摘要
癌细胞需要细胞器特异性未折叠蛋白反应的调节,如内质网(ER)应激,因为它们在快速增殖和细胞生长过程中增加了代谢活性,这是通过激活多种信号通路来实现的。在本研究中,我们根据癌细胞的需求,重点研究了内质网应激的动态调节,并在单细胞水平上利用生物发光成像技术,实时监测了结合免疫球蛋白蛋白(Bip)启动子的激活情况,该启动子是癌细胞生长过程中对内质网应激反应最灵敏的基因之一。短暂转染报告基因后,我们从单个活癌细胞中获得生物发光图像,并观察到细胞生长过程中Bip启动子的激活。在稳定转染了报告基因的胶质母细胞瘤癌细胞的2D和3D培养中也观察到Bip启动子激活。在细胞生长过程中,Bip启动子尤其在分裂细胞中被激活。然后,我们通过生物发光成像在U251/pBipPro-Luc肿瘤组织切片中实时监测Bip启动子的激活情况。发光强度不是恒定的,在肿瘤切片的各个区域是不同的,并且在监测期间,Bip启动子在多个区域被激活在体外。这些结果表明,单细胞水平的生物发光成像实时监测不仅是癌细胞信号转导的基因分析和未折叠蛋白反应动力学调控的合适工具,而且还可以用于评估抗癌药物的功效,并且可以提供使用常规检测难以获得的额外信息。
关键字
内质网应激反应;生物发光;单细胞水平成像,癌细胞,LV200系统
缩写
ER:内质网,2D或3D:二维或三维,Bip/GRP78:结合免疫球蛋白蛋白/ 78kda葡萄糖调节蛋白,LV200: LUMINOVIEW LV200, EGFR:表皮生长因子受体,Akt:蛋白激酶B, PBS:磷酸盐缓冲盐水,ROI:感兴趣区域
介绍
真核细胞包含一组细胞器,这些细胞器具有特定的细胞功能,并通过在启动子区域调节应激元件的基因的转录激活来响应应激。在细胞器应激过程中,内质网(endoplasmic reticulum, ER)应激反应(又称未折叠蛋白反应)是目前研究得最多的细胞器特异性应激反应之一,内质网内错误折叠或未折叠蛋白的积累激活了ER特异性应激反应[1]。内质网约占细胞总体积的10%[2],是细胞膜或分泌蛋白的折叠和组装、脂质和固醇的生物合成以及游离钙的储存等过程中不可或缺的重要细胞器[3]。这些新合成的膜或分泌蛋白被内质网伴侣和折叠酶正确折叠,如结合免疫球蛋白蛋白(Bip;也称为78 kDa葡萄糖调节蛋白[GRP78])和蛋白二硫异构酶,在内质网中被转运到高尔基体,然后进入分泌途径[4]。Bip是一种主要的伴侣蛋白,是对内质网应激反应最敏感的蛋白之一,在细胞中作为促生存成分发挥着关键作用,如在内质网应激条件下保护细胞免于死亡和耐药[5,6]。据报道,许多类型的癌症依赖于内质网来维持关键信号通路中重要蛋白质的正确结构[7];此外,多种癌症在内质网应激时激活一组信号转导通路以维持内质网稳态[8,9]。据报道,升高的Bip水平还可以防止几种常见抗癌药物如阿霉素、紫杉醇和替莫唑胺诱导的癌细胞死亡[10-12]。因此,癌细胞内质网应激反应不仅是提高化疗疗效的重要靶点,也是开发新型抗癌药物的重要靶点。
在此之前,我们在单细胞水平上使用高转染效率和低转染效率的癌细胞测量了内质网胁迫下Bip启动子的激活,并通过单细胞生物发光成像观察到即使在转染效率最低的细胞中该启动子的激活。我们描述了该系统如何不仅可用于快速确认转染效率和检测瞬时转染到几种癌症和正常细胞系的报告基因,还可用于使用转染效率低的癌细胞实时监测启动子活性[13]。由于生物发光成像有几个优点,如低背景和高定量[14],与荧光成像(如绿色荧光蛋白或异硫氰酸荧光素)相比,不需要使用激发光对活细胞的损伤程度低[15],并且观察周期更长(数天或数周)[16]。通过生物发光技术实时监测癌细胞生长过程中的内质网应激,将使我们能够获得传统方法难以获得的新信息。
在这项研究中,我们描述了在二维和三维(2D和3D)细胞培养过程中,基于单细胞水平生物发光成像的Bip启动子活性的实时监测。我们还报道了通过生物发光成像监测从U251肿瘤组织切片中获得的Bip启动子激活,其中U251细胞稳定地转染了报告质粒在体外。
材料与方法
材料
