阿根廷Clínicas José de圣马丁医院清醒porfiinas和Porfirias调查中心(CIPYP)
Departamento de Química Biológica, faculty de Ciencias Exactas y Naturales, Intendente Güiraldes 2160 - Ciudad Universitaria，阿根廷。
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DOI: 10.15761 / ICST.1000187。
光动力疗法(PDT)是一种癌症治疗方法，包括给药一种选择性地在肿瘤组织中积累的光敏性药物，然后用适当波长的光照射。它触发光化学反应，诱导活性氧(ROS)的产生，从而导致细胞损伤，最终导致细胞死亡。卟啉是唯一通过生物前体5-氨基乙酰丙酸(ALA)内源性合成的光敏剂。几种抗氧化剂和活性氧清除剂:还原性谷胱甘肽(GSH)、甘露醇(Man)、l-色氨酸(Trp)、抗坏血酸(Asc)和屈洛酸(Trx)，被测定以确定其调节ALA-PDT (ALA-PDT)的能力;在A549人肺腺癌细胞上进行，用1mM ALA孵育3小时，然后用调节剂进行或不进行1小时的预孵育。之前在0.01 - 20 mM的浓度范围内测试了它们可能的细胞毒性/光活性。确定了有清除剂和没有清除剂(保护等级:PG)的ALA-PDT后的细胞存活率之比，并在后续实验中使用无细胞毒性/光活性且PG最高的浓度。吖啶橙/溴化乙锭染色和AnnexinV-FITC/碘化丙啶标记显示，ALA-PDT单独诱导凋亡细胞死亡的比例较高(98.4±3.5%)。以最高PG浓度的调制剂预孵育可显著减少凋亡细胞48.3±2.7% (Asc)、58.8±4.2 (Trx)、78.5±3.1% (GSH)、64.3±1.6% (Man)、74.6±2.3% (Trp)。利用荧光探针二氢二氯荧光素(H2-DCFDA)和甲氧基乙烯芘(MVP)分别用于检测过氧化物和单线态氧。ALA-PDT后ROS生成增加(H2-DCFDA阳性细胞，对照组:1.1±0.1%;10 min-PDT: 69.3±5.6%;MVP阳性细胞，对照组:0.65±0.35%;10 min-PDT: 83.5±1.9%)。Asc阻止过氧化氢的形成(H2-DCFDA阳性细胞:50.7±2.8%)，主要阻止单线态氧的增加(MVP阳性细胞:25.4±5.2%)，而Trx限制过氧化物的形成(H2-DCFDA阳性细胞:20.8±0.5%)，但对单线态产氧无明显影响(MVP阳性细胞:73.6±3.4%)。选择性清道夫介导的对pdt诱导的细胞死亡的保护，以及特异性促氧化剂的直接检测，导致ROS在ala - pdt介导的肿瘤根除中有很强的参与，这表明抗氧化剂可能会减弱对正常组织的不希望的光损伤。
光动力疗法，5-氨基乙酰丙酸，活性氧，细胞凋亡，清除剂
PDT是一种微创治疗方法，适用于梗阻性、浅表和内窥镜下可及的肿瘤以及癌前和非肿瘤疾病[1-3]。它涉及到一种光敏药物(PS)——通常是卟啉——在恶性组织中选择性地积累。随后用适当波长的光照射引发PS的兴奋，产生以单线态氧为主的ROS，通过细胞成分的氧化选择性地破坏靶细胞，破坏质膜和亚细胞细胞器[4,5]。PDT相对于传统疗法的优势是选择性较高，全身毒性较低，目前被应用于膀胱癌、脑癌、肺癌、胃肠肿瘤和妇科肿瘤等多种癌症的治疗，也应用于皮肤科和非肿瘤性疾病[6-14]。
有许多不同的ps，包括合成的和天然的，其中大多数是具有双键的杂环化合物[4,5,15]。其中，卟啉是唯一一种通过给药其生物前体5-ainolevulinic acid (ALA)内源性产生的PS，诱导原卟啉IX (PpIX)的积累，原卟啉IX是一种高度光敏化合物[16]，已知是造成红细胞生成性原卟啉症患者皮肤光损伤和皮肤病变的原因，原卟啉症是一种遗传性疾病，由参与血红素生物合成的铁螯合酶[17]缺乏引起。ALA及其酯衍生物已在实验和临床试验中成功用于可视化和破坏恶性细胞[18-23]。
传统的癌症治疗在许多情况下会产生ROS，它会攻击健康的细胞和组织，导致进一步的损害和意外的副作用。抗氧化剂，由于其自由基清除能力，能够减少这些不利影响[24];然而，必须考虑到，任何被发现可以降低肿瘤治疗对健康组织毒性的抗氧化剂，都有可能降低癌症治疗对恶性细胞的有效性。
