骨科服务，Santiago De Compostela，西班牙的大学住院综合体
医学转化肿瘤实验室，IDIS，圣地亚哥德孔波斯特拉，西班牙
DOI：10.15761 / IMI1000194。
WNT /β-连环蛋白途径在干细胞分化中起关键作用以及肿瘤微环境中的细胞粘附，增殖甚至侵袭的其他生物学过程。细胞从周围条件接收不同的输入，生物化学或物理提示，这种机械刺激由于其与生理条件的相关性而表示有趣的调节机制。在这项工作中，我们描述了在生物反应器中培养的干细胞在生物反应器中培养的干细胞能够调节其对循环流程的反应，将其转化为Wnt3a和β-catenin的差异表达。在本研究期间，我们发现刺激的频率会及时的时尚影响Wnt-3a和β-连环蛋白表达的表达，同时也受到刺激持续时间的影响，同时也发现机械的阈值清楚地标记Wnt-3a和β-catenin的更高基因表达的输入。
干细胞，WNT， -连环蛋白，支架，生物反应器，张拉整体结构
间充质干细胞(MSCs)是由克隆能力和分化成多种细胞类型的能力定义的。MSCs能够保持长时间的静止状态，激活并返回到静止状态，而不发生表型变化，从而可能导致恶性转化。
细胞稳态由牵引机制调节，第一个是基于自分泌，旁碱基和内分泌的第一，其中所有生物化学分子与激活受体相互作用（通常在膜中）引发不同途径的激活。另一方面，细胞间通信对于维持组织稳态并且因此，有机和全身是必不可少的。
第二种机制依赖于细胞敏感的纯机械刺激;这些刺激调节细胞粘附（对肿瘤病理有很大的兴趣，首次由Curtis [1]，细胞增殖和分化描述。英文“提示”这个词或短语对剧院的演员称play to remind him about his role, i.e. the indication to trigger an action; this concept seems especially interesting.
通过机械刺激触发的这些代谢途径可以通过强态模型（ingber）来平移，这给出了细胞和细胞外基质的相互关联的作用的新尺寸。这些机械信号转导将物理信号转化为生化活化剂（离子通道，FA激酶，蛋白G，通过MAPK（2bmp相关），rhOA）并将发挥细胞骨架调节，最终将改变形状和细胞体积导致的形状和细胞体积差异基因表达响应于外部机械刺激。几种途径与肌肉骨骼的特殊兴趣的Tensegrity模型[2]相关是Nüsse等人所述的Wnt途径。1984年[3]。
这种机制生物学模型已经获得了大量与Wnt通路刺激相关的信息，这些信息不容易合成为一套完整的知识体系。通过总结，我们知道:a)如果在时间上有重复的刺激，它比孤立的点更有效;B)如果有一些休息作为恢复时间，从一小时到三小时，有更大的影响后;C)力可以从拉力到压缩变化，但最重要的是，已经研究过通过张力拉伸的单轴或双轴变形(在膜上培养的细胞周期性地在一个或两个轴上拉伸)，这些张力产生了细胞变形，虽然流体(膜纤毛的作用)和振动(扬声器)也研究了剪切的效果，而振动产生的能量不会使细胞加速或变形;D)环境中存在的特定分子可以增强或减弱反应。TGF - β和软骨形成增强因子)。
然而，目前关于Wnt / β -catenin通路的启动，以及MSC向成骨而非脂肪生成的转变仍有一些问题尚不清楚:a;产生任何效果所需的负荷(产生变形的力)，b;作用:b1;频率，b2，或节奏(频率的变化)或b.3，机械刺激的持续时间，甚至这些变量是否有任何意义。目前尚不清楚是否存在触发反应所需的最低阈值，也不知道是否有任何机械刺激，无论其强度如何产生这种效果。有了这种认识状态，我们提出以下假设。
单纯的机械刺激可以启动Wnt/ β -连环蛋白通路，而且该通路对这种刺激的节奏和持续时间的变化很敏感，可能存在阈值效应，低于阈值时不会触发反应
在目前的实验工作中，我们试图将物理刺激与WNT3a和-连环蛋白表达水平的变化及其与机械感测的联系联系起来。
间充质干细胞从骨科手术部进行常规外科手术的患者获得。该程序履行了当地伦理委员会批准的议定书。通过GNECCHI和Melo [4]之前描述的组织大小梯度分离MSCs。简而言之，吸气的骨髓在组织大小肠（50:50）的顶部缓慢移液，并立即以2000rpm离心30分钟。将含有MSCs的中心层分离并在700rpm下再离心15分钟，以丢弃任何剩余的Ficoll。将剩余的颗粒悬浮在补充有20％FBS和PEN / STREP的DMEM中。细胞留下生长，直到达到汇合。
