日本帝京大学临床检验科学系
DOI: 10.15761 / BRCP.1000110
低级别慢性全身性炎症已被证明具有引起肥胖、代谢综合征和胰岛素抵抗的潜力。大量的研究已经深入了解了膳食脂肪可以导致肠道细菌中存在的脂多糖(LPS)吸收或渗透到体循环的机制。此外，研究还揭示了先天免疫系统在连接肠道菌群和炎症中的重要作用。高通量测序使宏基因组分析成为可能，揭示了高脂肪饮食引起的肠道微生物群组成的变化。进一步深入了解先天免疫、代谢和微生物群之间相互作用的病理生理学理解将有助于改善治疗。这篇文章着重于导致肠上皮屏障功能障碍的早期事件，并特别强调在研究过程中遇到的技术问题在活的有机体内而且在体外实验。新兴的研究结果强调了LPS与膳食脂肪酸和胆汁酸相互作用的重要性，作为影响肠道屏障完整性的因素。最近的研究结果Akkermansia muciniphila内源性大麻素系统具有深刻的见解，并表明了它们在治疗方面的潜在用途。内毒素的解毒和耐受性是未来的发展方向。虽然不是一篇非系统的综述，但这篇文章的重点是帮助解开微生物学、生物化学和免疫学之间复杂相互作用的研究。
TLR4，脂肪酸，乳剂，嗜粘单胞菌，肠屏障
肠道共生菌群是许多宿主生理过程所必需的，并在许多疾病的发展中发挥重要作用。代谢性疾病的一个主要危险因素是肥胖和相关的代谢障碍，其特征是慢性低度炎症[1,2]。这种亚临床慢性炎症，以及代谢性疾病有助于动脉粥样硬化[3]的发展。代谢紊乱和炎症之间的联系引起了人们对理解脂质对免疫系统的影响以及免疫系统动力学对脂质代谢[2]的影响的兴趣。在白色脂肪组织(WAT)中，几种不同的炎症通路以协调的方式分泌促炎细胞因子和趋化因子，如(白介素)IL-6, IL-1β和单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)。此外，WAT分泌脂肪因子，在糖耐量和炎症反应中发挥重要作用[4]。特别是，发炎的脂肪组织产生脂联素，具有抗炎作用，减少脂质积累。
触发低级别炎症的关键事件是先天免疫系统对各种内毒素的免疫反应，主要是脂多糖(LPS)，这是革兰氏阴性细菌细胞壁的一种独特成分。在大多数临床情况下，存在于肠道菌群中的各种革兰氏阴性菌是众所周知的循环LPS的来源[5-7]。
toll样受体(TLRs)是迄今为止研究得最好的先天免疫受体家族。模式识别受体如TLRs和核苷酸结合寡聚结构域蛋白(NOD)在检测微生物感染诱导炎症反应中起着至关重要的作用。TLRs和NODs的激活都会导致NF-κB(核因子κB)的激活。通过下游信号。TLRs由专业免疫细胞和各器官上皮细胞[8]表达。仅举几个例子，TLR2作为与TLR1或TLR6的异源二聚体，可以检测细菌脂肽。TLR4能够与膜相关蛋白CD14、髓样分化蛋白2 (MD2)和/或其他适配器分子形成受体复合物，并检测LPS [8]
在人体中，寄生共生细菌和单层肠上皮细胞之间的相互作用在调节营养物质的能量收集机制和免疫系统[9]的功能中至关重要。如文中所述，餐后内毒素血症主要发生在高脂肪饮食(HFD)依赖的情况下。最近的研究已经建立了一个共识，低级别炎症的发生是由于消化脂质过程中从肠道反复吸收LPS，这反过来又可能增加动脉粥样硬化的风险[5]。
在过去的十年中，许多报告将元生物生物信息学数据与不同的疾病联系起来。本文主要讨论低度内毒素血症引起的早期改变。因此，可以参考以下最近的综述文章，以获得与重要疾病相关的信息，如肥胖或代谢综合征[2]，糖尿病[10]，肝病[12]，癌症[13,14]，心血管疾病[15]，神经精神疾病[16]和广泛的免疫或炎症疾病[6,17]。越来越多的综述文章聚焦于旨在调节肠道菌群[18]的潜在疗法。
近年来，包括冒险研究可能性在内的转化研究的数量有所增加。根据假设，许多这些努力遇到了挑战和限制，导致了消极的结果。除了报告证实预定义的科学假设的发现外，在本文中，还试图反映作者对相对较少的论文的想法。因此，本文应以更全面的文章作为补充[5,7,19,20]。本文未涉及的重要主题包括代谢产物的作用，如与动脉粥样硬化有关的三甲胺(TMA)和调节参与葡萄糖和能量稳态的肠道激素水平的短链脂肪酸(SCFA)[11,15]。
内毒素通常与脂多糖同义，脂多糖是革兰氏阴性菌外膜的主要成分[21,22]。内毒素可以通过快速诱导细胞生物合成和释放促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子-α (TNF-α)和其他生物活性代谢物，引起循环衰竭和感染性休克，在包括人类在内的广泛宿主物种中诱导强有力的反应。不同种类的细菌产生的LPS形式略有不同，毒性也有所不同。LPS通过脱落或细菌裂解从细菌细胞壁释放[24]。在化学上，LPS是一种两亲性分子，由亲水多糖成分与称为脂质a的疏水成分相连。脂质a是LPS的生物活性内毒素亚单位。
本文主要讨论肠道来源的LPS，而不是外源性微生物感染进入循环的LPS。数以万亿计的共生细菌所在的肠腔内，有最高浓度的LPS[25]。细菌及其碎片成分可通过淋巴系统等多种途径进入体循环[26-28]。虽然他们没有进入通过肝门系统，创伤性损伤允许它们进入体循环。此外，据报道，低浓度的HFD可促进细菌产物进入体循环。