PDT根除肿瘤涉及多种细胞死亡类型，包括坏死、凋亡和自噬[25-28]。这些死亡途径并不相互排斥;而且，在某些生理或病理条件下，它们可以共存，同时发生[29]。PDT通过对重要亚细胞靶标的不可逆光损伤导致细胞死亡。PS的细胞内定位决定了光损伤的主要部位，在细胞死亡途径中起着关键作用。由于PSs很少位于细胞核，因此对DNA的损伤是有限的。通常，定位于线粒体或内质网的光活性化合物在一定的氧化应激阈值[28]内促进细胞凋亡。也有报道称，某些ps，如单l -天冬氨酸氯e6 (NPe6)，在激光照射后几乎立即引起溶酶体的破坏[30,31]。
细胞凋亡是PDT引起的最广泛的细胞死亡途径。它由细胞内和细胞外信号共同控制，以形态学和生化变化的特征序列结束，以系统地分解细胞和制备剩余的细胞成分，称为凋亡小体[26]。然而，PDT方案的细胞毒性不能完全由凋亡反应来解释。高剂量PDT或PS定位于质膜时，经常可见坏死[32]。这种细胞死亡模式表现为细胞质空泡化、质膜肿胀和破裂等形态特征，由于细胞内容物和促炎分子的释放而导致炎症反应。此外，自噬的特点是将细胞质物质隔离在液泡中，由溶酶体酶降解，虽然是一种自我毁灭的方式，但并不一定是细胞死亡的过程;相反，自噬通常通过清除受损的细胞器或分解细胞大分子来防止细胞死亡[28,33]。
在本研究中，我们描述了人A549肺腺癌细胞系对ALA-PDT的细胞反应，并报道了几种抗氧化剂在治疗后防止细胞死亡的能力及其在调节PDT疗效和ROS参与中的意义。
阿拉巴马州,H2DCF-DA、MVP、二氢乙胺(HE)、罗丹明123 (Rh 123)、Asc、Man、谷胱甘肽(GSH)、琥珀酸丙酮(SA)和铁铁沙明(Dfx)从Sigma Chem获得。有限公司(美国)。MitoTracker和LysoTracker Green购自molecular Probes公司，Annexin V-FITC购自Invitrogen公司(阿根廷)。所有其他使用的化学品都是分析级的。
人A549肺腺癌细胞系(非小细胞肺癌，NSCLC)在37°C的5% CO中生长2加5%胎牛血清(FCS)、80µg/ml庆大霉素(gentamicin)和2 mM l-谷氨酰胺(l-glutamine)的最低必需培养基(MEM)。以5 × 10的密度进行实验4到1 x 105根据检测结果，细胞/ml分别在24孔或6孔板中播种。
作为标准程序，允许细胞生长至亚汇合，然后用无血清培养基取代培养基，以避免卟啉外化[34]，并在1mm ALA终浓度下孵育3小时。随后，用两盏荧光灯(欧司朗L 18W/765)照射细胞，其波长范围为400 - 700 nm，最高辐射功率为600 nm (0.4 J/cm)2)，并位于距板块21厘米处。PDT后的活细胞百分比由MTT(3(4,5-二甲基噻唑-2-基)- 2,5 -二苯基溴化四氮唑)测定[35]测定。
以20 mM浓度制备SA和Dfx，分别溶解于蒸馏水和PBS中。为了评估几种抗氧化剂和清除剂(Trp, GSH, Man, Asc和Trx)的假定保护作用，将它们溶解在PBS中，并在给药前1小时添加到细胞培养中;然后，如前所述进行孵育和辐照。
细胞在6孔板底部的盖板上播种，生长至亚汇流。用1mm ALA孵育18小时后，细胞在37°C加载150 nM MitoTracker Green或LysoTracker Green 30分钟。盖片安装在载玻片上，用共聚焦显微镜(尼康C1，物镜:60x Plan Apo Oil NA 1.40)检查。
细胞按上述方法在盖玻片上培养，用1mm ALA孵育2.5小时;然后，加入150 nM MitoTracker Green或LysoTracker Green，继续孵育30分钟。板照射10分钟，1小时后在荧光显微镜(Olympus BX51)下检查细胞器形态。
在盖玻片上培养的细胞按上述方法进行ALA-PDT处理，4℃4%甲醛处理20分钟(甲苯胺蓝染色)或-20℃甲醇处理7分钟后1小时固定，0.1% Tritón X-100 PBS渗透(Hoechst染色)。盖片用冷PBS冲洗4次5分钟。PBS洗涤一次后，加入0.5%甲苯胺蓝或40µl 1µg/ml Hoechst 33258，在荧光显微镜(Olympus BX51)下观察细胞核形态。
