立命馆大学药学院和研究生院药物信息学实验室，日本滋贺525-8577
立命馆大学药学院和研究生院药物信息学实验室，日本滋贺525-8577
立命馆大学药学院和研究生院药物信息学实验室，日本滋贺525-8577
立命馆大学药学院和研究生院药物信息学实验室，日本滋贺525-8577
立命馆大学药学院和研究生院药物信息学实验室，日本滋贺525-8577
立命馆大学药学院和研究生院药物信息学实验室，日本滋贺525-8577
立命馆大学药学院和研究生院药物信息学实验室，日本滋贺525-8577
DOI: 10.15761 / ICST.1000151
我们之前已经提出G蛋白偶联受体GPR87可能是LPA受体。本研究利用ME180宫颈癌细胞评估GPR87是否在功能上参与LPA应答。我们的在体外伤口愈合实验显示LPA诱导的细胞迁移被LPA拮抗剂Ki16425抑制。RT-PCR分析显示ME180细胞表达LPA1受体和GPR87，它们都被Ki16425拮抗。预处理的ME180细胞gpr87-特异性sirna显著降低了lpa诱导的细胞迁移。这些结果表明，GPR87被LPA激活，GPR87的激活导致细胞迁移。
G蛋白偶联受体，GPR87，溶血磷脂酸，细胞迁移，癌症进展
溶血磷脂酸;G蛋白偶联受体;MAPK，丝裂原活化蛋白激酶;PI3-K phosphoinositide3-kinase;表皮生长因子受体;上皮间充质转化;基质金属蛋白酶;NSCLC，非小细胞肺癌。
溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid, LPA)是血管内皮细胞内由自身毒素酶活性产生的溶血磷脂之一，是细胞外信号分子[1,2]。LPA通过结合至少六种特异性g蛋白偶联受体(gpcr)，即LPA受体，增加了丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷酸肌肽激酶(PI3-K)和低分子量g蛋白的磷酸化[1-6]。LPA1 - 3已知具有>50%同源性的受体是“内皮分化基因”(EDG)成员，而另外三个LPA受体LPA[4-6]是P2Y嘌呤能家族的成员。这些受体的编码序列与LPA受体明显不同[1-3]，但仍能结合和介导LPA信号传导作用[3]。这些受体在多种哺乳动物细胞和组织中表达[3]。我们之前报道过细胞内Ca2 +表达GPR87-G的CHO细胞16α融合蛋白随着低浓度LPA的暴露而增加，并提出P2Y家族成员GPR87是LPA受体[4]。Glatt等．有报道称GPR87可能对几种人类肿瘤细胞的存活和增殖有促进作用[5]。最近,严等．预测gpr87参与了表达癌症干细胞标记物CD133的上皮癌细胞增殖和迁移的调控[6]。此外，我们之前报道了LPA通过激活GPR87和LPA诱导人A431上皮细胞的集落扩散1受体[7]。细胞集落扩散被称为上皮间充质转移(epithelial mesenchymal transition, EMT)，发生在癌细胞迁移和转移过程中[8,9]。
一般来说，细胞迁移和EMT都被认为是癌症进展和恶性发展的重要因素。重要的是，膀胱癌细胞中表达GPR87的患者比不表达GPR87的患者生存时间更短[10]。肺癌患者也报道了类似的结果[11]。由于癌细胞迁移能力的诱导被认为是癌细胞向恶性发展的重要因素，GPR87可能是这一过程中的关键分子。然而，缺乏明确的证据表明GPR87是LPA受体。
文献表明，多种细胞系通过激活不同的信号通路来响应LPA的迁移[12-15]。Ullich发现LPA受体激活通过激活基质金属蛋白酶(MMP)和释放egf样肽来交叉激活表皮生长因子受体(EGFR)[16-18]。最近,Muthusamiet al。有报道称，用EGF处理人宫颈癌ME180细胞可诱导Erk下游转录激活因子2的核聚集，增加细胞迁移和EMT[19]。由于ME180细胞已被证明表达GPR87[5]，因此可以期望这些细胞在GPR87激活后通过gpcr介导的EGFR反激活来诱导细胞运动。
尽管有超过120种gpcr作为具有未知内源性刺激配体的孤儿受体存在，但由于其众多的生理作用，gpcr已经引起了大量的研究兴趣[20]。孤儿gpcr的去孤儿化有望导致对其生理功能的更好理解，并为药物发现提供新的治疗靶点。然而，孤儿gpcr去孤儿化的比率最近有所下降。最初，每年约有10个gpcr被去孤儿化，而自2004年以来，很少有gpcr被去孤儿化[21]。因此，将GPR87与LPA匹配应该会影响目前对该受体和配体的生理作用的理解，并推进药物发现。本研究以ME180细胞运动为基础，研究GPR87的药理学和生理特性。
