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摘要

对于远离导管实验室的患者，溶栓仍然是首选的治疗方法。虽然全剂量是可取的，但低剂量尚未进行临床前试验。在这里，我们验证了低剂量特奈特普酶（一种重组纤维蛋白特异性纤溶酶原激活剂）的假设，即即使在较低剂量的情况下，也可以诱导有效的溶栓迄今为止，han指出，与ST段心肌梗死的全剂量溶栓治疗相比，将家猪（30-35 kg，n=23）置于临床相关的血栓模型中。我们同时使用颈总动脉（CA）和左前降支（LAD）在第一条对角线下方。血管最初受到外部损伤（用镊子施压），然后是适当剂量的凝血酶（LAD为100 IU，CA为190 IU）.闭塞血栓发生率LAD为80%，CA为57%。闭塞后10分钟，在连续心电图和超声波流量计监测下，将动物分配给以下组之一：A组）半剂量替奈普酶（2000 IU）；B组）全剂量替奈普酶（5000 IU）；C组）仅生理盐水。所有动物均接受60IU肝素和抗血小板药物。随访时间为给药后120分钟。给药后60分钟重组发生在A组A组中的58％的闭塞动脉中，在B组中85％，C组中的20％（P = 0.028）。Tenecteplase方案均为治疗颈动脉血栓形成（71％A组vs。B组为75%，C组为33%，P=0.286），但低剂量组在重建近端闭塞LAD血流方面的效果明显较差（A组为25%）vs。B组100％vs。C组为0%，P=0.015）。所有在60分钟恢复血流的血管至少保持通畅1小时。在A组中，在Tenecteplase给药后60分钟，Lad中的流速达到基线值的30％，颈动脉中45％，而B组流量分别为160％和55％，表明治疗中的较大腔直径的恢复船只。后再灌注心律失常，需要治疗的所有群体发生在所有群体中。在组之间观察到血液动力学测试参数的差异。总之，我们开发了一种临床相关模型，可用于测试不同血栓形成方案的疗效。我们的数据表明，低剂量TenectePlase可以成功地用于治疗较大直径容器的血栓形成，例如颈动脉，但对于治疗LAD血栓性闭塞性似乎不足。

介绍

心肌梗塞是西方国家发病率和死亡率的主要原因[1]。最常见的原因是具有形成血栓形成的动脉粥样硬化斑块，导致冠状动脉闭塞[2那3.].目前的做法是常规进行直接经皮冠状动脉介入治疗（PCI）。然而，即使采用了先进的通勤技术系统，导管插入术也并不总是及时进行，从而节省了宝贵的心肌抢救时间。

溶栓试剂作为一种潜在的早期非手术治疗工具出现原位重新化;初步研究报告了梗塞相关动脉的左梯度灌注在90分钟内80％的病例，导致死亡率减少50％[4.那5.]。其他优势包括：可获得性广，不需要机构资源或经验丰富的操作员，并且能够在急诊室甚至在到达医院之前提供这些资源[6.]然而，早期的热情因再灌注率不理想、反复缺血和再梗死以及最重要的颅内或全身出血并发症而减弱[7.］.

在所有可用的纤维蛋白溶解药物中，特乃替普酶尤其令人感兴趣，因为它具有最高的纤维蛋白特异性和较长的半衰期（20-25分钟），允许以单次剂量给药[8.］.第一个临床试验，Assent2 [9.]和Assent3 [10.]证明tenecteplase与阿替普酶同样安全有效，而最新的临床试验强调了其与PCI相比的作用[8.那11.］.

在这里，我们报告了我们的经验，首先是一个高效的生成临床相关血管血栓模型的方案，其次是低剂量的替奈普酶可以有效地改善大血管中的血流，但在LAD中没有。

方法

动物

试验在体重30-35公斤的健康家猪身上进行，如图1所示。肌注氯胺酮(20 mg/kg)和地西泮(1 mg/kg)。麻醉诱导和维持由持续输注舒芬太尼和戊巴比妥耳静脉。动物被插管并用室内空气通风。使用加热垫保持体温。泮库溴铵输注(0.2 mg/kg)可使肌肉松弛。

图1所示。研究设计。总共23只动物用于目前的研究。n = 5用于协议优化，N = 3被排除由于心律失常，并且在每个实验组中使用n = 5。缩写：TNKase = TenectePlase

实验程序

切开左右颈区，暴露颈总动脉(CCA)，仔细解剖动脉周围结缔组织。采用适合颈动脉内径(5- 8mm)的环形经时多普勒血流探头，近端放置于动脉周围，连续记录平均血流。