吖啶橙可穿透活细胞和死亡细胞，插入双链DNA后发出绿色荧光，与单链DNA结合后积聚在溶酶体中，发出红橙色荧光。在细胞凋亡晚期或坏死时，溴化乙锭插入膜改变的细胞DNA后发出红色荧光。因此，这两种荧光色素的组合可以区分四种细胞状态:活细胞(绿色核)，早期凋亡细胞(染色质凝聚，绿色核)，晚期凋亡细胞(橙色和凝聚或碎片状核)和坏死细胞(均匀橙色染色核)。简单地说，ALA-PDT细胞胰蛋白酶化后1小时，用PBS洗涤并以1 x 10重悬6细胞/毫升。然后，加入2µl荧光色素混合物(每个50µg/ml)，并在荧光显微镜下检查细胞(Olympus BX51)。每次处理至少计算200个细胞。
ALA-PDT细胞胰化后1小时，PBS洗涤，2 x 10重悬6含10mm HEPES/NaOH, pH 7.4的结合缓冲液;140毫米氯化钠，2.5毫米氯化钙2．100 μ l的等份与5 μ l Annexin V-FITC在室温下孵育15分钟。之后，加入碘化丙啶，最终浓度为5µg/ml，体积完成至500µl。采用Partec PAS III流式细胞仪对样品进行分析。
为了检测ROS，在ALA-PDT处理后1 h对24小时培养的细胞进行胰蛋白酶化，并在37°C黑暗中用以下ROS荧光检测探针之一孵育30分钟:10µM h2-DCFDA (λ发射:530 nm)， 10µM MVP (λ发射:465 nm)， 2µM HE (λ发射:461 nm)或10µM Rh 123 (λ发射:534 nm)。采用Partec PAS III流式细胞仪对样品进行分析。
这些值用平均值±平均值的标准误差表示，它们是三次独立实验的平均值。数据分析GraphPadPrism (GraphPad软件公司，圣地亚哥，CA，美国)。
PpIX在孵育后积累，ALA浓度从0.1 mM增加到5 mM，持续3小时，直至1 mM的平台，达到11.67±0.18 ng/105细胞。在不同的孵育时间内，从1到8小时，PpIX水平呈线性上升，达到29.89±1.45 ng/105细胞。释放到细胞培养基中的卟啉的量对卟啉的总产量没有显著贡献。MTT试验证实，在任何浓度或孵育时间内，ALA都没有产生相当大的暗毒性。在没有卟啉的情况下，最长的照射时间(15分钟)没有改变细胞的存活(数据未显示)。因此，后续PDT处理的条件建立在ALA终浓度1 mM，孵育3 h。一旦进行ALA-PDT，在治疗后1小时测定细胞存活率，发现细胞存活率随着照射时间的增加而降低，在照射15分钟时达到近90%的细胞死亡，在照射7分钟时达到50%，确定了最后一个值LD50为细胞系(图1)。
图1所示。增加照射时间对细胞存活的影响。细胞在无血清培养基中(●)或不含(〇)1mm ALA孵育3h，然后在不同时间用荧光灯照射;1h后进行MTT实验。条形图:基于三个独立实验的SE，每个实验有三个平行点。
PpIX在细胞中的分布可以通过其自身的红色荧光来显示，而线粒体和溶酶体可以通过特定的探针Mito Tracker和Lyso Tracker Green来显示。共聚焦图像(图2)显示，在ALA孵卵后，只有在看到线粒体而不是溶酶体时，PpIX的红色荧光与细胞器探针的绿色荧光共定位。
图2。ALA诱导的PpIX定位。
用ALA (A和D)、ALA + MitoTracker Green (B)或ALA + LysoTracker Green (E)孵育细胞的荧光共聚焦图像以及相应的合并(C和F)。简单地说，在盖片上生长的细胞用1mM ALA孵育18小时，然后加载150 nM MitoTracker或LysoTracker Green，并在共聚焦显微镜下观察(尼康C1，目标:60倍Plan Apo Oil NA 1.40;比例尺:20µm)。
接下来，我们检查了ALA-PDT处理过的细胞的形态变化，分别通过常规显微镜和荧光显微镜的甲苯胺蓝染色和Hoechst染色显示。代表性图像如图3所示。光照后，细胞立即从基质上脱落。ALA-PDT 7min后可见膜和核严重损伤，细胞核微细，细胞大小明显缩小，膜泡明显。随着照射时间的增加，可观察到细胞逐渐脱离、变圆、膜泡变和核凝聚(图3 B、C板)，显示细胞凋亡的形态特征。最高PDT剂量测试(15分钟)产生了与坏死特征一致的低比例膜肿胀(图3A)。
图3。不同时间剂量ALA-PDT对细胞形态的影响。
细胞用1mm ALA孵育3小时，然后照射2,5,7,10,15分钟。1小时后，仍附着在覆盖物上的细胞固定，用甲苯胺蓝(A图)或赫斯特(B和C图)染色，并在常规或荧光显微镜下观察。在平行实验中，用吖啶橙/溴化乙锭对细胞进行胰蛋白酶化和染色(D组)，并在荧光显微镜下观察，或用Annexin V-FITC /碘化丙啶标记(E组)并通过流式细胞仪分析。通过流式细胞仪的光散射评估细胞大小和粒度(F图)。A、B和C图的比例尺为100µm, D图的比例尺为150µm。