l -a-溶血磷脂酸(油基钠盐，LPA 18:1)购自Avanti Polar脂质公司(Alabaster, AL, USA)，原液浓度为10 mM。U0126、SP600125和LY294002购自Millipore公司(Billerica, MA, USA)， Ki16425购自Cayman Chemical Co. (Ann Arbor, MI, USA)。所有一抗均购自Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)。
ME180细胞保存在RPMI1640培养基(Nacalai, Kyoto, Japan)中，添加10%热灭活胎牛血清(FBS;GIBCO, Carlsbad, CA, USA)和1%青霉素/链霉素(WAKO, Osaka, Japan)在5% CO的湿化气氛中2在37°C。当细胞融合约80%时，用0.05% Trypsin/0.53m MEDTA (Nacalai)在37℃下处理5分钟，然后转移到新培养基中。结晶紫染色后，使用Olympus IX81显微镜(Olympus, Tokyo, Japan)观察细胞。
GPR87敲低细胞采用Ac cell SMART Pool sirna (Dharmacon, Chicago, IL, USA)制备[11]。为了确认siRNA对靶基因表达的影响，用TRI Reagent (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)从处理细胞中提取总RNA，用ReverTra Ace kit (TOYOBO, Osaka, Japan)反转录成cDNA，并用常规或实时PCR对产物进行分析。
对天然细胞和经sirna处理的细胞进行划痕实验，以鉴定细胞迁移。ME180细胞在24孔培养皿中孵育至80%融合，然后用无血清培养基替换培养基孵育过夜。此外，用cell Scratcher (Iwaki, Tokyo, Japan)沿直线刮擦细胞单层，形成2毫米的伤口。随后，细胞在含有1% FBS (GIBCO，木炭剥离FBS, usda批准区域)的新培养基中孵育36小时，存在或不存在LPA和/或抑制剂。每种抑制剂在添加LPA前30分钟添加。然后用结晶紫染色细胞，在奥林巴斯IX71显微镜下观察。
ME180细胞(5 × 104细胞/孔)一式两份接种于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基的24孔板上，37℃孵育48 h，达到80%的融合度。然后将培养基替换为无血清培养基，在37℃下孵育过夜。第二天，将培养基替换为含有0、1或10% FBS的培养基。然后加入不同剂量的LPA，分别培养0、24和36小时。使用Cell count Reagent SF (NacalaiTesque, Japan)进行细胞计数，测定细胞生长情况。
磷酸化和未磷酸化的MAPK或Akt通过western blot分析，使用特异性抗体进行检测[11]。所有一抗均购自Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)。
结果以至少3个独立实验的平均值±SD表示。使用Student 's来确定显著差异t以及,P<0.05被认为有统计学意义。
用鲎试剂检测LPA对ME180细胞迁移的影响在体外伤口愈合试验。在没有任何治疗的情况下，无细胞伤口愈合缓慢。然而，在LPA存在时，伤口愈合明显加快。在接下来的实验中，我们测量了添加LPA后36 h的创面面积(图1A)。在0.1-10 mM的浓度下检测到LPA诱导的ME180细胞迁移。如图1所示，加入1 - 10 mM的LPA后，可以明显观察到迁移。我们比较了LPA受体拮抗剂Ki16425存在或不存在时LPA处理的ME180细胞的迁移情况，发现拮抗剂显著抑制LPA诱导的细胞迁移(图1A和B)。为了消除LPA对细胞增殖的影响，我们比较了1或10 mM LPA处理后的ME180细胞数量与用载体处理36小时的细胞数量。当培养基中含有超过1%的FBS时，无论LPA的存在与否，细胞的增殖没有显著差异(图2)。这些增殖结果表明，细胞在划痕间隙中的存在主要是由于细胞迁移，而不是细胞增殖。
