辛哈医学科学与技术研究所，印度加尔各答
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印度西孟加拉邦加尔各答加尔各答，加尔各答医学院心内科
辛哈医学科学与技术研究所，印度加尔各答
电子邮件:asruksinha@yahoo.com
DOI: 10.15761 / JIC.1000149
急性心肌梗死(AMI)的诊断目前是通过测定血浆肌钙蛋白I (pTi)。根据既往报道，不同聚合剂聚合的AMI受试者血小板均不能被乙酰水杨酸(阿司匹林)抑制，研究了AMI诊断的可行性。
年龄在40-60岁之间的AMI患者(n=50, M=35, F=15)或ACS患者(n=30, M=20, F=10)以及年龄和性别相同的正常志愿者参与了这项研究。研究了80 μ M阿司匹林对2.0 μ M ADP诱导的血小板聚集的抑制作用，方法是在37°C下将富血小板血浆(PRP)与该化合物孵育30分钟，并在光学聚集仪中进行聚集。
在正常PRP的情况下，阿司匹林的抑制率≈100%。在ACS的情况下，与没有抑制的AMI的情况相比，抑制率为63.2% (即。阿司匹林对ADP诱导的血小板聚集有0%的抑制作用，p<0.001)(敏感性= 92%，特异性= 100%)。
以阿司匹林对血小板聚集无抑制作用诊断急性心肌梗死是可行的。
血小板聚集，心肌梗死诊断，肌钙蛋白，阿司匹林。
不同的血小板聚集剂包括ADP，l-肾上腺素，胶原蛋白或凝血酶是挽救生命的血液凝固过程必不可少的。另一方面，据报道，冠状动脉壁上动脉粥样硬化斑块破裂部位血小板过多聚集会导致血栓的形成，血栓是血小板的微聚集物，有时会导致心脏肌肉组织正常血液循环的阻塞，从而可能导致急性冠状动脉综合征(ACS)[2]。虽然血小板在动脉斑块破裂部位的聚集可能发展为ACS，但血小板的聚集有时也可能阻塞心包动脉，导致心脏细胞死亡，表现为心脏细胞死亡而形成的暗斑状梗死区，最终可能导致急性心肌梗死(AMI)，严重时可导致患者死亡[3]。透壁梗死取决于心肌损伤的程度，在50%的心电图中可能表现为异常的Q波，也可能表现为异常的ST波和T波，从而导致ST升高型心肌梗死(STEMI)或非STEMI，因此，ECG可能对确定AMI的发生没有诊断价值。虽然胸痛通常比急性冠脉综合征更严重，持续时间更长，但已知胸痛本身是主观的，可能是急性冠脉综合征本身以外的模拟事件。因此，AMI的诊断通常是通过使用肌钙蛋白I抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血浆肌钙蛋白I (pTi)来确诊的。
然而，肌钙蛋白I (Ti)及其抗体都很昂贵，此外，ELISA本身可能并不总是足够快，在要求较高的情况下，可以足够快地确认AMI的发生，这可能需要对病情进行可能的治疗干预。由于这些原因，在世界许多地区，急性心肌梗死的实验室诊断是不可用的，不一定是自愿的。
我们最近报道了AMI患者的富血小板血浆(PRP)与80 μ M乙酰水杨酸(阿司匹林)预孵育在37°C下30分钟，与正常PRP或ACS患者的PRP相比，不同的血小板聚集剂(包括ADP)未能抑制血小板聚集。在这些初步研究的基础上，我们研究了在没有测定pTi的情况下，通过光学聚合术确认AMI发生的可能性。
我们在此报告了通过使用聚集仪测定阿司匹林对ADP诱导的血小板聚集的抑制来确认AMI发生与ACS发生的区别的可行性。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)平行和同时测定pTi，证实AMI的发生。
“血小板光学聚集法在实验室诊断急性心肌梗死”的研究项目需要AMI或ACS患者和正常志愿者名义量的血液(2 mL)。印度加尔各答辛哈医学科学和技术研究所人类和动物研究伦理委员会机构审查委员会批准了这项研究，条件是严格按照1964年赫尔辛基宣言遵守已批准的人类伦理议定书，并且未经委员会事先书面许可，不允许研究有任何偏差。所有参与者的年龄都在40-60岁之间。没有智障人士、孕妇或囚犯参与这项研究。所有志愿者在参与研究之前都签署了一份知情同意书。在ACS或AMI受试者的案例中，通过签署司法宣誓书，患者亲属也同意参与研究。主治医生决定是否可以在不使受试者处于任何危险的情况下从患者体内提取血液样本(2毫升)。由主治医生或有执照的护士抽血。研究人员确保志愿者没有其他危及生命的感染。委员会定期检查目前调查的进展和问题。