人乳腺腺癌细胞(MDA-MB-231)和人纤维肉瘤细胞(HT1080)购自American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)。如前所述获得人胶质母细胞瘤细胞系(U251)[13]。细胞在含有10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的rpm -1640 (U251、HT1080和MDA-MB-231)培养基中,37℃、5% CO气氛下培养2空气/ 95%。
细胞生长试验
如前所述[17],使用WST-8测定法评估细胞生长情况。简单地说,将细胞以3000个细胞/孔的速度接种到96孔板中,然后根据制造商的方案,使用活细胞计数试剂SF (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan)检测活细胞的数量。使用96孔微孔板读取仪(GE Healthcare Bioscience, Piscataway, NJ, USA)在450 nm波长处测量吸光度。
报告质粒的构建、转染和报告分析
基于NCBI的人类基因组序列信息,采用5′-GGGAGGGGACTCAGA引物,从人类基因组DNA (Promega, Madison, WI, USA)中PCR扩增Bip启动子区(-772 ~ +97)T3 '和5 ' -CGGCAGGGGCCCGGGGTCACAAG结论以CCACGAACCAGGC-3’为正向和反向引物,分别(突变核苷酸)引入Bgl二世和后III限制位点下划线),并克隆到Bgl二世,后pGL4.14载体(Promega)的III个位点,该载体含有萤火虫荧光素酶基因,但缺乏真核启动子或增强子元件。如前所述[18],进行了报告基因试验。简单地说,根据制造商的方案,用Lipofectamine LTX (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)转染含有Bip启动子的萤火虫荧光素酶报告质粒(pBipPro-Luc)。的Renilla使用GloMax 96微孔板光度计(Promega),以含荧光素酶的质粒pRL-SV40 (Promega)作为报告者测定的内参。萤火虫荧光素酶的相对活性Renilla采用双荧光素酶测定系统(Promega)测定荧光素酶。如前所述,使用thapsigargin诱导内质网应激[19]。
生物荧光成像
使用LUMINOVIEW LV200成像系统(Olympus, Tokyo, Japan)获得单细胞水平的生物发光图像,如前所述[13]。简单地说,用pBipPro-Luc短暂转染后,将培养皿置于37°C的湿室中保存。使用40倍物镜,以5或10分钟的间隔曝光10或30秒,同时观察添加终浓度为500µM的d -荧光素(Promega)后的Bip启动子活性。采用AQUACOSMOS软件进行数据分析。2.6;滨松光电,静冈,日本)。为了长期观察Bip启动子的激活情况,在含有200 μg/mL的hygromycin B (Nacalai Tesque)的选择性培养基中,按照制造商的方案,用Lipofectamine LTX短暂转染后制备稳定转染了pBipPro-Luc的U251细胞(U251/pBipPro-Luc/稳定细胞),然后使用上述LV200系统获得单细胞水平的生物发光图像。使用带有ES10ZE对焦控制器(PRIOR Scientific, Rockland, MA, USA)的LV200系统获得3D培养期间的生物发光图像,其中使用Cellbed片(Japan Vilene, Tokyo, Japan)。使用40倍物镜,以10分钟间隔曝光10秒,拍摄厚度为5µm(总厚度为100 mm)的图像。数据分析使用cellSens Dimension (ver.)进行。 1.9; Olympus) and Volocity 6.3 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) software.