吖啶橙/溴化乙啶双染色显示，染色质凝结和膜泡与凋亡一致的细胞比例很高，ALA-PDT 15分钟时，未处理细胞的比例从10.2±1.1%上升到98.3±3.5%(图3面板D，图4A)。膜磷脂酰丝氨酸外化是另一种细胞凋亡诱导信号。Annexin V- FITC/碘化丙啶染色可以区分坏死细胞、早期和晚期凋亡细胞与存活细胞。与吖啶橙/溴化乙啶的结果一致，流式细胞术检测的凋亡细胞的产量随着辐照时间的增加而增加(图3 E，图4B)， ALA-PDT照射15 min时，未处理细胞的2.3±0.1%增加到64.2±5.5%。在所有PDT剂量下，坏死细胞的百分比都保持在较低水平。
图4。不同ALA-PDT时间剂量后存活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的定量。
一旦进行PDT，细胞经过胰蛋白酶化和吖啶橙/溴化乙锭染色1小时后，用荧光显微镜观察和计数(A)，或用Annexin V-FITC /碘化丙啶标记并用流式细胞仪分析(B)。柱状颜色:黑色■:活细胞;深灰色■:早期凋亡细胞;浅灰色■:凋亡细胞;□白色:坏死细胞)(*:p < 0.05;*: p < 0.01;对未处理对照细胞的显著性)。
流式细胞仪中细胞反射光的正向(FSC)和侧面散射(SSC)分别代表细胞的粒度和细胞大小。由于细胞收缩和凋亡小体的形成，凋亡细胞通常表现为细胞大小减小和颗粒度增加。因此，FSC-SSC图补充了Annexin/丙啶碘化图的同时形态数据。如图3 F图所示，FSC-SSC图显示细胞尺寸逐渐减小，颗粒度逐渐增大，与凋亡过程一致。
为了评估ALA-PDT后的细胞器损伤，将细胞孵育，然后在用于线粒体和溶酶体的特定探针存在下照射。在未经处理的细胞中，Mito和Lyso Tracker分别被极化的线粒体或完整的溶酶体所吸收。在线粒体膜去极化或溶酶体破坏后，探针被释放到细胞质中，显示出均匀的荧光模式，而不是正常的细胞器定位和分布。因此，这些特征是细胞器受损的迹象。在我们的病例中，10分钟的照射时间不仅产生了细胞分离，而且在对照细胞中观察到的溶酶体和线粒体也失去了点状模式(图5)。尽管照射后的荧光分布是弥散的，但不是绝对均匀的，但它与探针明显的外化一致，表明细胞器完整性被破坏。
图5。PDT前后ALA和MitoTracker Green或LysoTracker Green孵育细胞的荧光图像。
盖片上培养的细胞用1mm ALA孵育2.5小时;然后，加入150 nM MitoTracker Green(上面板)或LysoTracker Green(下面板)，继续孵育30分钟(A, C)。平板照射10分钟，1小时后用荧光显微镜检查细胞器形态(B, D)。比尺为10µm。
外源性给药ALA诱导卟啉合成，从而导致照射后的细胞死亡，可由多种药物调节。作为修改PDT结果的第一次尝试，我们测试了对血红素代谢影响众所周知的化合物。通过这种方式，我们验证了PDT系统通过增加和减少卟啉合成和/或细胞死亡来调节的能力。正如预期的那样，5-氨基乙酰丙酸脱水酶(血红素生物合成途径的第二种酶)的抑制剂SA显著降低了ALA诱导的卟啉合成几乎达到控制水平，并减少了光照后的细胞死亡。另一方面，铁镇静剂Dfx通过降低血红素生物合成最后一步的可用铁，从而诱导血红素前体的积累，增强了ALA-PDT后的细胞死亡(图6)。
图6。SA或Dfx存在下ALA-PDT后卟啉合成和细胞存活。
细胞用1mm Dfx或SA孵育1小时。然后加入1 mM ALA，继续孵育3小时。用PBS清洗细胞，用2ml 5% HCl覆盖细胞，在37°C下孵育20分钟，以提取细胞内卟啉(n条深灰色条)。在PDT后1小时用MTT法测定细胞存活率(n条浅灰色条)。(ê: p < 0.05;ó:p < 0.01，在ALA存在下的孵育和辐照值显著性)。
考虑到ROS是PDT诱导细胞死亡的早期和主要效应因子之一，我们测试了几种抗氧化剂和自由基清除剂对药物调节治疗结果的能力;这些化合物或中和或劫持ROS。
研究人员使用了各种具有独特化学性质的抗氧化剂或活性氧清除剂:Man、Trp、谷胱甘肽、Asc和Trx。为了验证它们都没有表现出细胞毒性/光活性，用不同浓度的清除剂(0.1 ~ 20 mM)孵育细胞，并进行10分钟的照射，进行细胞活力测定。我们没有发现任何清道夫本身的光敏作用，也没有任何药物显示出任何刺激细胞死亡。在接下来的实验中，出现毒性的浓度被丢弃。这些药剂也测试了卟啉合成的任何改变，但它们都没有显著增加或减少卟啉水平(数据未显示)。一旦检查了这一点，在整个选定的浓度范围内评估化合物调节ALA-PDT处理细胞的活力的能力。