图1．LPA诱导ME180细胞迁移。
(A)在LPA拮抗剂Ki16425不存在(上)或存在(下)的情况下，加入LPA(1µM和10µM)或载体36 h后，观察ME180细胞的迁移情况。左侧显示的图像是在时间0时捕获的。(B)对(A)中结果的定量分析表示不满。用ImageJ程序对愈合面积进行量化。加药36 h后观察到的间隙面积估计为100%。N = 3。**P< 0.01。(C)提取ME180细胞总RNA, RT-PCR检测LPA受体基因。**P< 0.01
图2。LPA对ME180细胞增殖的影响。
ME180细胞(5 × 104细胞/孔)于24孔培养皿上，在含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中孵育至80%融合。然后将培养基替换为无血清培养基，孵育过夜。随后，将细胞培养基替换为含有0、1或10% FBS的培养基，并用0、1或10 mM LPA刺激。分别在LPA刺激后0、24、36 h检测细胞增殖情况。每个实验重复3次。数据表示为与0 h水平相比的倍数增加。
基于Ki16425的受体特异性，LPA1, LPA3.受体和GPR87预计在ME180细胞中表达。我们利用ME180细胞中提取的总rna，通过RT-PCR分析检测了ME180细胞中LPA受体的表达水平(图1C)。分析表明，这些细胞表达LPA受体基因，如Lpa1, lpa2, lpa3, lpa5和gpr87．的gpr87和lpa2它的含量和管家酶一样高gapdh,但lpa1和lpa5水平相对较低lpa3表情苍白。
已知LPA可增加多种细胞系中MAPK和PI3-K的活性，激活这些激酶可诱导细胞迁移[10-14]。因此，我们使用western blot分析检测了lpa处理的ME180细胞中MAPKs和Akt的活性。结果显示，1 μM LPA增加了Erk、JNK、p38和Akt的磷酸化。这些磷酸化被Ki16425有效抑制(图3A)。
由于我们发现LPA激活了MAPKs和Akt，我们评估了Erk、JNK、p38和PI3-K (Akt的上游)抑制剂对LPA诱导的细胞迁移的影响。当ME180细胞在加入LPA前用5 mM U0126、3 mM SP600125或3 mM PD16931630 min预处理时，LPA诱导的ME180细胞迁移明显减少，而10 mM LY294002处理对迁移没有明显影响(图3B和C)。
数字3.活化MAPKs是lpa诱导的ME180细胞迁移所必需的。
(A) LPA诱导MAPKs和Akt快速瞬时激活。以1 μM LPA刺激ME180细胞不同时间。使用p-Erk、p-JNK、p-p38和p-Akt的磷酸化抗体进行Western blot分析，检测磷酸化的Erk、p38、JNK和Akt。为了评估Ki16425对LPA诱导的磷酸化的抑制作用，在LPA刺激前30分钟用1 μM Ki1642530预处理细胞。(B) MAPK抑制剂阻止lpa诱导的细胞迁移，但pi3激酶抑制剂没有。ME180细胞分别用5 μM U0126、3 μM SP600125、3 μM PD169316、10 μM LY294002预处理1 h后加入LPA。加入LPA后36 h观察迁移情况。比例尺:500 μm。(C)使用ImageJ软件定量细胞迁移。每个实验重复4次。 **P<0.01。
因为我们之前发现LPA激活EGFR通过通过刺激金属蛋白酶活性调节A431细胞扩散[7]，我们研究了EGFR参与lpa诱导的ME180细胞中MAPK和Akt的激活。用0.3 mM的PD153035(一种EGFR酪氨酸激酶抑制剂)孵育，可以抑制lpa刺激的这些激酶的磷酸化。众所周知，BB94可以抑制金属蛋白酶，而金属蛋白酶是切割egf样生长因子前体以激活EGFR所需的[22]。1 mM BB94也阻断了lpa刺激的MAPK和Akt的磷酸化(图4A)。有趣的是，这些化合物还抑制了lpa诱导的ME180细胞迁移(图4B和C)。
