脂肪球表面上的乳蛋白的变性将增加表面张力。
图1所示。不同脂肪酸溶液在甘氨酸缓冲液(pH 9.0)中单独或与乳清蛋白分离物(WPI 1mg/ml)在60℃加热时的表面张力(mN/m)°C / 15分钟。
加热的WPI溶液（甘氨酸缓冲液中1mg/ml，pH 9.0）的光谱与纳米复合物形式的不同脂肪酸（油酸、eledic、顺式真空酸、反式真空酸和亚麻酸）形成圆二色谱（CD）测定以确认结构特征的变化，光谱如图2和图3所示。WPI/油酸纳米颗粒复合物杀死癌细胞的能力已显示在失去三级结构后增加。WPI/OA复合物在近紫外和远紫外区域的CD光谱如图2和图3所示。spWPI/OA纳米颗粒在近紫外的电子回旋共振光谱显示，在273.0 nm处有一个显著的最小信号（负椭圆度峰），在295.0 nm处有一个最大信号（正椭圆度峰）。与较高浓度的WPI/OA复合物相比，在含零油酸的缓冲溶液（pH 9）中加热的WPI具有较低的信号强度（50摩尔比），表明三级结构的缺失。这些发现与Kamijima的发现非常接近等．[10]谁发现人α-LA在270nm处具有阴性峰的特性和293nm处的正峰，表明芳族侧链的刚性包装相互作用。与天然WPI相比，热处理WPI的较低信号强度通常表示损失三级结构。
无论是没有油酸的加热WPI溶液还是作为纳米颗粒复合物的加热WPI溶液，其远紫外光谱(图3)都显示出显著的负椭圆度和206.7 nm处的最小信号(负峰)。Kamijima等．[10]提到，CD在222 nm处的椭圆度通常被用来衡量二级结构的程度。热处理后的配合物光谱显示出较天然WPI的螺旋形增加。
WPI/OA配合物的椭圆度随油酸浓度的增加而增加，即WPI由折叠变为展开，并失去三级结构。因此，WPI/油酸纳米颗粒复合物失去三级结构后杀伤癌细胞的能力增强。如图2所示，随着油酸浓度的增加，WPI/OA配合物的三级结构被认为从CD光谱中完全丢失。这些结果可能表明，加热后的WPI/油酸配合物的结构特征与HAML略有不同等虽然他们的凋亡活动彼此相似。在失去三级结构后，WPI /油酸纳米粒子复合杀灭癌细胞的能力增加，并且可以用来像哈姆雷特或巴巴物一样工作。有趣的是，接近紫外线的峰强度似乎与细胞毒性活性相关。这些结果可以表明，随着WPI通过增加来自油酸和热处理的添加而失去其构象，活性成分的量增加。
图2和图3绘制了WPI与不同浓度的烯酸在近紫外区和远紫外区的圆二色光谱。在近紫外光谱中，CD在265.4 nm处出现最小信号峰(负峰)，在295.2 nm处出现最大信号峰(正峰)，与WPI/油酸纳米颗粒配合物基本一致。在远紫外区，WPI/烯酸纳米颗粒配合物的CD光谱图3在210 nm处出现最小信号(负峰)，而WPI/油酸配合物的信号波长为206.7 nm。可以看出，WPI/烯酸的配合物完全失去了三级结构。从结果可以看出，在60℃加热后，WPI可以通过与醛酸的相互作用而部分展开°C/15min，损失三级结构。因此，WPI与乙二酸的配合物可能具有柠檬酸毒性(杀伤癌细胞的能力)。与WPI/OA不同的是，这些配合物需要较高的脂肪酸浓度才能达到其三级结构的完全丧失。
图2。圆二色性(CD)光谱测量WPI作为一个复合物与不同浓度的脂肪酸(摩尔比)在近紫外区。
图3。WPI的圆形二中间（CD）光谱测量WPI作为具有不同浓度脂肪酸（摩尔比）的复合物在远UV区域中。
图2和图3显示了不同浓度顺式疫苗酸(摩尔比)在近紫外区和远紫外区对WPI的圆二色性(CD)光谱测量。从WPI/顺式疫苗酸配合物的光谱中可以看出，近紫外CD光谱在273 nm处有一个最小信号峰(负峰)，在294 nm处有一个最大信号峰(正峰)。这些观察结果与WPI/油酸配合物的结果非常接近和接近。WPI/顺式疫苗酸的纳米配合物完全失去了三级结构，表现出与WPI/油酸非常接近的信号。
在远紫外光下，WPI/顺式真空酸纳米颗粒复合物（图3）的CD光谱在204 nm处显示出最小信号（负峰），而WPI/油酸纳米颗粒复合物的CD光谱为206.7 nm。这些观察结果表明，WPI也可以失去三级结构，并在以顺式真空酸作为辅助因子制备纳米复合物时展开，显示出如HAMLET或BAMLET所述的城市毒性效应。