为了比较所测试化合物的效果，我们将保护等级(PG)定义为有清除剂存在的ALA-PDT后细胞存活率与无清除剂存在的存活率之间的比率，并选择具有最高PG的浓度进行以下实验(图7)。根据化合物的不同，在不同浓度下发现了最大PG (1 mM GSH, PG: 2.1±0.3;10 mM Man, PG: 1.1±0.1;1 mM Trp, PG: 1.7±0.1;1 mM Asc, PG: 2.6±0.1;1 mM Trx, PG: 3.5±0.1)，可归因于每种药剂的化学性质和特定的镇静作用。
图7。不同浓度ROS清除剂对ALA-PDT的影响。
将细胞与ROS清除剂在0.01 mM至20 mM的无毒非光活性浓度下预培养1小时。在最终浓度为1 mM时加入ALA，继续培养3小时。细胞照射10分钟，1小时后进行MTT测定。在存在和不存在清除剂的情况下，ALA-PDT后细胞存活率的比值定义为每种清除剂的保护等级(PG) (A: GSH;B: Trp;C:人;D: Asc;艾凡:硫氧还蛋白)。
为了确定这些清除剂的预孵育是否能调节ALA-PDT后的凋亡细胞死亡，用吖啶橙/溴化乙锭进行了双染色。10 min ALA-PDT，光剂量高于之前测定的LD50(7 min)，晚期凋亡细胞达60.7±1.7%，早期凋亡细胞达37.7±1.7%，总凋亡细胞达98.4±3.4%，说明治疗有效。清除剂预孵育显著降低了Asc、Trx、Man、GSH和Trp的凋亡率，分别为48.3±2.7%、58.8±4.2、64.3±1.6%、78.5±3.1%和74.6±2.3%(图8面板A，图9A)。
图8。不同ROS清除剂预孵育1小时后10 min ALA-PDT的细胞形态。细胞用最高PG浓度的清除剂预孵育1小时，然后用1mm ALA孵育3小时，照射10分钟。1小时后，细胞胰化，用吖啶橙和溴化乙锭染色(A组)，荧光显微镜下观察，或用Annexin V-FITC /碘化丙啶标记(B组)，流式细胞仪分析。通过光散射和流式细胞仪评估细胞大小和颗粒度(图C)。
同样，用保护剂预孵育降低了Annexin V-FITC/碘化丙啶标记测定的光损伤。Asc和Trx分别使凋亡细胞的信号从26.8±4.2%显著降低到3.15±0.35%和1.2±0.5%。Man、GSH和Trp分别使细胞凋亡水平降低至9.95±4.45%、18.3±6.3%和3.45±0.25%(图8面板B，图9B)。这些结果证实了之前用形态学凋亡染色得到的结果，尽管Trp在流式细胞术中显示出更高的保护作用。
图9。用不同的ROS清除剂和10分钟ALA-PDT预孵育1小时后，定量活细胞、凋亡细胞和坏死细胞．
细胞在光动力处理1小时后胰蛋白酶化，用吖啶橙/溴化乙啶染色，荧光显微镜下观察(A)，或用Annexin V-FITC /碘化丙啶标记，流式细胞仪分析(B)。
柱形颜色:黑色■:活细胞;深灰色■:早期凋亡细胞;浅灰色■:凋亡细胞;□白色:坏死细胞)(*:p < 0.05;*: p < 0.01，相对于10分钟ALA-PDT值显著性)。
这些结果表明，与仅ALA-PDT处理的细胞相比，清除剂预处理的细胞凋亡程度显著降低。此外，在最高PG下用清除剂预孵育的细胞显示了与对照细胞相似的FSC-SSC图(图3面板F)，表明在辐照过程中，当保护剂存在时，ALA-PDT处理明显不影响细胞形态(图8面板C)。
通过使用特定的氧化荧光探针，流式细胞仪可以检测ALA-PDT后几种ROS的产生。ALA-PDT后过氧化物生成采用H2-DCFDA，可被过氧自由基、过氧化氢和羟基自由基氧化。在MVP的选择性氧化过程中检测到单线态氧。用特异探针HE监测超氧阴离子的产生，用极化线粒体吸收的Rh123分析线粒体膜电位(MMP)。
ALA-PDT后检测到活性物质水平增加(图10A)。过氧化物和单线态氧在10 min ALA-PDT (H2-DCFDA阳性细胞:69.3±5.6%;MVP阳性细胞:83.5±1.9%)，这可能是由于ROS不稳定和寿命短。此外，根据ROS的快速形成动力学(数据未显示)，较低的时间剂量，如5分钟，水平已经很高。超氧阴离子在照射15 min后达到最高水平(HE阳性细胞:70.6,5±8.1%)和线粒体去极化细胞(Rh 123阴性细胞:32.1±11.1%)。