在血流探头的远端用两个硅胶血管陷阱分离出一段1cm长的颈总动脉。然后用止血钳进行4 - 5次外按压(每8-10分钟一次)，持续约30分钟，在诱捕器之间造成内膜损伤。然后，这些陷阱被绑住以阻断阿胶，导致完全停止流动。将凝血酶(190ui)与血液混合注入分离段。30分钟后，取出近端硅胶圈套器，随后取出远端硅胶圈套器。圈套摘除后颈动脉血流消失至少10分钟视为完全血管血栓形成。实验协议和血栓模型的方案如图2A和2B所示。

图2。一个。实验性的协议。B.用于诱导血栓形成的方案。在内皮细胞外部损伤后，注射凝血酶，并通过远端闭塞探针验证完全闭塞。C。A组约有58±8%的血管成功再通，B组为85±15%，C组仅为20±5%。D。在颈动脉通畅方面，低剂量组和高剂量组之间没有观察到差异。E。与仅接受肝素的低剂量或基团相比，在高剂量的TNKase组中重新增加了较高的小剂量。缩写：TNKase = TenectePlase

将相同的程序施加到左侧前后下降动脉，恰好在第一对角线（2-4mm）以下。在这里，在第一对角线分支之后，将0.5厘米长的段与两个硅塑料血管分离。然后在血管之间产生内膜损伤，在血管上产生三到四个外部按压（每10-15分钟），止血钳约30分钟。在此期间，在伪封心肌区域中开发了严重的紫绀，其伴有Hypo-收缩性。然后将凝血酶（100ui）注入段和三十分钟后，除去近端硅塑圈，立即后跟远端圈套。在圈套去除后，冠状动脉血流量至少10分钟被认为是完全血管血栓形成。

血流动力学和心电图测量

连续心电图监测(ECG;分别用导联II)和流量计评估ST段变化和再通。频发室性早搏(VPB)定义为每分钟5次以上。加速性心室性心律(AIVR)是指室性心律为60 ~ 125次/分钟，且经常发生缓慢的室性心动过速。非持续性室性心动过速(VT)定义为连续3次或3次以上的室性异位搏，频率为>100次/分钟，持续时间小于30秒。持续室速定义为持续时间超过30秒或导致血流动力学损害，需要介入治疗。心室纤颤表现为轮廓和振幅不等的不规则结节。一根Millar导管经左室左室尖切口置入，持续监测压力。完全分辨率或不完全分辨率是根据初始心电图变化来定义的。与初始评估相比，再血栓被定义为st段抬高导致的新的血流损害。 After surgical preparation the animals were allowed 10 min for stabilization and then control measurements of ECG, flow and mean arterial pressure (MAP) were taken. Repeat measurements were taken again before occlusion; 10 min post successful thrombosis and before therapy administration; immediately after reperfusion and then every 30min until the end of the study. Mean arterial pressure-rate product (PRP) was calculated as mmHg/beats/min×10^3.。

过程中的抗血栓策略

所有动物均按照目前的建议进行抗血小板和抗凝治疗。口服阿司匹林300毫克(由拜仁购买)和口服氯吡格雷600毫克(由赛诺菲购买)。静脉给予抗凝治疗，包括60iu未分离阿司匹林(Braun购)。

溶栓治疗：给药剂量

将动物的成功血栓形成动物分配给静脉注射卵巢（TNK-ASE;由Boehringer Igelheim购买的低剂量（A组））通过颈静脉导管或高剂量（B）或高剂量（B）或盐水。

生化研究

在所有组中，在安乐死之前，血液样品被收集在玻璃柠檬水管（BD Vacutainer）中，并根据制造商的说明进行处理。评估凝血标志物，如国际归一化比（INR），活化的部分血栓形成素时间（APTT）和凝血酶原时间（PT）。

统计分析

结果表示为平均值±SEM，数据由因子单向ANOVA处理。使用Dunnett的比较个体群体t测试。P <0.05的差异被认为是统计学意义的。

结果

本研究共使用了23只动物。5只动物最初被纳入血栓形成优化方案。另外3只动物在血栓形成过程中发生心室颤动，并在给药前死亡。3个治疗组共包括15只动物。

我们决定采用凝血酶灌注中断血管流动的优化方案，而不是经皮导管的机械干预，以便更好地模拟临床急性心肌梗死的情况。后者导致斑块破裂、血小板粘附和血栓形成。外部压迫和凝血酶灌注造成的内皮损伤类似于这种病理。结果显示，80%的颈动脉和57%的LAD血管成功形成血栓。