在木质桩图案中使用铅毛德·普罗斯特拉大学的抢劫技术制造了羟基磷灰石（HA）支架，其孔径为180微米。HA是从Keramat（西班牙Ames）获得的。抢劫件后来在900℃下加工。在进行细胞培养之前，所有碎片都是高压灭菌（图1和2）。
图1。热处理前支架的设计和制造。
图2。通过抢劫制造的羟基磷灰石脚手架。通过SEM测量孔径。
生物反应器是从Ebers获得的。在HA支架上生长细胞直至达到汇合（图3和4）并置于中央室中，其中施加不同的流动率。蠕动泵（ISMATEC）用于通过腔室流动细胞培养基，导致最大压力为0.68Pa。细胞密度为7×104细胞/厘米2在整个实验中使用。
图3。间充质干细胞在HA支架上培养。用Calcein-AM和碘化丙啶染色细胞。绿色信号显示出这种培养系统的良好存活率。
图4。生物反应器装置。流室中含有用间充质干细胞培养的支架，D-MEM穿过支架。
为了激发培养细胞的动态反应，在胶原蛋白表面施加循环流脉冲。简单地说，HA支架被压缩5分钟，每分钟压缩1、5和15次，另一组压缩15次，每分钟压缩5、40和90分钟。
为了了解WNT/ beta -Catenin是如何被机械调节的，我们从当地经销商(Costoya SL)购买了以下WNT3和beta Catenin引物:Wnt3a f5 ' CACCACCGTCAGCAACAGCC 3 ';
Wnt3a R 5 ' AGGAGCGTGTCACTGCGAAAG 3 '。-catenin，正向引物5 ' -gtgctatctgtctgctctagta-3 '，反向引物5 ' -cttcctgtttagttgcagcatc-3 '，用SYBER Green标记。
将培养的支架用于Leica SP-2共焦显微镜和用Calcein-AM /碘化丙酰染色的细胞，以获得和静态静态条件下的细胞分布。
分析数据并通过Excel包（Microsoft）绘制的数据。使用SPSS包进行统计分析。对于T学生测试，在Alpha = 0.05中取出显着差异。
2021年版权燕麦。所有权利reserv图5。WNT3a表达式。在15x5分钟组发现更高的mRNA。T-Student检验n = 8， α = 0.05, H0: μ1 = μ2;H1:μ1 > 2μ。5x5和15x5组的p值为0.02。，小于0.05时，拒绝H0，接受H1。
图6。在长时间的刺激中，β -连环蛋白的表达比例更高。T-Student检验n = 8， α = 0.05, H0: μ1 = μ2;H1:μ1 > 2μ。5 × 5组和15 × 5组的p值分别为0.03，小于0.05,H0被拒绝，H1被接受。
Wnt3a在5个周期的5分钟内表达增加，但在15个周期及以上，即使刺激时间较长(40-90分钟)，Wnt3a的表达也增加，如图5所示。高-连环蛋白表达在15个周期中被触发，并维持较长的时间(40到90分钟)，如图6所示，这可能是一个阈值效应。
因此，在5分钟至40分钟之间存在明显的差异，在40至90分钟之间没有显着性。它还检测Wnt-3a的阈值效果，用于刺激频率，尽管被告较少，但在1到5个周期之间。此外，这与上述一样重要或超过，检测到途径激活所需的最小刺激;在上面定义的阈值以下，在β-连环蛋白的情况下没有可检测到的差异，并且在WNT 3A刺激的持续时间中的最小值和WNT-3A的情况下的频率
对Wnt通路的研究已经发表了大量相关领域的论文，从组织工程到癌症(一种机械检查点通过肌动蛋白加工因子[5]调控YAP/TAZ来控制多细胞生长;Wnt信号在软骨发育和疾病中的作用:来自动物研究的教训开发了大量的方法研究细胞转导,通常建立在文化的膜间充质细胞周期性拉伸(在一个或两个垂直轴),诱导这些细胞的变形,这可能被视为一种表观遗传反应导致WNT激活。甚至连扬声器膜的振动也被证明是一种有效的刺激