在附近和FAR -UV区域中具有不同浓度的反式疫苗酸的WPI的圆形二中间谱（CD）光谱测量在图2和3. WPI /反式疫苗酸接近UV的信号模式略有不同比以前检查的脂肪酸发现。从WPI /反式疫苗酸复合物的接近UV光谱，可以注意到CD光谱在279nm处具有最小信号（负峰值），最大信号（正峰）在290nm处，几乎是WPI/油酸复合物。WPI / Trans-Raccenic的光谱证明了复杂的损失了用WPI /油酸的叔结构。
唯一的例外是，要得到与WPI /油酸配合物相同的转化率，WPI必须结合比油酸更高浓度的反式疫苗酸。在远紫外下，WPI/反式疫苗酸纳米颗粒的CD光谱(图3)显示最小信号(负峰)位于212 nm，而WPI/油酸纳米颗粒复合物位于206.7 nm。这说明在60℃加热后，WPI可以通过与反式疫苗酸相互作用而部分展开°C/15min作为辅助因子，表现出城市毒性效应。图2和图3中绘制的数据是近紫外和远紫外区域不同亚麻酸浓度（摩尔比）的WPI圆二色谱（CD）光谱测量结果。
WPI/亚麻酸配合物的近紫外光谱显示，与WPI/油酸纳米颗粒配合物相比，WPI/亚麻酸配合物的近紫外光谱在266 nm处有最小信号峰(负峰)，在295 nm处有最大信号峰(正峰)。还可以观察到，WPI完全失去了与WPI/油酸相同的三级结构。亚麻酸可以与WPI结合并相互作用，其转化与α-LA/油酸配合物的转化相同。但WPI能结合浓度较高的亚麻酸。WPI/亚麻酸纳米颗粒的远紫外CD光谱(图4B)显示，与WPI/油酸配合物的210 nm相比，WPI/亚麻酸纳米颗粒的最小信号峰(负峰)位于207 nm。因此，WPI也失去了三级结构，并通过与亚麻酸作为辅助因子的相互作用展开，表现出哈姆雷特或BAMLET的柠檬酸毒性效应。
一般来说，随着脂肪酸浓度的增加，CD光谱信号增加。增加信号是指蛋白质（WPI）从折叠到展开构象的变化。显然，所使用的所有脂肪酸都改变了结构，甚至在（0.0）脂肪酸浓度下单独使用WPI也会出现结构变化，因为它在使用前是热的。
2021年版权燕麦。所有权利reserv我们的研究结果与之前的研究一致，该研究清楚地表明，当在低盐浓度和中性pH下加热时，乳清蛋白会形成小的二硫键连接聚集体[15-19]。
用CD光谱分析了WPI的集体二级结构变化。脂肪酸与WPI的结合对WPI的蛋白质二级结构有显著影响，远紫外CD光谱结果表明蛋白质二级结构有显著损失。
WPI的远紫外光谱近似于α-LA和β-lg的适当混合物，在205 nm和222 nm处有双负峰，与纯α-LA[20]相似，但在222 nm处定义较差。
在甘氨酸缓冲溶液（pH 9.0）中，通过在60℃下加热，在单独或存在WPI（1mg/ml）作为络合物的情况下，在不同浓度比下测量不同脂肪酸的浊度°C/15分钟如图4所示。所提供的数据表明，通过增加脂肪酸浓度，脂肪酸溶液中的浊度增加，无论是单独的还是与WPI复合的溶液。在所有浊度测量中都注意到了这一点，所有被测脂肪酸的程度不同。所有形成的脂肪酸复合物的浊度测量值（图4B）均低于仅相同脂肪酸的浊度测量值（图4A）。在油酸中观察到不含WPI的脂肪酸的最小浊度，而在反式醋酸中观察到最大浊度。在所有脂肪酸复合物中，OA与WPI的复合物显示出较低的浊度值。反式真空酸（TV）单独或复合物的浊度测量值最高。顺式脂肪酸（油酸、顺式痘苗酸、亚麻酸）的浊度测量值低于反式脂肪酸（eledic、反式痘苗酸）。
图4.通过在60℃加热，单独（a）或作为乳清蛋白分离（wpi1mg / ml）的甘氨酸缓冲液（pH9.0）中不同脂肪酸溶液的浊度测量°C / 15分钟。