根据实验设置，肠道粘膜的细胞旁通透性和跨细胞转运都被认为是重要的，而后者被认为在提高体循环中的LPS水平方面更有效。这一过程绕过了肝脏解毒，因为LPS与营养脂质一起被包装成乳糜微粒，然后进入淋巴系统运输到体循环。除了有关测量的技术问题(下文将提到)，LPS引发的促炎信号可能取决于其详细的化学和物理结构，例如磷酸基团(可由碱性磷酸酶去除)的存在，以及相关分子，如胆汁酸、脂肪酸(FAs)、膜或脂蛋白。
人血清中LPS的存在主要使用limus变形细胞裂解物(LAL)测定，由于血清中存在干扰化合物，该方法存在技术缺陷[29,30]。LPS以其重量(ng)或内毒素单位(EU)进行量化。术语EU反映了样品中存在的LPS分子混合物的内毒素活性。根据世界卫生组织的国际标准，1 EU被定义为由120 pg LPS诱导的内毒素试验测定的生物活性大肠杆菌O113: H10: K[30]。然而，在血浆中测量的LPS绝对值在各个研究中显示出很大的差异，这可能是因为LAL测定对预处理程序具有更高的敏感性。在健康受试者中测量的平均值为0.15至61 EU/mL(中位数为0.32 EU/mL)或0.5至65 pg/mL。而稀释样品的平均值为12.1 EU/mL，远高于未稀释样品[30]。因此，对于低级别内毒素血症患者，绝对LPS水平是相当不可靠的，这表明非参数统计分析在这些病例中的相对重要性。Gnauck最近使用了LPS ELISA试剂盒等．[31]而不是LAL试验，在恢复试验中，已知剂量的LPS被添加到血清样本[31]中。
LPS结合蛋白(LBP)识别LPS并将其转移到CD14，从而增强宿主细胞的刺激。LBP还能在体外将LPS转化为HDL颗粒[32,33]。LBP是一种急性期蛋白，主要由肝脏产生，与LPS的脂质A部分结合，增强其激活免疫细胞的能力。LBP具有独特的识别和结合脂多糖多聚体或脂肪胶束中包含的脂多糖的能力，启动其单体化。免疫受体和蛋白质如CD14, TLR4和MD-2识别并结合到LPS单体，并启动免疫反应[32]。夯击等．[33]对LBP有双峰效应。在体外，加入< 1µg/mL的重组LBP (mLBP)可导致LPS刺激后TNF-α分泌增加。然而，与0.1µg/mL mLBP的情况相比，急性期mLBP浓度较高(10µg/mL)刺激TNF-α分泌减少，以应对LPS挑战。因此，急性期LBP可能对LPS和细菌感染有保护作用。在临床和啮齿动物研究中，LBP越来越多地用作代谢性内毒素血症的相关标记物，尽管全身炎症应引起包括LBP在内的急性期蛋白的非特异性升高。Laugerette[34]进行的研究结果表明，在个体小鼠(以富含棕榈油的饮食喂养)中，血浆LBP和血浆IL-6之间存在相关性(r = 0.905)。
LPS不能直接与TLR4/MD-2结合，必须由CD14[23]呈现。CD14是对LPS具有特异性的多功能蛋白，与TLR4共同形成激活先天免疫系统的复合物。CD14以两种形式存在，即作用于单核细胞、巨噬细胞和多形核白细胞表面的膜结合糖蛋白形式(mCD14)和循环可溶性形式(sCD14)[35]。sCD14通过促进LPS胶束转移到HDL，进而转移到磷脂酰胆碱膜，协助其转运到肝脏，从而促进解毒，从而抑制内毒素活性[36,37]。sCD14和LBP的双重刺激和抑制机制已被Kitchens和Thompson[38]综述。一般来说，LBP似乎像其他急性期蛋白一样反映炎症水平，但sCD14似乎具有保护作用;高sCD14可以抵消LPS存在时炎症的进展。
细菌暴露的其他潜在标志包括细菌FAs。在一项随机对照人体试验中，ummoh等．[39]对地中海饮食和健康饮食[40]进行了6个月的测试。与对照组相比，两种饮食干预均未检测到血清LBP浓度的变化。然而，在个体中，LBP与c反应蛋白(CRP)呈正相关，与类胡萝卜素呈负相关。重要的是，在两个饮食组中都观察到支链细菌脂肪酸(bfa)的浓度下降。因此，通常存在于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中的BFAs可以作为检测细菌暴露程度的有前景的直接标记物。
作为对HFD摄入的反应，LPS可以通过细胞旁渗透性介导的直接扩散或乳糜微粒分泌过程中肠细胞的吸收从肠道扩散到血流[26- 28]。
Cani等．[41]研究了LPS是否可能是依赖于摄食状态的生理调节因子。喂食高脂饲料(72%脂肪、玉米油和猪油)4周后，小鼠的血浆内毒素浓度持续增加，而对照组的内毒素浓度仅在喂食时间内升高。在hfd喂养的小鼠中，几种细菌属于直肠真杆菌/球状梭菌组,双歧杆菌属而且拟杆菌类小鼠肠道细菌显著减少。HFD增加空腹血糖和胰岛素抵抗，同时全身、肝脏、内脏和皮下脂肪组织的体重增加。脂肪组织中可见巨噬细胞浸润。此外，在肝脏和内脏脂肪组织中检测到TNF-α， IL-1和IL-6 mRNA水平升高。皮下输注LPS也产生了类似的效果，保持了与hfd喂养小鼠相似的循环LPS浓度。据报道，这些影响是由TLR4和CD14介导的。
根据Cani等．[41]，与对照组相比，72% HFD使内毒素血症增加2.7倍。当小鼠被喂食40%的高热量膳食时，这一增长仅为1.4倍。如果假设这些结果也适用于人类，因为伦理问题会限制饮食脂肪的摄入，那么这样的差异将导致统计上的挑战。严格来说，在Cani的研究中等．[41]，采用LAL法测定LPS的血药浓度。此外，LBP水平和其他相关参数未报告。
Erridge等．[42]表明，在健康人群中，餐后血浆内毒素浓度相对于禁食状态平均增加18%(约380千卡来自脂肪，占总能量的42%)。为了验证用LAL法得到的结果，作者使用内毒素中和能力测定法测量血浆中内毒素中和物质的消耗(减少);这些物质的减少表明之前接触过内毒素。