血管再通

在血栓诱导10分钟后，我们测试了低剂量或高剂量tnk酶是否能够恢复血栓血管中的血流。为此，经颈内静脉注射tnk酶2000iu (A组，n=5)或tnk酶5000iu (B组，n=5)或生理盐水(C组，n=5)。所有动物均接受60 IU/kg肝素及抗血小板治疗。在输注过程中没有观察到任何动物的不良事件。溶栓给药60分钟后，A组闭塞动脉再通率为58±8%，B组为85±15%，C组为20±5%(图2C;p = 0.028)。两种替尼普酶治疗颈动脉血栓均有效(图2D;71±5%vs。B组75±10%vs.。C组，P = 0.286的33±4.5％），但低剂量在近侧闭塞小伙子的重建流量下显着效果显着较低（A组25±6％vs.B组为100%vs。C组为0%，图2E；p=0.015）。所有在60分钟时恢复血流的血管至少保持通畅1小时。在A组，给药替尼替普酶后60分钟，LAD中的流速达到基线值的30±22%，颈动脉中的流速达到45±12%，而B组分别为160±42%和55±18%（图3A，B；p=0.028）。

图3. A.高剂量或低剂量TNKase后颈动脉血流恢复的百分比。B.高剂量或低剂量TNKase后LAD血流恢复的百分比。缩写：TNKase = TenectePlase

再灌注后心律失常

在心律失常检测的整个实验过程中进行ECG监测。在血管血栓形成期间观察到的心律失常没有显著差异。先前的研究表明，在再灌注的前30秒内，缺血区域内和边界处的动作电位存在明显的不均匀性，这有助于纤颤的发生[12.].根据这些数据，我们观察到A组在再灌注后30分钟内需要复苏的5只动物中有2只出现纤颤，B组有4只出现纤颤。C组（5只动物中有2只）出现AIVR，但在A组或B组中没有发现。在持续性室性心动过速、非持续性室性心动过速、频繁室性早搏和房室传导阻滞方面，两组之间没有发现统计学上的显著差异。还评估了ST段退变与再灌注心律失常的相关性。B组动物的ST段退行性变更大，因此再灌注心律失常的发生率更高。后者可能与不可逆和可逆损伤细胞并列时的最大异质性有关。

血流动力学

表1总结了这些数据。在左室心尖安装Millar压力导管，连续监测左室压力。各组治疗前左室收缩压、舒张压比较，差异无统计学意义。与其他两组相比，C组收缩压明显降低。LAD疏通失败可能解释这一发现。

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参数	心率 （拍/分钟）			平均动脉压 （mmhg）			平均左房压（mmhg）
	GroupA	GroupB	GroupC	GroupA	B组	C组	A组	B组	C组
基线	95±4	101±2.3	96±12	98±1.6	101±3.2	95±2.8	4.8±1.8	4.5±2	5±1
再灌注
15分钟	105±1.9 110±4		101±3.	95±3	95±8	100±6	9±2	7.5±2	9±3
30分钟	101±5.	112±8	100±2.9	100±8	100±5	95±5	8.5±2	8.5±3.	8.5±2
45分钟	112±8	125±5.8	99±4.	105±5.	110±4	86±5	8.5±2	8±4	9±4
60分钟	120±4.9 135±4		100±4	100±4	110±4	80±4	9±2	8±4	10±4.
75分钟	120±6.	135±8	105±3.	110±5	110±4	85±8	8.5±2	7.5±2	9.5±3.
90分钟	125±4.	130±3.	103±4	105±5.	115 ± 3	85±5	8±2	7.5±2	10±3.
105分钟	125±5.	132±3	110±3	105±5.	115 ± 3	95±7	8.5±2	8±2	11±2
120分钟	130±8.	135±3	105±5.	110±7	110±5.	90±5.	8±2	8±2	10±4.

表1。血栓形成体验期间的血流动力学。

生物化学指标

在评估时间点的INR值中没有观察到差异（在所有动物中评估的所有动物中的<1.2）或APTT或PT。也许在评价这些指标的苯锡酶和肝素的短时间内的短时间内的肝素不会干扰全身水平。尽管如此，我们的发现符合先前的报道，伴随着溶栓的溶栓和肝素不会影响止血途径[10.那13.那14.］.