从Sigma Aldrich中获得山羊抗兔免疫球蛋白g -碱性磷酸酶和ADP。酶联免疫吸附试验(ELISA) maxisorp板来自丹麦Nunc, Rosaklide。肌钙蛋白I、肌钙蛋白I抗体、CK-MB、CK-MB抗体均取自Abcam。乙酰水杨酸(阿司匹林)来自Medica Zydus Healthcare。所有其他使用的化学品都是分析级的。
共50例患者(n=50, M=35, F=15，年龄40-60岁，胸痛持续> - 120h)参与研究。这些受试者被送入加尔各答医学院和医院的重症监护室。患有糖尿病或危及生命的感染的患者不包括在这项研究中。由于心内膜炎、肺栓塞、主动脉和肠道疾病已知会刺激AMI或ACS引起的胸痛，因此这些疾病的患者被仔细地排除在研究之外。所有在过去六个月内因任何疾病住院的参与者或在两周内服用阿司匹林的患者都被排除在研究之外。
同样数量的年龄和性别匹配的正常志愿者也被纳入研究。所有正常志愿者均无糖尿病或全身性高血压病史。这些正常志愿者中没有人有任何危及生命的感染，也没有人在过去六个月内因任何疾病住院。所有女性志愿者都没有服用过任何避孕药物。在过去4周内，所有志愿者都没有服用过阿司匹林或任何心脏药物。
所有AMI患者均以上述特征性胸痛入住医院心脏加护病房。STEMI和非STEMI AMI患者均纳入研究。所有入选患者ECG均出现Q波。对于ECG中Q波的出现不能明确显示的病例，排除在本研究之外。ELISA检测pTi水平，证实AMI的发生。
作为预期研究的一部分，30名年龄在40-60岁之间的患者(n=30, M=20, F=20)被纳入该研究。这些患者有特征性胸痛。有束支阻滞且心电图不能确定心肌缺血区域的患者排除在本研究之外。
入院后6h内抽血检测CK-MB，证实发生ACS。
在AMI或ACS的情况下，血液样本都是在任何心脏治疗开始之前从受试者身上获得的，以减少歧义。
选择的患者是随机的，并为AMI、ACS和正常志愿者的每个血液样本分配一个任意数字，并在一名非调查员的文书人员的监督下进行。研究人员不知道抽取的血液样本是来自AMI或ACS患者，还是来自正常志愿者。只有在研究完成后，调查人员才能获得有关参与者状况信息的“关键”，以便进行统计分析。所有血液样本均在抽检后尽快进行研究。
受试者的PRP由[4]前面所述的离心制备。
用于测定CK-MB或pTi的无血小板血浆(PFP)是通过在0°C[4]下离心10,000 g血液样本制备的。
OAT版权所有。版权所有通常，AMI、ACS受试者或正常志愿者的PRP与80 μ M阿司匹林在37°C下孵育30分钟。血小板聚集是由2 μ M ADP与阿司匹林[4]预孵育处理PRP引起的。在对照实验中，用等体积的0.9% NaCl处理PRP，在37℃下孵育30 min。
将阿司匹林溶解在去离子水中制成现制阿司匹林溶液，加入0.1M NaHCO使pH值维持在7.03.．阿司匹林溶液使用后丢弃。
采用肌钙蛋白I抗体和CK-MB抗体ELISA法测定pTi和CK-MB水平。
所得结果以+/-标准差表示，用Student 's t检验确定结果的显著性。的值p<0.05为显著性。在适当的情况下，还确定了结果的Pearson´s相关系数®。皮尔逊分数r，使得-1≤r≤+1是可接受的，其中(+)和(-)符号分别被指定为正线性相关和负线性相关。使用Graph Pad Prism软件(Graph Pad software, San Diego, and USA)和Micro Cal origin 6.0软件进行统计分析。使用比利时MedCalc统计软件进行诊断试验评估和受试者操作曲线(ROC)分析。根据ROC分析，具有完美辨别性(两个分布没有重叠)的试验具有穿过左上角的ROC曲线(100%敏感性，100%特异性)。因此，ROC曲线越靠近左上角，测试[5]的整体准确率越高。曲线下面积(AUC)被量化，这是一个参数如何区分两个诊断组(患病/正常)。