U251肿瘤组织切片中Bip启动子活性的生物发光成像
动物实验按照京都大学动物研究委员会的指导方针进行。U251/pBipPro-Luc/稳定细胞(1.0 × 107将细胞/100 mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)皮下移植到裸鼠(雌性,7周龄BALB/c nu/nu小鼠;SLC,静冈,日本)。当肿瘤平均体积达到约150mm时3.使用IVIS-200检测每个U251/pBipPro-Luc肿瘤的发光强度在活的有机体内腹腔注射100µL d -萤光素(2 mg/mL)后,取出成像装置(Xenogen, Alameda, CA, USA),然后在小鼠处死后立即收获肿瘤。U251/pBipPro-Luc肿瘤组织切片(400 mm厚)采用振动原子型显微切片机(LinearSlicer, Pro7;D.S.K,京都,日本),根据制造商的协议,在冰冷的PBS中。使用LV200系统,在加入终浓度为500 mM的d -荧光素后,使用20倍物镜,在充满RPMI培养基的玻璃底皿上以10分钟间隔曝光10 s,对肿瘤切片进行生物发光成像。
结果
肿瘤细胞内质网应激下构建的Bip启动子报告基因的证实
我们首先进行了细胞生长实验,比较了U251、HT1080和MDA-MB-231这三种不同类型肿瘤细胞系的生长速率,但报告质粒DNA在这三种细胞系中的转染效率是相似的[13]。如图1A所示,在相同的培养条件下,这些细胞的生长速度是不同的:U251细胞最具攻击性,而MDA-MB-231细胞的生长速度是最慢的。当我们通过western blotting检测U251、HT1080和MDA-MB-231细胞中Bip蛋白的内源性表达水平时,这些细胞系之间Bip蛋白的表达水平没有显著差异(补充图S1)。接下来,我们使用Bip启动子报告基因(pBipPro-Luc)进行了报告基因测定,该基因在启动子区域包含一个顺式作用元件,受内质网应激调节[20],并检测了该结构在这些癌细胞系中通过thapsigargin处理诱导内质网应激后的反应。结果证实,构建的Bip报告基因在不同生长速度的这些癌细胞系中对内质网应激有响应(图1B)。我们认为,这些癌细胞之间生长速度的差异不会影响内质网应激诱导下Bip启动子的应答水平。
图1所示。使用响应内质网应激的Bip启动子报告基因的细胞生长和报告基因测定
(A) U251、HT1080和MDA-MB-231细胞的细胞生长试验。在指定时间使用WST-8测定法评估细胞生长情况。(B)内质网应激诱导后Bip启动子激活报告试验。将pBipPro-Luc瞬时转染U251、HT1080和MDA-MB-231细胞,然后用thapsigargin (0.5 mM)诱导内质网应激后,用光度计进行报告基因检测。数据表示96孔板中三次测定的平均值±标准差(SD)。
单细胞水平生物发光成像对肿瘤细胞中Bip启动子激活的时间过程分析
在短暂转染Bip报告基因后,我们使用LV200系统在单细胞水平上进行了时间过程分析,以捕获癌细胞生长过程中的生物发光图像(U251, HT1080和MDA-MB-231)。在细胞生长过程中进行实时监测。如图2所示,尽管报告基因的强度在细胞系之间不同,但在单细胞水平上测试的所有细胞系在生长过程中都观察到足够的发光强度用于时间过程监测,并且也观察到Bip启动子激活。Bip启动子在每个被检测的细胞系生长过程中不断被激活,其激活水平在U251、HT1080和MDA-MB-231细胞之间没有显著差异(图2)。这表明,在癌细胞生长过程中,无论这些细胞系的生长速度如何,Bip启动子的激活都是显著的,并且如前所述,诱导了持续的内质网应激[8,9]。
图2。单细胞水平生物发光成像对不同生长速率癌细胞中Bip启动子激活的时间过程分析
(A)瞬时转染pBipPro-Luc的U251、HT1080和MDA-MB-231细胞生长0、12和24 h时LV200系统获得的生物发光图像。生物发光图像中的正方形表示感兴趣区域(roi),在其中测量发光强度以进行单细胞水平的延时分析。标尺尺寸均为100 μm。(B)单细胞成像中Bip启动子激活的时间过程分析。使用LV200系统瞬时转染pBipPro-Luc后U251、HT1080和MDA-MB-231细胞中Bip启动子激活的时间过程分析