讨论

急性心肌梗死后心外膜冠状动脉血流恢复改善临床预后[15.］.通过溶栓或原发性血管成形术可以实现再生。虽然血管成形术是由欧洲和美国指南累积研究的累积研究质疑血栓栓塞上血管成形术的优越性[16.那17.］.在临床试验中一再评估Tenecteplase的安全性和疗效[8.]，但低剂量替尼普酶恢复血流的效果从未被测试过。在目前的研究中，我们专注于溶栓，并创建了一个模拟急性心肌梗死临床病理的血栓形成实验模型。在成功的血管血栓形成后，我们测试了低剂量替尼普酶在闭塞血管中恢复血流的有效性。我们首次证明，低剂量替尼普酶可在症状开始1小时内恢复大血管(如颈动脉(直径5-8mm))的血流，但不足以恢复小血管(如LAD (2-4mm))的血流。

Mi最常见的原因是动脉粥样硬化斑块的破裂，形成血栓形成导致冠状动脉的闭塞[2那3.］.序列号体外实验研究了动脉粥样硬化的机制，并为新的治疗药物发展铺平了途径[18.］.此外,体内在小型转基因动物身上的实验也阐明了冠状动脉综合征的病理学[19.]然而，最合适的模型应该模拟人类疾病。在目前的研究中，我们使用猪模型制造血栓并模拟心肌梗死的临床情景。我们首先对普通颈动脉和LAD造成外部损伤，从而激活血小板聚集，然后我们注入凝血酶，从而形成血栓。猪和人的血小板功能相似，这使得它们适合目前的方案[20.］.此外，猪的冠状动脉解剖与人类相似，除了左奇静脉流入左冠状静脉窦。这些数据支持了猪血栓形成临床前模型的想法，这将使试验新的治疗动脉粥样硬化的药物成为可能。事实上，按照目前研究中描述的方案，我们成功阻断了80%的lad和57%的颈总动脉，然后我们测试了tenecteplase恢复血流的有效性。

急性心肌梗死的临床前和临床研究中使用了不同的溶栓药物，报道了急性心肌梗死。除了能够通过单个推注静脉注射液体递送的高纤维蛋白特异性，塔替普替换液更有前景更有希望[21.]更具体地说，特奈特普酶是一种基因工程的纤溶酶原激活剂，由于纤维蛋白表面的纤溶酶的溶解活性受到限制，可避免纤维蛋白原、因子V、因子VIII和a2抗纤溶酶的分解，因此导致大出血的风险降低[22.］.与其他溶栓方案相比，替尼替普酶不受硝酸盐等其他药物的影响，具有更强的抗血小板作用，即使在出现症状后4小时以上服用也能发挥更高的溶栓效力[9.那21.那23.］.到目前为止招募了超过25000名患者，这些临床试验招募了滕森普拉酶作为潜在治疗方案，从而使用这种药物证据。符合以前的数据，我们没有观察到在当前研究中评估的生物化学指标的任何变化，所述生化指标在目前的研究中进行的低剂量或高剂量的卵泡蛋白酶，而不改变并行使用的肝素的剂量[24.］.然而，低剂量替尼替普酶恢复了25%的lad血流，而完全剂量后恢复了100%。在颈动脉总血流恢复方面，两种剂量之间观察到相似的效果，这表明低剂量可以安全地用于大动脉血管的血流恢复，而对于直径较小的动脉血管则不行。后者对于缺血性中风很重要，目前溶栓和介入技术的结合是较好的治疗方法[25.］.

我们的数据符合最新的临床试验，该试验使用高剂量的植物重量百分点[10]。然而，75岁以上患者使用的低剂量也能够与我们的研究结果相比实现血管通畅。与人类动脉粥样硬化组相比，可能的解释可以是我们实验模型中的小样的直径。更具体地，在这里使用的小管道的直径约为2-3毫米，而在人体上达到4-5毫米;后者更接近用低剂量和高剂量（〜5mm）重新定义的猪颈动脉。此外，虽然我们在[14]中使用了血栓形成的实验模型来模拟临床动脉粥样硬化斑块，但是LAD的外部损坏也可以导致容器痉挛和容器内径狭窄，可能进一步加剧闭塞，需要更高的剂量Tenecteplase。

总之，在目前的研究中，我们成功地建立了冠状动脉血栓形成的临床前模型，可以对不同的方案进行常规评估。其次，我们使用这个模型来测试低剂量和高剂量替奈普酶恢复冠状动脉和颈总动脉血流的有效性。我们发现，与低剂量组相比，全剂量替尼替普酶治疗后再通的lad数量显著增加，而在普通颈动脉中，两种方案剂量均同样有效。经过开创性的临床试验[11.那26.如果通过培养型血管成形术溶栓，在初级血管成形术时，在迅速速度下达到迅速，可能在医院前阶段，我们的数据支持竞技普替换酶可以提供非常简单有效的治疗，特别是如果随后的原发性血管成形术患者提供给患者高临床风险或经常性缺血。

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