如上所述，我们发现LPA反应是通过激活GPR87和/或LPA介导的1受体。评价评价…的效果gpr87抑制lpa诱导的细胞迁移，我们用gpr87特异性siRNA，并进行划痕实验。如图5A和B所示，用非靶向siRNA预处理的ME180细胞对10 mM LPA有反应，超过73±7%的伤口间隙通过细胞迁移愈合。然而，用gpr87特异性siRNA减少了细胞迁移，只有16±9%的伤口面积恢复。同样，用an预处理lpa1-特异性siRNA阻止lpa诱导的细胞迁移至22±5%，双敲除gpr87和lpa1基因7甚至更显著地降低了lpa诱导的ME180细胞迁移(图5A和B)gpr87和lpar1在每个sirna处理的细胞中，基因分别减少到原始水平的28±4%和27±10%(图5C)。
版权所有OAT。版权所有图4。EGFR的反活化参与了lpa诱导的ME180细胞迁移。
(A) EGFR信号转导抑制剂对lpa刺激的MAPKs激活的影响。在LPA刺激前，用0.3 μM PD153035或1 μM BB941 h预处理细胞。western blot分析磷酸化水平。(B) PD153035和BB94对lpa诱导的ME180细胞迁移的影响。在LPA刺激前，用0.3 μM PD153035或1 μM BB941 h预处理细胞。加入LPA后36 h观察细胞迁移。比例尺:500 μm。(C) B所示的迁移用ImageJ进行量化。重复了三个实验。**P与lpa诱导的细胞迁移相比<0.01。
图5。通过沉默gpr87抑制lpa诱导的ME180细胞迁移。
(A)沉默抑制lpa诱导的细胞迁移gpr87或lpa1基因。gpr87——或者lpa1根据制造商的说明以及材料和方法部分的描述，将特异性sirna或非靶向sirna(对照)转染到ME180细胞中。添加10 μM LPA后36 h观察细胞迁移。比例尺:500 μm。WKD代表双击倒。(B)用ImageJ对(A)所示结果进行量化。数值由3-4个独立的sirna实验获得。＊P< 0.05, * *P<0.01vs非靶向sirna处理细胞。(C) sirna诱导的gpr87(开栏)或lpa1(填充栏)基因。采用Real - time PCR检测这些受体的表达。实时PCR的引物分别为GPR87的5′-AATCGGGATACCATGATGAGTCTT-3′和5′-CCAGGAGTCCAGCAGATGATAAA-3′，LPA的5′- gcaccgtcaagctgagaac -3′和5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′1受体。**P<0.01vs非靶向sirna处理细胞。
gpcr的异常过表达可能是肿瘤进展的重要组成部分[23]，gpcr介导的信号传导可以通过促进肿瘤生长、存活、迁移和转移来支持肿瘤发生[24-26]。2008年，格拉特et al。和贵港市et al。有报道称GPR87在肺、宫颈、皮肤、颈部和膀胱的鳞状细胞癌中优先过表达[5]。Okazoeet al。GPR87阳性肿瘤患者从非肌肉侵袭性肿瘤向肌肉侵袭性肿瘤的进展更为频繁，他们认为GPR87可能是膀胱癌进展的潜在预后标志物[11]。此外,Niiet al。在非小细胞肺癌(NSCLC)中，GPR87过表达与较差的分化和较高的增殖显著相关。在NSCLC的进展过程中，GPR87过表达可能与获得更具侵袭性的表型有关[27]。
据推测，在癌细胞转移的许多阶段，细胞迁移是至关重要的。在本研究中，我们通过伤口愈合实验来研究GPR87在lpa诱导的细胞运动中的作用。因为18:1油酰- lpa(1-酰基-2-羟基-年代n-甘油-3-磷酸)是LPA的一种LPA形式，在人血浆中含量特别丰富，也是实验室中最常用的LPA化学物质，在本研究中使用了18:1 LPA。
我们发现LPA在ME180细胞中以剂量依赖的方式刺激伤口愈合(图1)。LPA对受伤细胞单层闭合的影响可归因于两个不同的细胞过程:细胞增殖和迁移[28]。我们检测了LPA对ME180细胞增殖的影响，发现LPA在80%浓度下对细胞生长的影响较小。因此，LPA在ME180细胞中诱导伤口愈合主要是由于细胞迁移(图2)。
如图1所示，LPA诱导的ME180细胞迁移被一种有效的LPA拮抗剂Ki16425阻断1, LPA3.， GPR87[1-3]。因为LPA3.在ME180细胞中，RT-PCR只能微弱地识别出受体基因(图1)1受体和GPR87是主要的LPA受体，介导LPA信号，通过激活MAPKs导致细胞迁移(图3和4)。