Ghanim等．[43]显示，与美国心脏协会(AHA)推荐的膳食相比，含有910大卡高脂肪、高碳水化合物的膳食，餐后1、2和3小时，人餐后血浆LPS增加47%，血浆LBP增加34%。这种增加伴随着血液单个核细胞中TLR2和TLR4 mRNA表达的增加。
sCD14和血浆LBP被认为是反映内毒素长期暴露的相关标志物，而不是内毒素本身的测量。这种估计是相关的，因为sCD14和LBP的半衰期较长，从24-48小时不等，与内毒素在小鼠中的< 8分钟和在人类中的最大3小时相比要长得多[34,44]。
Laugerette等．[34]显示LPS与FAs之间具有协同促炎作用。研究人员让小鼠连续8周食用富含乳脂、棕榈油、菜籽油或葵花籽油的食物。棕榈油的主要FA成分为16:0(45%)和18:1 n-9(37%)，其中18:3 n-3含量较低(0.5%)，菜籽油的主要FA成分为18:1(59%)和18:2(23%)，其中18:3 n-3含量较高(9.7%)。有趣的是，与其他饮食相比，富含棕榈油的饮食在血浆(基于IL-6)和脂肪组织(IL-1β和TLR4)中诱导的炎症最高。菜籽油为基础的饮食导致较低的炎症，尽管内毒素血症升高，这可能是由较高水平的sCD14介导的，表明sCD14具有保护作用。看来，不仅来自肠道的LPS，而且饮食脂肪对内毒素受体、转运蛋白和CD14激活的影响似乎在随后的免疫激活中起着重要作用。以富含棕榈油饮食喂养的小鼠显示血浆LBP与IL-6之间存在相关性(r = 0.905)，尽管LBP的升高可能是继发于炎症。这些观察结果表明FAs和LPS之间存在协同作用;除了循环中存在的LPS水平外，同时从肠腔吸收的FAs饱和水平也对内毒素受体的激活产生影响。
Laugerette等．[45]进一步表明，健康受试者过度喂养8周(+760千卡/天)，显示出LBP/sCD14水平升高，这表明体重增加初始阶段的炎症设置与LBP和sCD14[45]的相对变化有关。
这些研究已达成共识，即膳食脂肪可增加循环LPS的浓度，由此导致的餐后内毒素血症可导致低度全身炎症，这与代谢紊乱有关。
在餐后内毒素血症的早期阶段，肠腔内存在的LPS进入淋巴系统，最终通过跨细胞运输进入血流。乳糜微粒是一种脂蛋白，它将甘油三酯从肠道运输到脂肪组织，是这一阶段LPS的重要载体。长时间的HFD和/或全身炎症导致紧密连接屏障功能障碍，导致肠道渗漏。这一观点考虑到与各种因素的关系，假设了从细胞外渗透到细胞旁渗透的转变。然而，膳食中存在的乳化FAs很可能导致紧密连接功能障碍，直接导致肠道渗漏。本文就近年来有关内毒素解毒与耐受的研究作一简要综述。
脂多糖的跨细胞上皮转运-早期事件:为了研究与LPS的跨细胞上皮转运相关的早期事件，Tomita等．[46]使用的扩散室系统，结肠上皮组织分离自正常大鼠。FITC(荧光素异硫氰酸酯)-LPS浓度为100 ng/mL时，从黏膜到浆膜(M到S)方向的通透性高于S到M方向。两个方向的渗透性都依赖于温度，这表明参与了酶和/或能量依赖过程。与正常大鼠相比，实验前4小时腹腔注射LPS未检测到上皮导通有任何显著差异，这表明包括紧密连接在内的细胞旁通路在预暴露后未发生改变。因此，FITC-LPS的渗透性至少部分是由一种特殊的跨细胞转运系统介导的，而不是紧密连接。双向转运均依赖于CD14和TLR4。虽然这项研究没有测试饮食脂肪的影响，但包括这项研究在内的努力已经确定了tlr4介导的、能量依赖的跨细胞转运机制对LPS的影响。
摩尼et al。[47]比较了饲喂对照饲料和添加鱼油、植物油和椰子油的饲料的猪。餐后(1 ~ 5小时)，饲粮中饱和脂肪酸含量相对丰富的椰子油增加了猪血清内毒素，而鱼油饲粮没有增加内毒素。作者还进行了离体分析，将正常猪回肠样品装入改进的Ussing室，并用不同的油处理2小时。鱼油和鱼肝油降低了FITC-LPS的通透性，而椰子油增加了通透性。脂质筏修饰剂甲基-b-环右旋糖酐处理极大地损害了FITC-LPS的转运。值得注意的是，通过实验，经上皮阻力没有变化，这表明FITC-LPS的通透性主要由筏介导的内吞作用决定。
因此,摩尼et al。[47]显示饱和富fas油(几小时内)对LPS渗透的快速作用。有趣的是，在餐后的早期阶段，LPS渗透的发生依赖于特定类型的FAs和脂质筏的某些功能。这项研究的一个优点是，与使用乳化FAs的实验相比，使用了相对常见的饮食。虽然目前尚不清楚不同FAs对脂筏功能的不同调节是否是关键问题，但本研究表明，脂筏介导的LPS吸收率可能对饮食中饱和FAs的比例敏感。
膳食脂肪被肠上皮细胞吸收，并作为甘油三酯并入乳糜微粒。乳糜微粒及其残余物在进入血液之前通过肠系膜淋巴运输，并在肝脏和其他器官/组织中被清除或运输到脂肪组织。乳糜微粒对LPS具有较高的亲和力[48,49]。
Ghoshal等．[27]在小鼠实验中显示，摄入长链甘油三酯(三烯烃)6小时会导致血浆LPS增加，这种增加主要与乳糜微粒残余部分有关。乳糜微粒残余物是与甘油三酯转移到脂肪组织的乳糜微粒相对应的颗粒。摄入三油酸促进脂多糖吸收到肠系膜淋巴结依赖乳糜微粒的形成。他们进一步表明乳糜微粒的形成增强了Caco-2细胞基底外侧LPS的分泌。
正如[27]中所讨论的，尽管肠上皮细胞获得的一些LPS仍然保留在细胞膜[50]上，但大量的LPS被内化并定向到高尔基体，其中TLR4最多驻留[51]。