大多数情况下，刺激频率在Hz附近或更少[5,6]，在这个意义上，本文工作的频率更低，周期/分钟的数量级，没有Hz(周期每秒);这也是一种新事物，可能增加了检测这种效应阈值和所需最小刺激的灵敏度，在我们的文献中没有提到。有时候差别不是很大，因为0.3 Hz[6]和每分钟15次刺激是类似的情况。似乎细胞的变形是最重要的刺激，加密这大约10%[5,7]为理想;一些数据表明，即使是这个水平也可能很高[8]，15%已经明显太[6]了。研究的另一个方面是单一或双向细胞方向的刺激，因此是细胞刺激最明确的信号之一，由机械力产生的机械力与周围环境的相互作用:这是从柯蒂斯的工作中知道的[1]，是最早表明机械力对细胞刺激的影响的发现之一。
这种定向性似乎受到培养细胞的基材的刚性的影响，如果衬底（栽培的膜）的刚性降低[7]，则降低机械活化能力[7]。核水平在垂直刺激的核水平对LPS生长的细胞（默认方向性）的改变，如果核基质[9]嵌段的任何蛋白还通过Wnt / beta-catenin描述了与化学因素刺激的协同作用培养基[5,10,11]，具有LRP5的一些性能[11]，尽管存在其他出版物对LRP5 [10]突出，但甚至已被认为它们与DKK-1无关，机械刺激β-Catenin路线，与DKK-1抑制剂有何感兴趣是一种曾经采取的方式，看起来非常有前途，为治疗骨质疏松症产生药物。
在我们的结果中，我们似乎挑起了对基因表达中流动的触发反应，但是，应该采用更多的义，以提供明确的证据，这可以与其他实验相关。当然，细胞不会与不同的刺激或力响应相同。必须注意的是，研究还可以为未来的研究提供有趣的洞察力，其中具有不同弹性模子的培养基材可以作为研究的新变量来实现[12,13]。
不适合推断积累效果，只要在40到90分钟之间就会有所增加，这在刺激之间明显表现为5和40分钟。
我们的工作和大多数出版物之间有几个不同之处，这可以解释我们的发现的新颖性:刺激的频率(已经评论过)，但也包括持续时间(在许多作品中最长90分钟，而不是几天)和使用的力的类型(流体静力压缩而不是基质拉伸)。这项工作使硬支架上的刺激压缩，而不是膜的拉伸，相信骨头和椎间盘环境都是一个循环压缩。
另一个重要的区别是凝胶被压缩，而不是拉伸膜;虽然在细胞上的凝胶压缩的转导确实有可能对这种变形的分心。除了我们的知识，从未显示过机械刺激的门槛。在电池的机械刺激方面有许多问题可以直接从结果产生这项工作，例如，在刺激效果的持续时间内键入该阈值。
音)山口
埃默里大学医学院
研究文章
收到的日期：2015年12月9日
录用日期:2016年1月2日
出版日期:2016年1月7日
©2016 Diez-Ulloa MA。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可协议的条款下发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。
Díez-Ulloa MA, Couceiro-Otero R(2016) 3D生物反应器中Wnt3a和-catenin的机械触发:频率和节律的作用。Integr Mol Med 3: DOI: 10.15761/IMM.1000194。
骨科服务，UHC Santiago de Compostela，Trav。达夫拉姆S / N 15706 Santiago de Compostela，西班牙
图1。热处理前支架的设计和制造。
图2。通过抢劫制造的羟基磷灰石脚手架。通过SEM测量孔径。
图3。间充质干细胞在HA支架上培养。用Calcein-AM和碘化丙啶染色细胞。绿色信号显示出这种培养系统的良好存活率。
图4。生物反应器装置。流室中含有用间充质干细胞培养的支架，D-MEM穿过支架。
图5。WNT3a表达式。在15x5分钟组发现更高的mRNA。T-Student检验n = 8， α = 0.05, H0: μ1 = μ2;H1:μ1 > 2μ。5x5和15x5组的p值为0.02。，小于0.05时，拒绝H0，接受H1。
图6。在长时间的刺激中，β -连环蛋白的表达比例更高。T-Student检验n = 8， α = 0.05, H0: μ1 = μ2;H1:μ1 > 2μ。5 × 5组和15 × 5组的p值分别为0.03，小于0.05,H0被拒绝，H1被接受。