U251/pBipPro-Luc/稳定细胞中Bip启动子激活的时间过程分析
如图1和图2所示,U251细胞中Bip启动子的发光强度水平足够高,可以进行时间过程观察,并且该癌细胞系的生长速度是在所分析的癌细胞系中最具攻击性的。接下来,我们在单细胞水平上使用U251/pBipPro-Luc/稳定细胞(其中U251细胞稳定转染了Bip启动子报告基因)在细胞生长期间对Bip启动子活性进行了更长时间(>24 h)的时间过程分析。如图3所示,在U251/pBipPro-Luc/稳定细胞中观察到足够的发光强度用于时间过程监测,并且在单细胞水平上也发现了Bip启动子的激活。有趣的是,Bip启动子被周期性激活,发光强度发生变化,特别是当U251/pBipPro-Luc/稳定细胞分裂时(图3C)。
图3。单细胞水平成像分析U251/pBipPro-Luc/稳定细胞中Bip启动子激活的时间过程
(A) LV200系统获得的U251/pBipPro-Luc/稳定细胞生长0、24、48和72 h的生物发光图像。生物发光图像中的正方形表示roi,其中发光强度是在单细胞水平上测量的延时分析。标尺尺寸均为100 μm。(B)单细胞成像中Bip启动子激活的时间过程分析。使用LV200系统分析U251/pBipPro-Luc/稳定细胞中Bip启动子激活的时间过程。(C) Bip启动子在癌细胞分裂中的激活。图像使用高倍率物镜(100倍),曝光2分钟,同时观察Bip启动子活性。图像中的罗马数字和每个图像下方的数字分别表示细胞分裂的顺序和单细胞水平上这些细胞的发光强度。标尺尺寸均为50 μm。
单细胞水平生物发光成像技术分析U251/pBipPro-Luc/稳定细胞在3D细胞培养过程中Bip启动子激活的时间过程
最近的一些报道表明,与传统的2D单层细胞培养相比,3D细胞培养在生理上与细胞形态、基因和蛋白质表达模式以及细胞信号传导更相关[21-23]。因此,我们使用U251/pBipPro-Luc/稳定细胞在3D细胞生长过程中对Bip启动子活性进行了时间过程分析。将U251/pBipPro-Luc/stable细胞接种于Cellbed sheet上(如图S2A所示),然后使用CellMask染色的荧光显微镜分析癌细胞在3D培养物中的生长情况(Supplementary Figure S2B)。如图4A所示,使用LV200系统也生成了U251/pBipPro-Luc/稳定细胞在3D培养中的生物发光图像。U251/pBipPro-Luc/稳定细胞的发光强度也足够高,可以实时监测Bip启动子活性。此外,在3D细胞培养过程中,Bip启动子在3D生物发光图像中五个选定的感兴趣区域(roi)也被周期性激活(图4B和C)。这些结果表明,Bip启动子在癌细胞生长过程中被周期性激活,特别是在细胞分裂时被激活,与图3所示的结果相似。
U251/pBipPro-Luc肿瘤组织切片的生物发光成像时程分析
由于Bip启动子在被检测的癌细胞系中在2D和3D培养条件下的生长过程中都被激活,并且据报道许多类型的癌症依赖于内质网应激反应来维持内质网稳态[7-9],我们通过基于生物发光的实时监测来研究肿瘤中Bip启动子的激活。U251/pBipPro-Luc/稳定细胞成功皮下移植到裸鼠体内。如图5A所示,利用IVIS成像系统获得U251/pBipPro-Luc肿瘤的生物发光图像,证实在建立的稳定细胞系中,Bip启动子被激活。接下来,我们使用LV200系统检测了U251/pBipPro-Luc肿瘤组织切片的发光强度。如图5B所示,发光强度不是恒定的,在各个区域呈现不同的发光强度;特别是肿瘤切片的外区强度高于内区。当我们从肿瘤切片的这些不同发光强度区域中选择roi进行生物发光的时间过程分析时,观察到Bip启动子在37°C的细胞培养基中在5% CO气氛中孵育期间在几个区域(如roi 2、3、4和7)被激活2/95%空气使用LV200系统。我们还观察到,在切片孵育期间,不同区域(如roi 5、6和7)的Bip启动子出现了两个明显的激活峰(分别约为2.5-3天和5天)(图5C)。使用LV200系统添加d -荧光素后,至少在充满培养基的玻璃底培养皿上,可以使用生物发光成像对肿瘤切片进行6天(144小时)的实时监测(图5C),尽管总体发光强度逐渐下降,但这段时间足以监测组织切片中启动子的激活(图5B,5C)。这些结果表明,基于生物发光成像的组织切片实时监测将不仅是分析启动子激活的新工具在活的有机体内而且还可以评估抗癌药物的抗肿瘤活性,这将使我们能够获得新的和有意义的信息,因为与传统方法相比,我们可以通过LV200系统的实时监测更详细,更长期地观察组织切片上的区域。