Laugeretteet al。[28]主要研究饲粮脂肪的不同结构(水包油乳剂、游离油或分散体)和组成对脂质和LPS吸收动力学的影响。在人类中，餐后LPS和sCD14在含分散脂类的混合餐1小时后增加(超过餐后4小时)(不添加LPS)。在大鼠身上，他们还表明，与非乳化油相比，乳化油(葵花籽油在生理盐水中加入卵磷脂，浓度为35 mg/ml)可以增强餐后内毒素血症。引人注目的是，他们的Caco-2实验表明，与仅与LPS(1微克/毫升)孵育相比，吸收率可以忽略不计，当添加含有0.5 mM或1.5 mM油酸的脂质胶束时，观察到LPS吸收率显著提高。值得注意的是，胶束中含有牛磺胆酸酯、卵磷脂和胆固醇。当根尖侧存在LPS时，LPS吸收是有效的(也就是说,面对肠腔的一侧)包含在乳化结构中，可能是因为这扩大了有助于消化的表面积和/或当磷脂充当洗涤剂时，已知磷脂含有在膳食脂肪中，可促进吸收。
因此，除了FAs的数量外，饱和水平和乳化程度对肠道内LPS的吸收也很重要。与富含fa的乳剂相比，主要由胆汁酸组成的生理乳剂是否更安全，并限制LPS的吸收率，这将是一个有趣的问题。
肠道紧密连接处:紧密连接是肠上皮屏障的重要组成部分。物质的入侵，如存在于腔内的LPS，通过紧密连接被称为细胞旁入侵。紧密连接的结构是动态的，可被炎症破坏[52,53]。包括TNF-γ、TNF-α和IL-6在内的细胞因子通过增加肌凝蛋白轻链激酶、磷酸化肌凝蛋白轻链(pMLC)和claudin-2(一种属于claudin家族的孔隙形成类型的蛋白质)[53]的表达来增加肠道的通透性。紧密连接的主要成分如occludin、claudin和occludens-1的细胞质隔离(内化)会导致屏障功能的破坏[53,54]。
布朗等．[55]报道基因肥胖小鼠(ob/ob而且db/db与对照组小鼠[55]相比，小鼠[55]具有较低的肠阻力，肠黏膜occludin和occludenas -1 (ZO-1)分布的改变和较高水平的门静脉内毒素血症。de La Serre等．[56]表明hfd诱导的肥胖与肠道炎症、通透性增加导致闭塞蛋白内化和pMLC[56]增加有关。
Guo-Ma[57]研究了炎症性肠病(IBDs)相关水平的循环LPS对肠上皮屏障[57]的影响。ibd的脂多糖循环水平略高于肥胖和代谢综合征。然而，这项研究可能会揭示轻度内毒素血症的影响。基于经上皮电导和菊粉通量的测量，他们表明，0.3 ng/mL或以上的LPS导致Caco-2细胞(过滤培养，单层)的通透性增加。这种通量增加发生在添加LPS后4天。LPS在其他细胞系(NCM460，一种人类结肠粘膜上皮细胞系和T84，一种结肠腺癌细胞系)中显示出类似的作用。清除LPS可在2天内恢复对Caco-2的耐药性。在基底外侧添加LPS对Caco-2的影响是明显的，而在根尖侧添加LPS的影响可以忽略不计。此外，通过sirna诱导TLR4表达的沉默和TAK-242 (TLR4信号通路抑制剂)，他们证明了Caco-2中看到的上述结果是由TLR4介导的。在活的有机体内，在小鼠中，给予稳定浓度的LPS (0.4-0.5 ng/mL，而对照组小鼠为0.017 nm/mL)，在第5天显示德克萨斯-红-右旋糖酐(10 kDa)的渗透增加，这表明临床相关浓度的LPS可以增加肠道的通透性。敲除小鼠的实验证明TLR4参与了这一过程。在上述实验中，两者，在体外而且在活的有机体内这种现象是由lps诱导的TLR4和CD14的表达介导的，这是一个相对缓慢的过程(几天)。作者进一步证明，在生理水平上，LPS可在上皮细胞内启动TLR4信号转导级联，导致局部粘附激酶(FAK)激活3-5天[58]。FAK的表达和信号通路已被证明在多种细胞类型[59]中促进细胞粘附、凋亡、迁移和增殖。
影响肠屏障的其他病理生理和免疫因素:最近，一些优秀的综述文章总结了几种影响肠道通透性的非饮食因素的数据。这些因素包括刺激通过交感神经系统，促肾上腺皮质激素释放激素(诱导TLR4的表达)，运动引起的热应激和饮酒。
多项研究表明，成熟的人肠上皮细胞(IECs)对LPS表现出低反应性，这可能是基于TLR4/MD2复合物下调[61]。在阴道分娩期间，小鼠新生儿IEC暴露于LPS可诱导TLR4通路激活，随后白细胞介素-1受体相关激酶1 (IRAK-1)蛋白水平下降，导致获得对LPS的耐受[23,62]。
hfd诱导的屏障通透性增加部分是由IFN-γ和IL-1β的作用引起的，而IL-22和调节性T细胞(Tregs)则发挥了保护作用。在小鼠和大鼠远端小肠中，长时间饲喂hfd可诱导NF-κB表达，TNF-α和IL-1β升高。通常情况下，在2周后，而不是1周后，这种增加是明显的，这表明促炎变化[7]的表达需要一个相对较长的时间过程。长时间喂食hfd对TLRs信号、核苷酸结合寡聚结构域(NOD)样受体(NLRs)、先天淋巴样细胞(如γδT细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞)以及适应性免疫系统的影响已经在其他地方详细讨论。
第5节讨论了碱性磷酸酶对LPS的解毒作用。在这里，简要讨论了从循环中清除LPS的机制。在这两个在活的有机体内而且在体外在实验中，LPS迅速与脂蛋白结合。与游离LPS相比，脂蛋白结合的LPS促炎性较弱，清除速度较慢，这可能是因为脂质A部分在脂蛋白胶束内被隔离[63-65]。