当这些受试者的PRP与80 μ M阿司匹林在37°C下孵育30分钟，并用2.0 μ M ADP处理PRP引发血小板聚集时，发现只有在AMI受试者的PRP中，该化合物未能抑制(0%抑制)血小板聚集。相比之下，在ACS(抑制百分比为52%-68%)或正常PRP的情况下，血小板被100%抑制(图1，面板A)。受试者操作曲线(ROC)分析显示92%的敏感性(95%置信区间(CI): 91.0-100.0)和100%的特异性(95% CI: 91.0-100.0, P<0.0001)。经ROC分析检验的曲线下面积(AUC)等于0.952(图1，面板B)。
图1所示。在正常、ACS和AMI受试者中，阿司匹林对PRP中血小板聚集的抑制百分比和受体操作者曲线分析。面板A:正常、ACS和AMI受试者的PRP按照材料和方法中所述制备，并与80 μ M阿司匹林在37°C下孵育30分钟。孵育后，通过添加2 μ M ADP启动血小板聚集，并在光学聚集仪中进行研究。图B:血小板聚集抑制的ROC曲线分析，其中敏感性与不同分界点的特异性对应。ROC曲线上的每个点代表一个灵敏度/特异性对，对应于方法和材料中描述的特定决策阈值。
如图2,Panel A所示，pTi的升高与阿司匹林抑制血小板聚集的程度呈负相关。换句话说，pTi的增加在AMI时达到最大值，同时也导致血小板对阿司匹林抑制作用产生最大的抵抗(相关系数，Pearson 's r= -0.967, p<0.001)，阿司匹林对血小板聚集的抑制作用最大程度上与正常患者pTi的完全缺失有关，ACS患者pTi水平高于正常，说明ACS患者血浆中也存在肌钙蛋白I，但低于AMI。受试者操作曲线(ROC分析)显示85%的敏感性(95%置信区间(CI): 81.0-92.0)和78%的特异性(95% CI: 75.0-80.0, P<0.0001)。经ROC分析检验的曲线下面积(AUC)等于0.739(图2，面板B)。
图2。正常、ACS和AMI患者血浆肌钙蛋白I水平及其ROC分析图A:如材料和方法所述，采用肌钙蛋白I抗体ELISA法测定pTi水平。每个点实际上是50个正常，30个ACS和50个AMI患者的重叠。B组:如方法和材料中所述，使用MedCalc构建正常(非病变)、AMI(病变)患者pTi水平的ROC曲线分析。
急性心肌梗死，据报道是由血栓形成引起的，导致心脏细胞死亡，可能是最危险的血栓性疾病，导致大量受害者死亡。与ACS不同的是，据报道，阿司匹林可以通过抑制血小板的过度聚集来防止ACS的复发，而AMI中的血小板则由于循环[6]中dermcidin isoform2 (DCN-2)的出现而对该化合物的抑制作用具有抗性。不幸的是，由于缺乏阿司匹林引起的血小板聚集抑制作用，大多数首次患者在几个月内心肌梗死复发并死于这种情况。据报道，DCN-2是阿司匹林诱导的一氧化氮(NO)合成的有效抑制剂。最近有报道称，通过增加血小板中NO的合成，从血小板表面去除结合的DCN-2，有可能使AMI血小板对阿司匹林效应再敏感。
不仅通过适当的治疗干预来治疗和预防AMI仍然存在问题，甚至对于世界上许多实验室来说，将病情与ACS的发生区分开来的实验室诊断仍然昂贵得令人望而却步，这通常需要通过pTi水平来确认AMI。这是因为肌钙蛋白I及其抗体不仅昂贵，而且ELISA检测本身需要特殊的设备和必要的化学品和用品，这可能是一个耗时的过程，在必要的情况下，快速和确认AMI的发生对治疗干预至关重要。此外，抗原与其抗体之间的相互作用不遵循众所周知的化学计量学，因此，分析本身可能在数据解释的有效性方面存在问题。此外，通过测定血浆CK-MB来诊断ACS(与AMI不同)是一项昂贵的程序。
上述结果有力地表明，在1小时内使用普通实验室聚集仪进行简单的血小板聚集术诊断AMI与ACS是可行的(ROC分析确定敏感性= 92%，特异性= 100%)。在材料和方法中描述的诊断测试曲线接近左上角(图1，面板B)，这意味着与pTi相比，诊断测试的准确率接近100%(图2，面板B)。