这些观察结果可以解释蛋白质（WPI）的存在与脂肪酸的复合物降低了脂肪酸在溶液中的聚集能力。溶液中脂肪酸浓度越高，聚集能力越强，浊度测量值越高。WPI/脂肪酸纳米颗粒在所有研究脂肪酸浓度下的浊度都非常低，这表明脂肪酸在溶液中的聚集能力越高y酸没有形成明显的聚集体。在我们的实验中可以注意到，所有测试样品中的浊度测量值都较低，这可以解释为所有测量溶液中使用的pH值较高（超过8.0），因为使用甘氨酸缓冲液将pH值调整为9.0。Wangsakan等．结果表明，当SDS(而不是脂肪酸)浓度从0 μ M增加到20 μ M时，1%麦芽糊精溶液(而不是蛋白质)的浊度没有显著变化，表明没有明显的络合物聚集，组分[21]没有热力学不相容。
仅加入脂肪酸或WPI/脂肪酸复合物，在37℃下孵育3 h后溶解红细胞(od值为405 nm)°C如图5所示。所获得的数据表明，WPI /脂肪酸复合物具有比单独脂肪酸的红细胞裂解红细胞的效率更高。通过在存在或缺乏WPI的情况下增加脂肪酸浓度来增加红细胞裂解。还可以看出，在低油酸浓度下，WPI /油酸的复合物显示略微裂解但仅仍然高于WPI在缓冲液中的络合物。
图5。在pH值为9.0的条件下，单独添加脂肪酸（A）或WPI/脂肪酸复合物（B）后发生红细胞溶解时的皮肤毒性活性测量。
虽然脂肪酸对红细胞的溶解也有影响，但复合物对红细胞的溶解比单独脂肪酸更有效。与其他脂肪酸相比，在低浓度OA单独或与WPI复合时均出现了完全的红细胞溶解。顺式脂肪酸的活性高于反式脂肪酸。因此，用乙二酸时红细胞裂解率最低。
为了澄清之前的观察，例如，在含有WPI的纳米复合物中，当油酸(OA)的浓度为4.5摩尔比时，红细胞发生了完全溶解，而在没有WPI的纳米复合物中，则在较高的油酸浓度(8摩尔比)时发生了完全溶解。同时，顺式疫苗酸在15摩尔比(WPI/TV)和20摩尔比(TV)条件下均可裂解。复合物的细胞毒性高于单纯脂肪酸。
总的来说，WPI/不同脂肪酸制备的所有复合物都显示出不同程度的细胞毒性作用，这取决于脂肪酸的类型和浓度。复合物的细胞毒性随着每个WPI分子中脂肪酸数量的增加而增加。缓冲溶液中的脂肪酸单独显示出的细胞毒性作用程度不如与蛋白质复合物。
WPI/脂肪酸复合物的细胞毒功能与HAMLET相似，热处理后明显形成凋亡复合物。然而，热处理使这种混合物变成了细胞毒性成分[10]。至于细胞毒性是由于α-LA和OA的协同作用，还是由两种成分[22]共同作用，目前尚无共识。
结果与Svensson一致等．他认为，只有蛋白质(α-LA)与不饱和脂肪酸之间的顺式复合物才能诱导细胞死亡[23]。据报道，α-LA与OA或VA之间的复合物最活跃，分别导致100%和99%的细胞死亡。复合物的细胞毒性与每个蛋白质所含脂肪酸的数量有关，每个蛋白质所含脂肪酸越多，其细胞毒性越大。
山口正彦
埃默里大学医学院
研究文章
收稿日期:2014年10月13日
接受日期：2014年10月25日
发布日期:2014年10月30日
©2014 Hassan ZMR。这是在创意公约归因许可的条款下分发的开放式文章，其允许在任何媒体中不受限制地使用，分发和再现，只要原始作者和来源被记入。
哈桑ZMR，Awad Ra，El-Sayed MM，Foda Mi，Salama Hh等人。（2014）乳清蛋白纳米粒子和脂肪酸之间的相互作用。综合食品Nutr Metab 1：DOI：10.15761 / IFNM.1000107
图1所示。不同脂肪酸溶液在甘氨酸缓冲液(pH 9.0)中单独或与乳清蛋白分离物(WPI 1mg/ml)在60℃加热时的表面张力(mN/m)°C / 15分钟。
图2。圆二色性(CD)光谱测量WPI作为一个复合物与不同浓度的脂肪酸(摩尔比)在近紫外区。
图3。WPI的圆形二中间（CD）光谱测量WPI作为具有不同浓度脂肪酸（摩尔比）的复合物在远UV区域中。
图4.通过在60℃加热，单独（a）或作为乳清蛋白分离（wpi1mg / ml）的甘氨酸缓冲液（pH9.0）中不同脂肪酸溶液的浊度测量°C / 15分钟。
图5。在pH值为9.0的条件下，单独添加脂肪酸（A）或WPI/脂肪酸复合物（B）后发生红细胞溶解时的皮肤毒性活性测量。