在早期研究中，肝脏被认为是LPS清除的主要部位[55,66]。无酰氧酰基水解酶(AOAH)，一种存在于Kupffer细胞中的酶，具有很强的解毒能力。该酶也在非肝巨噬细胞中表达[67,68]。据报道，肝细胞参与LPS清除[69,70]。这里将讨论一些突出的发现。
邓等．[68]使用了组织特异性tlr4敲除小鼠(髓系细胞和肝细胞)，结果表明，盲肠结扎穿刺(CLP)后，在没有抗生素的情况下，髓系细胞(巨噬细胞和中性粒细胞)的吞噬作用需要快速清除细菌和LPS。TLR4对于巨噬细胞和中性粒细胞介导的吞噬细菌清除至关重要。然而，在抗生素存在的情况下，肝细胞通过tlr4介导的LPS清除对于防止可能导致炎症的低水平LPS非常重要。这些结果表明，LPS清除的主要机制在某种程度上取决于血浆中LPS的水平。
Imajo等．[71]研究表明，在小鼠中，尽管正常肝脏对餐后门静脉LPS的正常水平基本无反应，但Kupffer细胞中CD14的过表达引发了非酒精性脂肪性肝炎的进展通过对低剂量LPS的高反应性。有趣的是，在hfd诱导的脂肪变性小鼠中观察到Kupffer细胞中CD14的上调，但在对照组小鼠中没有。引人注目的是，对照组小鼠的瘦素治疗导致CD14的肝脏表达增加通过STAT3(信号换能器和转录激活因子3)信号通路，导致对低剂量LPS的高反应性而无脂肪变性。考虑到瘦素是一种抑制食欲和提高胰岛素敏感性的激素，这是一个意想不到的结果。这项研究表明，对LPS的免疫反应是由激素等因素复杂地控制的。
在Imajo进行的研究中等．[71]，当细菌水平与败血症一样高时，TLR4支持肝脏对餐后LPS水平的清除，以及巨噬细胞和中性粒细胞介导的对LPS的吞噬清除。然而，某些报道表明，肝细胞对LPS的摄取产生了耐受性，这是由先前暴露于低水平的LPS介导的[72]。更复杂的是，从瘦素缺乏的小鼠中分离出的肝星状细胞对LPS的敏感性增加。ob/ob)，与正常小鼠[55]相比。因此，调节对LPS的耐受性和致敏性似乎在肝脏对长期低水平LPS暴露的反应中很重要。这是诱人的设想，对LPS敏感性的微妙调节可能是通过脂肪组织、肠细胞和巨噬细胞中的激素。
膳食中的三酰甘油在胃肠道中被水解并产生FAs。富含饱和FAs的饮食与与血脂异常、胰岛素抵抗和动脉粥样硬化相关的代谢性疾病的发展有关[73,74]。关于FAs、饱和FA的一般促炎作用以及n-3 (ω-3)多不饱和脂肪酸(PUFAs)的益处的研究已经有充分的文献记载[73,74]。
n-3 PUFAs是过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)-γ和PPAR-α的首选激活剂，解释了它们对脂肪质量减少的作用[75]。n-3 PUFAs作为花生四烯酸对产生促炎类二十烷酸的环加氧酶的竞争性抑制剂。尽管部分原因是与花生四烯酸的竞争，但富含n-3 pufa的饮食可以显著调节人类和啮齿动物中花生四烯酸衍生的内源性大麻素水平，如2-花生四烯酸甘油(2-AG)[7,77]。此外，最近的发现揭示了FAs的G蛋白偶联受体(GPCRs)的存在，表明了FA的另一个功能水平。然而，考虑到饱和FAs能够在细胞表面形成脂质筏，并且它们本身是信号分子的前体，它们很可能在多个水平上发挥作用，有些是物理化学的，有些是更具体的。FAs不同功能水平的相对意义需要进一步研究[73,74]。
一些关于FAs对肠屏障的影响的研究，似乎有些不被重视，被讨论。FAs可以增强肠道药物吸收，例如在Caco-2细胞模型中使用甘露醇的实验[78]。引人注目的是,Kvietys等．[79]表明，由10-40 mM油酸(16:1)和20mM胆盐组成的乳剂可引起麻醉大鼠空肠黏膜的破坏在活的有机体内和肠上皮细胞(IEC-18)在体外，根据测量使用51Cr-EDTA[79]。Aspenstrom-Fagerlund等．[80]表明FAs乳剂与油酸或二十二碳六烯酸(C22:6 n-3, DHA)都有破坏肠上皮屏障的潜力。因此，上皮损伤可能是饮食消化吸收过程中较为常见的事件[79]。这一发现令人震惊，因为尽管众所周知DHA乳剂对我们的健康有益，但它会损害肠道上皮的完整性，导致肠道渗漏。需要注意的是，在修复正常消化和吸收过程中引起的上皮层浅表缺损时，剥落的基底腔的恢复或快速上皮化(以小时为单位)可能发挥重要作用[81]。
最近值得注意的研究包括关于丁酸盐的研究，丁酸盐是革兰氏阳性厌氧菌产生的一种短链脂肪酸，是不可消化碳水化合物发酵的产物[82]。丁酸盐往往通过与GPR43结合来减轻炎症[74]。丁酸盐还通过刺激血管生成素样蛋白-4 (ANGPTL-4)的表达具有抗肥胖作用[81]。
在动物模型和临床试验中，长链n-3 PUFAs，如二十碳五烯酸(C20:5 n-3, EPA)和DHA在IBDs的治疗中发挥了有益作用[74]。在一个在活的有机体内在炎症模型仔猪注射LPS和补充鱼油4 h后，肠道黏膜中EPA、DHA和总(n-3) PUFA含量增加，TLR4和NOD2信号通路受到抑制，肠道完整性改善(紧密连接蛋白数量增加)[84]。值得注意的是，NOD1和NOD2可通过TLR4和TNF-α被LPS间接激活。