图10。ALA-PDT检测细胞内ROS及线粒体膜电位。
用流式细胞仪检测氧化ROS特异性探针的荧光，计数阳性细胞(A)。柱状颜色:黑色■:H2-DCFDA;深灰色■:MVP;浅灰色■:HE;□Rh 123。H2-DCFDA) (B)、(MVP) (C),(他)(D)和123年(Rh) (E)所示。细胞用最高PG浓度的Asc和Trx预孵育1小时，用1mm ALA孵育3小时，照射10或15分钟。1小时后，细胞胰化并负载H2-DCFDA(10µM)， MVP(10µM)， HE(2µM)或Rh 123(10µM)， 37°C在黑暗中孵育30分钟。(*: p < 0.05;*: p < 0.01，相对于10分钟ALA-PDT值显著性)。
高保护性清除剂如Asc和Trx能够减少过氧化自由基的产生(Asc和Trx预处理H2-DCFDA阳性细胞:分别从69.3±5.6%降至50.7±2.8%和20.8±0.5%)，但只有Asc对降低单态氧和超氧阴离子水平有效(Asc和Trx预处理MVP阳性细胞:分别从83.5±1.9%降至25.4±5.2%和73.6±3.4%;Asc和Trx预处理的HE阳性细胞:分别从70.6、5±8.1%到2.8±1.3%和34.6±1.1%)。另一方面，清除剂预处理对线粒体膜去极化没有显著影响。在PDT前与清道夫孵育，导致与对照细胞相似的光散射，这表明在清道夫存在的光动力处理下，细胞形态略有改变(数据未显示)。
外源性给药ALA可以绕过血红素对自身生物合成途径的负反馈控制，诱导PpIX的积累。与正常细胞相比，恶性细胞中PpIX的积累更为明显，这是ALA-PDT的基本原理[16,17]。PDT相对于传统癌症疗法的优势在于其整齐和选择性地杀死肿瘤细胞。ROS的产生能够在有限的时间窗口内对重要的细胞器造成严重损伤，从而限制细胞对周围正常组织的损伤，诱导细胞死亡过程与氧化启动过程一样简单:细胞凋亡。
在这项工作中，我们发现肺癌A549细胞对ALA-PDT表现出轻度剂量依赖性反应，并且在治疗后不久，凋亡作为最广泛的细胞死亡过程出现。凋亡细胞形态即使在少量ALA-PDT剂量5分钟后也会增加，并在光照照射10分钟后变得主要;即使在测试的最高剂量下，坏死百分比仍然很低。尽管PDT可引起细胞凋亡或坏死，或两种机制的结合，这似乎取决于PDT的剂量，但ALA-PDT通常在低剂量下诱导细胞凋亡的效率很高，这意味着比引起坏死所需的剂量更低的剂量对产生所需的细胞杀伤非常有效，然而，这一结果并不排除自噬和溶酶体凋亡参与细胞杀伤[28-31]。
ala诱导的PpIX主要定位于线粒体，如共聚焦图像所示。关于细胞器损伤，与PpIX定位一致，线粒体似乎受到10分钟ALA-PDT的严重影响，这不仅是PpIX合成的主要位点，也是内在凋亡途径启动的位点。PS的定位是细胞损伤的主要部位，因为PDT后形成的光氧化物种寿命短，扩散距离短[36,37]。在线粒体去极化的细胞中，Rh 123荧光缺失，ALA-PDT后MMP增加，支持线粒体是细胞死亡起始点的假设。溶酶体破坏虽然不是PpIX可能的亚细胞定位，但也作为ALA-PDT的结果出现。大多数定位于溶酶体的PS可以延迟或阻断细胞坏死的凋亡程序[26]，这在我们的系统中没有观察到。溶酶体腔室对氧化非常敏感，据报道，在金丝桃素[31]光敏的细胞中，溶酶体膜的通透性并不先于MMP。
阐明PDT调节药物的行为是增强恶性组织细胞死亡和防止正常细胞[38]死亡的有用工具。预计铁螯合剂Dfx将通过增加血红素前体的积累[39]来增强pdt诱导的细胞死亡。然而，作为一种铁螯合剂，Dfx也可以通过干扰光化学反应来减少ROS的生成。在我们的情况下，按照福原爱et al。报告[39]，Dfx能增强ALA-PDT诱导的细胞死亡;另一方面，SA通过抑制5-氨基乙酰丙酸脱水酶，可显著降低ALA诱导的卟啉合成，使其接近控制水平，并降低光照后的细胞死亡。
另一方面，抗氧化剂主要是还原剂，易于清除自由基;因此，抗氧化剂可以与氧气竞争猝灭三重态敏化剂或中和产生的反应种，从而抵消PDT的作用[40-42]。
有一些关于某些抗氧化剂和活性物种清除剂对光敏性诱导的致命氧化应激的保护作用的报道，然而，它们的作用存在争议，因为观察到在某些情况下，它们可能会增加、减少或根本不影响PDT疗效[41-45]。