也是PRP中血小板的聚集在AMI无法抑制的阿司匹林,但血小板从PRP ACS科目,诊断AMI的血小板aggregometry可以是一个经济和“全有或全无”活动即AMI血小板的聚集可能或不可能实现用阿司匹林治疗PRP,相比之下从ACS患者血小板的聚集可以明显抑制由同一化合物(图1)。然而,结果发现，即使是ACS患者的血小板也比正常血小板对阿司匹林的抑制作用具有更强的抵抗力。另一方面，AMI患者的血小板对阿司匹林的耐药性最大，且与pTi水平呈负相关(pTi水平与阿司匹林抑制率之间的相关系数(r)为-0.967,p<0.001)。
在上述背景下，应该提到的是，对AMI进行快速和明确的诊断对于使用溶栓治疗是必要的，这可能会降低AMI的死亡率30-50%[8]。值得注意的是，约50% pTi升高的患者心电图中没有ST段抬高或Q波，因此，AMI的血小板聚集诊断可能是比ECG更有用的诊断方法，同时它比ELISA检测pTi便宜得多。
AMI患者血液循环中pTi的定量通常作为AMI的确认性标记蛋白。然而，在一项初步研究中发现，pTi也是NO合成的抑制剂，在与AMI血浆中pTi水平相似的范围内(nM)，是一种有效的血小板聚集诱导剂(未发表)。然而，由于ACS患者血浆肌钙蛋白I水平高于正常血浆，但远低于AMI患者，提示ACS患者pTi也有升高，但几乎是AMI患者的6倍。然而，这些结果提示，与正常血浆相比，pTi升高不一定能证实AMI的发生与可能发生的ACS的发生有区别。
我们最近报道了AMI的特征性心绞痛与血浆中NO水平的严重降低有关，这是由于DCN-2或其他一氧化氮合酶[9]的全身抑制剂抑制了NO的合成。由于pTi被发现是一种新型的血小板聚集剂(未发表)，通过抑制血小板中的NOS, pTi本身可能参与了AMI的心绞痛，至少部分参与了心绞痛。pTi在心肌循环中的溢出本身可能是血栓形成的，可能有助于AMI血小板对阿司匹林抑制作用的耐药性的发展，类似于DCN- 2的作用，导致病情的开始或加重。因此，pTi的存在本身可能在AMI患者血小板对阿司匹林抑制作用的抵抗发展中具有不祥的作用，从而导致病情复发。
马西莫Fioranelli
Guglielmo Marconi大学
研究文章
收稿日期:2015年12月19日
录用日期:2016年1月19日
发布日期:2016年1月22日
©2016 Banerjee D.这是一篇根据创作共用署名许可条款发布的开放获取文章，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
张志刚，刘志刚，刘志刚，陈志刚，陈志刚(2016)急性心肌梗死的临床诊断，中国临床医学杂志，29 (2):DOI: 10.15761/JIC.1000149
辛哈医学科学和技术研究所所长，印度加尔各答-700084，帕图利，拜什纳布加塔，肯杜阿大道288号;电话:+ 91 - 9038975945。
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图1所示。在正常、ACS和AMI受试者中，阿司匹林对PRP中血小板聚集的抑制百分比和受体操作者曲线分析。面板A:正常、ACS和AMI受试者的PRP按照材料和方法中所述制备，并与80 μ M阿司匹林在37°C下孵育30分钟。孵育后，通过添加2 μ M ADP启动血小板聚集，并在光学聚集仪中进行研究。图B:血小板聚集抑制的ROC曲线分析，其中敏感性与不同分界点的特异性对应。ROC曲线上的每个点代表一个灵敏度/特异性对，对应于方法和材料中描述的特定决策阈值。
图2。正常、ACS和AMI患者血浆肌钙蛋白I水平及其ROC分析图A:如材料和方法所述，采用肌钙蛋白I抗体ELISA法测定pTi水平。每个点实际上是50个正常，30个ACS和50个AMI患者的重叠。B组:如方法和材料中所述，使用MedCalc构建正常(非病变)、AMI(病变)患者pTi水平的ROC曲线分析。