接下来，重点是寻找FAs是否能结合TLR4。李等．[85]在对293T细胞进行的转染实验中，数据表明饱和脂肪酸和PUFAs对TLR4激活的相互调制。这证实了总体饱和FAs有利于TLR4刺激的趋势。[86]然而，Erridge[87]报道饱和FAs缺乏直接刺激TLRs的能力，并强调了从实验系统中排除污染LPS和脂肽所需措施的重要性[88]。舍弗勒等．[89]观察到FAs诱导脂肪细胞TLR4/NF-κB通路的诱导，但这种作用是由内源性配体引起的，因为FAs被证明不直接与TLR4/MD-2结合[89]。朋友等．[90]报道了肝脏分泌糖蛋白fetuin A作为TLR4的内源性配体，介导上述FAs对TLR4的刺激。然而，进一步分析胎儿素A将有助于Jialal等[91]报道单核细胞TLR4与血浆胎儿素A之间没有显著相关性。这些结果表明，在人类中，胎儿素A可能介导FAs的作用，但它可能通过激活TLR4以外的机制诱导胰岛素抵抗[91]，尽管胎儿素A与游离FAs表现出很强的相关性。由于饱和FAs作为前体的作用，出现了进一步的并发症。饱和FAs用于神经酰胺或其他功能性脂质的生物合成，从而允许或增强TLR4活性[92]。FAs还可以修饰双分子层的物理性质，并调节各种信号分子的筏和信号活性[93]。此外，最近对FA受体进行了研究，并对其中一些受体进行了综述。
许多研究都集中在可以识别FAs的GPCRs上。举几个例子，Hirasawa等．[94]表明，在肠道中大量表达的GPR120可作为不饱和长链Fas的受体。FAs刺激GPR120促进了胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)的分泌，在体外而且在活的有机体内增加了血液循环中的胰岛素水平。GPR120在脂肪组织和促炎巨噬细胞中表达。此外，鱼油中的主要成分n-3 PUFAs (DHA和EPA)通过GPR120发挥了强大的抗炎作用[95]。用n-3 PUFAs或化学激动剂刺激GPR120可在单核细胞RAW 264.7细胞和原发性腹腔巨噬细胞中引起广泛的抗炎作用。在人类中，功能缺失的GPR120基因变异导致肥胖、胰岛素抵抗及其后遗症的风险增加[96]。这些发现与鱼油的有益作用是一致的。肥胖大鼠经i.c.v.注射n-3 PUFAs可通过下丘脑GPR120受体产生局部抗炎作用[97]。Anbazhagan等．[98]研究表明，在Caco-2细胞中刺激GPR120以β- arretin -2依赖的方式抑制NF-κB的激活。Bjursell在野生型小鼠中观察到了类似的效果等．[99]使用GPR120缺乏小鼠品系，这使得作者得出结论，GPR120似乎对于摄入富含n-3 PUFAs的饮食所改善的代谢特征是可有可无的。这些结果表明n-3 PUFA可以通过多个层面发挥有益作用，其相对意义尚待研究。
不同的肠道菌群，它与我们的健康和相关的临床问题的相关性已经在各种综述中进行了总结，包括Marchesi等．[100]。下面就肠道屏障的相关研究作一简要综述。
大量研究表明，饮食的影响及其在肠道菌群调节中的作用[100101]。与非洲农村人群相比，西方人群的肠道菌群组成存在较大差异，这与微生物多样性的降低有关[102]。LeChatelieret al。[103]描述了肥胖与细菌丰富度低的关系。饮食中限制能量可提高细菌丰富度。然而，在基因丰富度较低的个体中，这种饮食干预对炎症变量的效果较差[104,105]。
在几项研究中，肠道菌群的巨大变化被发现与转向高热量饮食有关，包括减少热量摄入拟杆菌门两者都有所增加厚壁菌门而且变形菌门[11105]。Wu进行的横断面分析等．[106]对98个个体的粪便样本进行16S rDNA测序和鸟枪宏基因组学分析，发现肠型与长期饮食有关，特别是蛋白质和动物脂肪(拟杆菌)与碳水化合物(普氏菌)．的比值明显更高厚壁菌门和拟杆菌与瘦对照组和肥胖受试者相比，在2型糖尿病中有报道[107]。虽然讨论非饮食因素对肠道菌群的影响超出了本文的讨论范围，但值得一提的是，压力会改变肠道运动和粘蛋白的产生，从而改变常驻细菌的栖息地[108]。
许多研究已经确定了高热量饮食对微生物组组成的影响，然而，这种差异与人类健康之间的联系仍有待解释。的重要性厚壁菌门和拟杆菌比率本身是一个有争议的问题，因为LPS是从后者衍生出来的。这些变化可能只是说明微生物群落如何形成生态系统并迅速适应食物的变化。尽管如此，也有一些与不同益生菌菌株、益生元治疗以及粪便(肠道菌群)移植相关的阳性结果的例子[100]。
寄生在肠道中的共生细菌通过多种机制以多种方式对肠道屏障产生重大影响，我们将在下一节中讨论。许多致病菌包括，幽门螺杆菌，E。杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌,空肠弯曲杆菌通过增加炎症改变或分解紧密连接，从而导致肠道渗漏[109]。
采用常规饲养小鼠盲肠内容物定植无菌(GF)小鼠后，原始GF小鼠体脂含量增加60%，胰岛素抵抗增加[110]。此外，微生物群促进了来自肠腔的单糖的吸收，而微生物群诱导的脂肪细胞中甘油三酯的沉积需要抑制Fiaf(空腹诱导脂肪细胞因子，后来称为ANGPTL-4)，这是一种循环脂蛋白脂肪酶抑制剂。
在探索有益益生菌干预相关知识的过程中，使用动物模型和细胞培养系统的研究表明，乳酸菌和双歧杆菌能够抵消细胞因子、化学物质、感染或应激引起的细胞旁通透性增加[111,112]。给予益生元(低聚果糖)ob/ob老鼠增加双歧杆菌属种虫害和乳酸菌spp。[113]。这种增加反过来又与炎症和氧化应激标志物的减少有关。此外，它改善了紧密连接的完整性，从而降低了肠道的渗透性。在代表坏死性小肠结肠炎的小鼠模型中，给予由双歧杆菌属对象稳定紧密连接处的跛行，防止肠屏障功能障碍[114]。这些发现与HFD诱导肠道菌群改变导致[26]双歧杆菌数量减少的结果一致。在不久的将来，这些发现背后的分子机制可能会被破译，尽管这些影响可能涉及免疫系统[7]的复杂相互作用。