总的来说，清除单线态氧的抗氧化剂(如维生素C)可能会降低PDT[24]的有效性，而增加单线态氧量的抗氧化剂(如山竹素)可能对PDT[46]具有协同作用。许多抗氧化剂可以表现出促氧化活性，特别是在催化金属存在的情况下;抗氧化剂加入系统的时间越晚，它就越容易起促氧化剂的作用。[47]。在PDT中应用某些自由基清除剂的潜在治疗收益在于，例如，在预防PDT的副作用，如皮肤敏感性[48]。
某些抗氧化剂是否表现出抗氧化或促氧化行为取决于分子结构、浓度和添加时间等。在假设它们的作用之前，对这些经常用于临床上减少对正常组织的光损伤的药物进行表征是一个重要的阶段;这就是为什么研究抗氧化作用对PDT变得重要。
我们提交了2021年版权OAT的结果。所有权利保留对ALA-PDT至少表现出轻微的保护作用。特别是Trx和Asc对诱导细胞死亡和防止ROS生成具有最大的保护作用。在测试的抗氧化剂中，Asc在自由基诱导的细胞损伤防御中起着核心作用，还表现出抗癌、抗突变、抗菌、抗病毒和抗炎作用[49]。它能够反应和还原所有生理相关的ROS和活性氮物种，包括超氧化物、氢过氧自由基、水过氧自由基、单线态氧、臭氧、二氧化氮、氮氧化物自由基和次氯酸[24]。这可能是它在降低过氧化物和单线态氧流式细胞仪信号时如此有效的原因。
Trx是维生素E和α-生育酚类似物[50]的水溶性衍生物;这种主要的膜结合细胞抗氧化剂[51]，尽管具有广泛的ROS清除光谱，其中包括过氧化氢[52]，但在我们的模型中不能显著减少单线态氧的诱导。Besselnik等艾尔。然而，Melnikova说，[53]报告了通过Tx和双嘧达莫联合使用，可以保护红血球悬浮液免受光溶血对病毒PDT失活的影响et al。[54]发现对注射Tx的裸鼠HT29人大肠腺癌异种移植进行的meta-四羟基苯氯化物(mTHPC)敏化PDT增强。
谷胱甘肽、色氨酸和人自身或在有光的情况下都能提高生存能力。清除剂的预孵育不仅提高了细胞活力，而且阻止了特定的凋亡特征。通过流式细胞仪检测到，与不含这些化合物的对照组相比，存在清除剂时的存活细胞比例更高。这些药剂的保护作用与形态学染色结果一致，对于Trp，流式细胞术分析时的保护作用较形态学特征高;GSH和Man表现出异质性和低pg，尽管它们能够显著降低凋亡细胞的百分比。
这些结果表明清除剂具有一定的特异性，因为它们的作用在具有显著作用的ROS物种中有所不同。此外，ROS在光动力处理后的早期事件中发挥了重要的作用。
许多癌症治疗方法将传统疗法与补充疗法和替代疗法相结合。在这种情况下，一些抗氧化剂能够调节PDT的结果，提高其在肿瘤组织中的疗效，减少对正常组织的光损伤，是使用这种非侵入性治疗的一个有前途的成就。
这项工作得到了布宜诺斯艾利斯大学(UBACyT X 01/W521)、国家科学技术机构(PICT-1806)和国家研究委员会(CONICET, PIP 11220100100173)的资助。HF和AB担任CONICET的科学研究员;MJT和BD是CONICET的研究员。
音)山口
埃默里大学医学院
研究文章
收稿日期:2016年3月20日
录用日期:2016年4月25日
发布日期:2016年4月29日
©2016 Teijo MJ。这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名许可的条款发布，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是要注明原作者和来源。
张晓明，张晓明，张晓明，等(2016)5-氨基乙酰丙烯酸介导的光动力治疗对肺腺癌细胞凋亡的影响。综合癌症科学与治疗。3:DOI: 10.15761/ICST.1000187。
波尔菲里亚和波尔菲里亚清醒调查中心(CIPYP) - CONICET, Clínicas医院，Viamonte 1881-10A, 1056-布宜诺斯艾利斯，阿根廷，电话/传真:(54)11-4590-8346。
图1所示。增加照射时间对细胞存活的影响。细胞在无血清培养基中(●)或不含(〇)1mm ALA孵育3h，然后在不同时间用荧光灯照射;1h后进行MTT实验。条形图:基于三个独立实验的SE，每个实验有三个平行点。
图2。ALA诱导的PpIX定位。
用ALA (A和D)、ALA + MitoTracker Green (B)或ALA + LysoTracker Green (E)孵育细胞的荧光共聚焦图像以及相应的合并(C和F)。简单地说，在盖片上生长的细胞用1mM ALA孵育18小时，然后加载150 nM MitoTracker或LysoTracker Green，并在共聚焦显微镜下观察(尼康C1，目标:60倍Plan Apo Oil NA 1.40;比例尺:20µm)。