为了确定GPR87与lpa诱导的ME180细胞迁移的相关性，我们检测了gpr87特异性siRNA对细胞反应的影响。GPR87敲低细胞的细胞迁移明显减少，与GPR87表达缺失一致(图5)。这一结果强烈提示GPR87在ME180细胞中起到LPA受体的作用。然而，一些lpa诱导的细胞迁移仍然存在。因此，LPA1预测受体在lpa诱导的细胞迁移中也很重要。结果表明，LPA1受体敲低的细胞减少了lpa诱导的细胞迁移。用sirna进行细胞处理gpr87和lpa1以累加的方式影响细胞迁移，突出GPR87和LPA的同等意义1lpa诱导ME180细胞迁移的受体。
我们发现Erk、p38和JNK是控制lpa诱导的细胞迁移所需的蛋白激酶;然而，我们无法区分哪一个MAPK对这些细胞运动最为关键(图3)。功能研究表明，MAPK的激活对于LPA诱导的细胞迁移至关重要[12-15]。例如，诱导前列腺癌PC3细胞迁移通过LPA受体与Erk和p38的平行激活[13]。在胶质瘤细胞中，p38和JNK通路对LPA同样重要1受体介导的迁移[14]。每个MAPK都与不同底物的磷酸化有关，如paxillin、FAK、calpain、MLCK、MAP1B、MAP2和ATF2。在细胞迁移和侵袭过程中，这些底物在细胞扩散、板足形成和尾部收缩中起着关键作用。因此，MAPK家族中的三种激酶似乎都能够调节细胞迁移，但机制不同[15]。
虽然我们在ME180细胞中发现了lpa激活的Akt，但lpa诱导的细胞迁移对10 mM LY294002具有抗性。Maffucciet al。报告PI3-K有2个班;PI3-KC1和PI3-KC2，它们都参与LPA反应[29,30]。然而，PI3-KC1和PI3-KC2对LY294002的敏感性是不同的。PI3-KC2 (b亚型)对LY294002的敏感性约为I类酶(6.9 mM)的6倍vs。1.2米)(30、31)。因此，在较高LY294002浓度下，Akt激活是否有助于降低细胞运动，还需要进一步研究。然而，由于更高浓度的LY294002即使在没有LPA的情况下也能减少细胞迁移(数据未显示)，第二代PI3-K抑制剂可能更有用，因为它们对PI3-KC2或PI3-KC1表现出更高的选择性。
正如我们所指出的，LPA受体介导的迁移被EGFR-酪氨酸激酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂阻断，这表明EGFR通过LPA受体的反激活促进了ME180细胞的迁移(图4)。这一假设也在先前的出版物中得到了证实。lpa诱导的A431细胞的菌落扩散通过EGFR的反活化[7]。在肿瘤进展过程中，集落扩散使良性肿瘤细胞获得浸润周围组织并最终转移到远处的能力。EGFR在多种宫颈癌细胞中均有表达，其高表达与临床分期晚期和患者预后差有关[32]。EGF通过EGFR启动的一系列信号事件导致宫颈癌中EMT的诱导[8]。此外,杜et al。据报道，EGF治疗激活了EGFR和GPCR信号通路的典型成员MAPK, MAPK的磷酸化和激活参与介导肿瘤的进展和转移[12,16,33]。因此，这些结果和我们目前的结果表明，EGFR的反激活对lpa诱导的宫颈癌细胞的运动至关重要。
长谷川et al。报告LPA1 - 3受体在细胞运动中发挥作用，可能有助于PC-3细胞的侵袭和转移[34]。在A431细胞中，LPA诱导的菌落扩散是由GPR87和LPA介导的1受体[7]。因此，已经报道了显著的受体冗余刺激LPA介导的反应，然而在细胞系中具有多个LPA受体系统的生理意义尚不清楚。有趣的是，基因毒性应激下，GPR87在结肠癌RKO细胞中以p53依赖的方式被诱导表达[35]。这可能表明GPR87仅在细胞生命中的特定情况下表达以增强LPA反应。
综上所述，我们目前关于GPR87介导的ME180细胞迁移和我们之前关于GPR87介导的A431细胞集落扩散的研究结果表明，LPA激活了GPR87和癌细胞的后续发展。
我们感谢谷村秀夫教授的讨论和村岛绫香女士的技术援助。本研究得到了教育部私立大学战略研究基金会2015-2019项目的支持。
NF构思并监督这项研究;RS、DF、TF设计实验;RS、DF、SN、TW、SO进行实验;NF和RS撰写了手稿。
没有潜在的利益冲突需要披露。
音)山口
埃默里大学医学院
研究文章
收稿日期:2015年9月21日
录用日期:2015年10月8日
发布日期:2015年10月12日
©2015 Saito R.这是一篇根据知识共享署名许可条款发布的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