饮食与微生物群、炎症和代谢之间的联系很难在一项研究中得到解决。然而，凯撒却做出了这样的努力et al。[115]，用猪油喂养小鼠11周。在实验结束时，与喂食鱼油的小鼠相比，这些小鼠显示TLR激活和WAT炎症增加，胰岛素敏感性降低。根据GF小鼠的分析，两组之间的表型差异部分归因于微生物群组成的差异。盲肠菌群移植的分析表明，用鱼油喂养的小鼠的菌群抵消了随后用猪油喂养的小鼠的肥胖和炎症。趋化因子CCL2被发现有助于在猪油喂养的小鼠中微生物群诱导的WAT炎症。16S rRNA测序表明，微生物群组成有24%的变异，这可以通过脂肪来源的差异来解释。考虑到同一组小鼠个体间的差异，这一结果是显著的。(核心微生物组和人类个体间差异已被报道[116]。)在以猪油喂养的小鼠和以鱼油喂养的小鼠的盲肠样本中，短链脂肪酸的水平基本相似。用猪油喂养的小鼠血清中TLR2和TLR4的配体水平较高。 Sequence profiling of bacteria in blood (vena cava) and WAT did not show significant difference between mice fed on lard or fish oil. Thus, it is likely that the gut microbiota stimulates inflammation through their pro-inflammatory molecules rather than by translocation of the bacteria themselves. This report also revealed that mice fed with fish oil had increased number of bacteria belonging to the genera乳酸菌而且Akkermansia muciniphila．
研究答:muciniphila为研究肠道菌群对肠道屏障的影响提供了重要的见解。答:muciniphila是一种黏液降解细菌，存在于黏液层[117]。HFD方案降低了双歧杆菌属种虫害和答:muciniphila[41118]。在一个在活的有机体内在HFD小鼠模型中，代谢障碍在测试期间(12周)随着时间的推移逐渐发展[119]。丰富的双歧杆菌spp．而且答:muciniphila与脂质代谢标志物(FA氧化和脂肪褐变)密切相关，与脂肪组织炎症、循环葡萄糖、瘦素、甘油三酯和胰岛素呈负相关。有趣的是,Bilophila wadsworthia呈现相反的趋势[119]。增加的丰度b . wadsworthia与脂肪摄入和炎症有关[120]。
在饮食引起肥胖的小鼠中，口服答:muciniphila减少脂肪量增加和WAT巨噬细胞浸润，改善肠道屏障功能(恢复HFD稀释的粘液厚度)和葡萄糖代谢[118]。
花生四烯酸衍生的内源性大麻素(eCBs)水平升高与肥胖有关[73,121]。eCBs是根据细胞膜磷脂的需求而产生的。eCB系统可能是能量稳态和代谢的关键信号系统。eCBs可能至少占了部分的有益影响答:muciniphila[122]。关于其对肠道屏障的影响，被充分研究的eCBs的例子包括2-AG和n -花生四烯酮酰乙醇胺(AEA，也称为anandamide)。总的来说，AEA有助于肠道屏障功能的破坏，而2-AG对屏障完整性有有益的影响在活的有机体内[122]。2-AG是CB1和CB2受体的主要内源性激动剂，参与肠道运动、分泌和炎症[123]。正如Cani所述等．[122]，已知肥胖具有更强的内源性大麻素系统，大脑、肝脏、脂肪组织和肌肉中的eCBs水平和CB1活性增加。值得注意的是，CB1敲除小鼠已被证明对饮食诱导的肥胖具有抗性[122]。
益生元对肥胖小鼠的治疗(ob/ob)降低肠道AEA含量，增加脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)的mRNA水平，FAAH可降解包括AEA在内的几种eCBs，与血浆中低水平的LPS相关[124]。在肥胖小鼠中，给予CB1受体拮抗剂(SR141716A) 12天，部分恢复了紧密连接蛋白ZO-1和occludin的定位，并降低了循环中的LPS水平[124]。相比之下，野生型小鼠给予CB1/CB2激动剂HU-210可增加肠道通透性并加剧糖耐量[125]。顶端应用AEA和2-AG会加剧edta介导的Caco-2细胞通透性的增加，尽管基底外侧应用会增强edta诱导的通透性的恢复[126]。多项研究支持2-AG可以对抗小鼠结肠炎和结肠炎引起的全身炎症的结论[127,128]。
埃弗拉德et al。[129]提供了先天免疫系统的功能可以影响肠道菌群和eCB系统的一个例子。在髓样分化蛋白88 (MyD88)敲除小鼠中，肠道菌群组成发生改变，抗炎eCBs、2-AG和2-油酰甘油(2-OG)水平升高，AEA水平降低[129]。口服答:muciniphila增加回肠中2-OG、2-AG和2-棕榈酰甘油(2-PG)的水平[118]。2-OG结合到GPR119[130,131]，刺激肠道l细胞产生GLP-1和GLP-2。GLP-1刺激胰岛素分泌，GLP-2稳定肠屏障[113,122]。2-PG增强2-AG的抗炎作用[118]