图3。不同时间剂量ALA-PDT对细胞形态的影响。
细胞用1mm ALA孵育3小时，然后照射2,5,7,10,15分钟。1小时后，仍附着在覆盖物上的细胞固定，用甲苯胺蓝(A图)或赫斯特(B和C图)染色，并在常规或荧光显微镜下观察。在平行实验中，用吖啶橙/溴化乙锭对细胞进行胰蛋白酶化和染色(D组)，并在荧光显微镜下观察，或用Annexin V-FITC /碘化丙啶标记(E组)并通过流式细胞仪分析。通过流式细胞仪的光散射评估细胞大小和粒度(F图)。A、B和C图的比例尺为100µm, D图的比例尺为150µm。
图4。不同ALA-PDT时间剂量后存活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的定量。
一旦进行PDT，细胞经过胰蛋白酶化和吖啶橙/溴化乙锭染色1小时后，用荧光显微镜观察和计数(A)，或用Annexin V-FITC /碘化丙啶标记并用流式细胞仪分析(B)。柱状颜色:黑色■:活细胞;深灰色■:早期凋亡细胞;浅灰色■:凋亡细胞;□白色:坏死细胞)(*:p < 0.05;*: p < 0.01;对未处理对照细胞的显著性)。
图5。PDT前后ALA和MitoTracker Green或LysoTracker Green孵育细胞的荧光图像。
盖片上培养的细胞用1mm ALA孵育2.5小时;然后，加入150 nM MitoTracker Green(上面板)或LysoTracker Green(下面板)，继续孵育30分钟(A, C)。平板照射10分钟，1小时后用荧光显微镜检查细胞器形态(B, D)。比尺为10µm。
图6。SA或Dfx存在下ALA-PDT后卟啉合成和细胞存活。
细胞用1mm Dfx或SA孵育1小时。然后加入1 mM ALA，继续孵育3小时。用PBS清洗细胞，用2ml 5% HCl覆盖细胞，在37°C下孵育20分钟，以提取细胞内卟啉(n条深灰色条)。在PDT后1小时用MTT法测定细胞存活率(n条浅灰色条)。(ê: p < 0.05;ó:p < 0.01，在ALA存在下的孵育和辐照值显著性)。
图7。不同浓度ROS清除剂对ALA-PDT的影响。
将细胞与ROS清除剂在0.01 mM至20 mM的无毒非光活性浓度下预培养1小时。在最终浓度为1 mM时加入ALA，继续培养3小时。细胞照射10分钟，1小时后进行MTT测定。在存在和不存在清除剂的情况下，ALA-PDT后细胞存活率的比值定义为每种清除剂的保护等级(PG) (A: GSH;B: Trp;C:人;D: Asc;艾凡:硫氧还蛋白)。
图8。不同ROS清除剂预孵育1小时后10 min ALA-PDT的细胞形态。细胞用最高PG浓度的清除剂预孵育1小时，然后用1mm ALA孵育3小时，照射10分钟。1小时后，细胞胰化，用吖啶橙和溴化乙锭染色(A组)，荧光显微镜下观察，或用Annexin V-FITC /碘化丙啶标记(B组)，流式细胞仪分析。通过光散射和流式细胞仪评估细胞大小和颗粒度(图C)。
图9。用不同的ROS清除剂和10分钟ALA-PDT预孵育1小时后，定量活细胞、凋亡细胞和坏死细胞．
细胞在光动力处理1小时后胰蛋白酶化，用吖啶橙/溴化乙啶染色，荧光显微镜下观察(A)，或用Annexin V-FITC /碘化丙啶标记，流式细胞仪分析(B)。
柱形颜色:黑色■:活细胞;深灰色■:早期凋亡细胞;浅灰色■:凋亡细胞;□白色:坏死细胞)(*:p < 0.05;*: p < 0.01，相对于10分钟ALA-PDT值显著性)。
图10。ALA-PDT检测细胞内ROS及线粒体膜电位。
用流式细胞仪检测氧化ROS特异性探针的荧光，计数阳性细胞(A)。柱状颜色:黑色■:H2-DCFDA;深灰色■:MVP;浅灰色■:HE;□Rh 123。H2-DCFDA) (B)、(MVP) (C),(他)(D)和123年(Rh) (E)所示。细胞用最高PG浓度的Asc和Trx预孵育1小时，用1mm ALA孵育3小时，照射10或15分钟。1小时后，细胞胰化并负载H2-DCFDA(10µM)， MVP(10µM)， HE(2µM)或Rh 123(10µM)， 37°C在黑暗中孵育30分钟。(*: p < 0.05;*: p < 0.01，相对于10分钟ALA-PDT值显著性)。