Saito R, Furuta D, Nakajima S, Watanabe T, Ochiai S等。(2015)溶血磷脂酸通过其推定受体GPR87诱导ME180细胞迁移。综合癌症科学治疗2:DOI: 10.15761/ICST.1000151
立命馆大学，日本滋贺525-8577;电话:+81-77-561-2783，传真:+81-77-561-5203。
图1．LPA诱导ME180细胞迁移。
(A)在LPA拮抗剂Ki16425不存在(上)或存在(下)的情况下，加入LPA(1µM和10µM)或载体36 h后，观察ME180细胞的迁移情况。左侧显示的图像是在时间0时捕获的。(B)对(A)中结果的定量分析表示不满。用ImageJ程序对愈合面积进行量化。加药36 h后观察到的间隙面积估计为100%。N = 3。**P< 0.01。(C)提取ME180细胞总RNA, RT-PCR检测LPA受体基因。**P< 0.01
图2。LPA对ME180细胞增殖的影响。
ME180细胞(5 × 104细胞/孔)于24孔培养皿上，在含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中孵育至80%融合。然后将培养基替换为无血清培养基，孵育过夜。随后，将细胞培养基替换为含有0、1或10% FBS的培养基，并用0、1或10 mM LPA刺激。分别在LPA刺激后0、24、36 h检测细胞增殖情况。每个实验重复3次。数据表示为与0 h水平相比的倍数增加。
数字3.活化MAPKs是lpa诱导的ME180细胞迁移所必需的。
(A) LPA诱导MAPKs和Akt快速瞬时激活。以1 μM LPA刺激ME180细胞不同时间。使用p-Erk、p-JNK、p-p38和p-Akt的磷酸化抗体进行Western blot分析，检测磷酸化的Erk、p38、JNK和Akt。为了评估Ki16425对LPA诱导的磷酸化的抑制作用，在LPA刺激前30分钟用1 μM Ki1642530预处理细胞。(B) MAPK抑制剂阻止lpa诱导的细胞迁移，但pi3激酶抑制剂没有。ME180细胞分别用5 μM U0126、3 μM SP600125、3 μM PD169316、10 μM LY294002预处理1 h后加入LPA。加入LPA后36 h观察迁移情况。比例尺:500 μm。(C)使用ImageJ软件定量细胞迁移。每个实验重复4次。 **P<0.01。
图4。EGFR的反活化参与了lpa诱导的ME180细胞迁移。
(A) EGFR信号转导抑制剂对lpa刺激的MAPKs激活的影响。在LPA刺激前，用0.3 μM PD153035或1 μM BB941 h预处理细胞。western blot分析磷酸化水平。(B) PD153035和BB94对lpa诱导的ME180细胞迁移的影响。在LPA刺激前，用0.3 μM PD153035或1 μM BB941 h预处理细胞。加入LPA后36 h观察细胞迁移。比例尺:500 μm。(C) B所示的迁移用ImageJ进行量化。重复了三个实验。**P与lpa诱导的细胞迁移相比<0.01。
图5。通过沉默gpr87抑制lpa诱导的ME180细胞迁移。
(A)沉默抑制lpa诱导的细胞迁移gpr87或lpa1基因。gpr87——或者lpa1根据制造商的说明以及材料和方法部分的描述，将特异性sirna或非靶向sirna(对照)转染到ME180细胞中。添加10 μM LPA后36 h观察细胞迁移。比例尺:500 μm。WKD代表双击倒。(B)用ImageJ对(A)所示结果进行量化。数值由3-4个独立的sirna实验获得。＊P< 0.05, * *P<0.01vs非靶向sirna处理细胞。(C) sirna诱导的gpr87(开栏)或lpa1(填充栏)基因。采用Real - time PCR检测这些受体的表达。实时PCR的引物分别为GPR87的5′-AATCGGGATACCATGATGAGTCTT-3′和5′-CCAGGAGTCCAGCAGATGATAAA-3′，LPA的5′- gcaccgtcaagctgagaac -3′和5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′1受体。**P<0.01vs非靶向sirna处理细胞。