殖民的机制答:muciniphila2-OG、2-AG和2-PG在回肠中的表达增加目前尚不清楚。鉴于欧洲央行的语调在相对较长的时间内发生变化，分析因果关系可能具有挑战性。尽管如此，研究发现答:muciniphila为今后的研究提供了一个范例。
如上所述，一些值得注意的发现提高了我们对饮食和低度内毒素血症之间关系的理解，并有助于改进治疗方法的发展。刘研究等．[84]表明不同的FAs对细胞形态有不同的影响。例如，与玉米油饲粮相比，食用21天鱼油饲粮增加了空肠和回肠绒毛高度以及绒毛高度:隐窝深度比，表明肠道形态改善[84]。考虑到这一点，有趣的是乳化FAs显示出对肠道屏障完整性的妥协。长链n-3 PUFAs在对抗FAs乳化结构的屏障完整性方面并不安全[80]。为了更好地理解生物化学方面，在存在胆汁酸生理水平的情况下，对各种FAs乳剂的结构表征将有所帮助。可能是不同FAs/LPS组成的胶束导致了不同的吸收率。测试各种乳糜微粒残留物样脂蛋白的tlr4刺激效果也很有趣在体外而且在活的有机体内．
虽然这里没有讨论，但从与碱性磷酸酶相关的研究中可能获得其他有趣的线索。LPS的结构，特别是磷酸基的数量影响MyD88和TRIF (Toll/IL-1结构域包含适配器诱导IFN-β)依赖通路的激活平衡，从而影响整体炎症反应[23]。碱性磷酸酶可以降低LPS的毒性，在活的有机体内而且在体外通过脱磷酸作用。肠道碱性磷酸酶(IAP)在口服LPS后2小时内被诱导[132]。最近，在小鼠右旋糖酐硫酸钠(DSS)结肠炎模型中，给药resolvin RvE1可显著改善疾病活性指标(如体重、结肠长度)，并以ALP表达依赖的方式[133]。其他强调IAP在对抗微生物LPS的先天免疫反应或紧密连接调节中的重要性的例子在Yang中显示et al。[134]和刘et al。[135]。有关IAP和代谢状态/疾病的报道包括Kaliannanet al。[136]和马洛et al。[137]。
鉴于血清ALP肠道同工酶水平的个体间差异很大，研究可能与这一现象有关的特定细菌种类的丰度可能是有趣的。从生化的角度来看，与FAs乳化的LPS相比，胆汁酸乳化的LPS是否能更好地作为IAP的底物将是一个有趣的问题。从上述讨论来看，与LPS相关的乳剂结构和/或FAs的饱和水平很可能通过未知机制对LPS的毒性产生一定影响。这种结构对碱性磷酸酶与LPS反应速率的影响因此具有生化意义。
经过数周的高热量膳食摄入后，肠道屏障的渗透性增加了，部分原因是如上所述的紧密连接的松动。这一现象受到多种因素的调控，包括氧化应激。例如Deopurkar等．[138]和加尼姆等．[139]报道了抗氧化维生素的有效性，表明氧化应激是黏膜细胞中可引起局部炎症的重要因素。这些研究揭示了参与各种生化反应网络的紧密连接调控，其中一些可能为治疗提供线索。
本文未涉及的另一个重要领域是内毒素耐受，即首次暴露于LPS刺激后，宿主对LPS激活的反应能力降低的状态[140,141]。高剂量大肠杆菌LPS (10-100 ng/ml)显著上调tlr4介导的IL-6反应[23142]，但随后产生IL-10，代表抗炎反馈。重要的是，在亚临床水平的LPS (<10 ng/ml)的情况下，第二阶段不会被诱导[143]。其他耐受机制可能包括TLR4内化[144]、IRAK-1磷酸化[145]、含有肌醇磷酸酶的SH-2表达[23143]。
内毒素耐受在各种免疫细胞中均有报道[141]。内毒素耐受极大地改变了基因表达模式[141]，并可能促使巨噬细胞从主要释放促炎介质放大炎症和破坏宿主的巨噬细胞，转变为更好地杀死和呈递抗原的巨噬细胞[140]。目前研究的重点是协调巨噬细胞耐受诱导的微RNA基因[146-149]。有趣的是，miR-146a已被证明在新生儿肠道中介导保护性先天免疫耐受的诱导[150]。因此，涉及菌群定植的肠黏膜稳态的建立可能是通过适当的微调和诱导肠上皮细胞的免疫耐受来实现的[150]。
然而，对于hfd诱导的现象如何与内毒素耐受相关，还需要进一步澄清。值得分析的是，人外周血单核细胞中IL-10和tgf -b依赖性诱导对LPS的耐受是否也适用于肠上皮细胞和WAT巨噬细胞[151]。
最后，虽然本文主要研究LPS的促炎活性，但Caniet al。提出了eCB系统介导脂肪和肠道之间的交流[122]。进一步的研究可能会为LPS和eCB在hfd诱导的低度全身炎症中的相对意义提供见解。
那种Nishizawa
军事大学
特刊:肠道菌群与健康——从生物学到临床
Kazuhisa Nishizawa，医学博士
临床检验科学系，
帝京大学医学部，
2加贺，板桥，东京，173-8605日本
电子邮件:kazunet@med.teikyo-u.ac.jp
评论文章
收稿日期:2016年3月30日
录用日期:2016年4月26日
发布日期:2016年4月29日
©2016 Nishizawa K.这是一篇根据创作共用署名许可条款发布的开放获取文章，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
Nishizawa K(2016)低级别内毒素血症、饮食和肠道菌群-强调导致肠上皮屏障功能障碍的早期事件。生物医学研究临床实践1:DOI: 10.15761/BRCP.1000110
没有数据。