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图4。单细胞水平生物发光成像技术分析U251/pBipPro-Luc/稳定细胞在3D培养过程中Bip启动子激活的时间过程
(A)使用LV200系统,U251/pBipPro-Luc/稳定细胞在Cellbed片上3D培养12小时的3D生物发光图像。(B) U251/pBipPro-Luc/稳定细胞在3D细胞培养过程中24、48和72 h的切片图。标尺尺寸均为250 μm。(C)三维细胞培养过程中roi(包括随机选择的几个细胞)中Bip启动子激活的时间过程分析。使用LV200系统分析U251/pBipPro-Luc/稳定细胞中Bip启动子激活的时间过程。插图为3D细胞培养过程中24,48和72h的三维生物发光图像,用于延时分析,图像中的方块表示roi,其中测量发光强度用于延时分析。所有3D图像数据均通过cellSens Dimension或Volocity 6.3软件进行分析。
图5。使用IVIS或LV200系统对U251/pBipPro-Luc肿瘤或组织切片进行生物发光成像
(一)在活的有机体内U251/pBipPro-Luc肿瘤移植小鼠的生物发光成像。生物发光图像用IV注射d -荧光素后10min的IS光谱系统。箭头表示肿瘤区域。(B)在样品制备后0、24、48、72、96和120 h,用LV200系统捕获U251/pBipPro-Luc肿瘤组织切片的生物发光图像,并在培养基中加入d -荧光素。生物发光图像中的正方形表示用于延时分析的发光强度测量的roi。(C) U251/pBipPro-Luc肿瘤组织切片中Bip启动子激活的时间过程分析。使用LV200系统进行时程分析。
图S1: Bip蛋白在U251、HT1080和MDA-MB-231细胞中的表达水平
用抗Bip抗体western blotting检测指定细胞系的总细胞提取物中Bip蛋白的表达。以β-肌动蛋白为加载对照。用化学发光法观察条带。
补充图S2:使用细胞片进行癌细胞的三维培养
(A)使用桌面显微镜TM3030 (Hitachi high - technologies, Tokyo, Japan)拍摄细胞片的扫描电镜图片(左),细胞片由灭菌的高纯度二氧化硅纤维组成,用于3D细胞培养。如图所示,将细胞片置于塑料板中,将培养基中的细胞悬液接种于细胞片上(右图)。次日,将膜片倒置,移入含d -荧光素培养基的玻璃底培养皿中(右图),用LV200系统对癌细胞三维培养过程进行生物发光成像。(B) U251/pBipPro-Luc/稳定细胞3D培养后的荧光染色。U251/pBipPro-Luc/stable细胞在Cellbed片上3D培养5天后,用特异性染色质膜的CellMask对片进行染色,用4%多聚甲醛在PBS中固定,然后用FV1000共聚焦激光扫描显微镜(Olympus)获得荧光图像。使用20x物镜捕获每1mm(共55mm厚度)的红色荧光图像,然后使用FluoView软件(Olympus)进行数据分析。标尺表示100 μm。(C) 2D和3D培养后EGFR、Bip和Akt蛋白的表达水平。2D或3D培养后的细胞提取物用相应抗体进行western blotting检测EGFR、Bip和Akt的表达。以β-肌动蛋白为负载对照,化学发光法显示条带。
讨论
内质网应激反应是真核细胞中被阐明最多的细胞器特异性应激反应之一[1],众所周知,内质网应激反应是癌细胞在快速侵袭生长过程中维持内质网稳态的重要关键因素[7-9]。在这项研究中,我们利用单细胞水平的生物发光成像技术,在2D和3D细胞培养条件下对癌细胞生长过程中的Bip启动子活性进行了实时监测。通过LV200系统实时监测,我们成功获得了这些培养条件下Bip启动子激活的生物发光图像。据报道,增高的Bip水平可以保护癌细胞免受多种抗癌药物诱导的死亡[10-12],因此,在癌细胞生长过程中实时监测Bip启动子活性不仅对提高化疗疗效,而且对开发新的抗癌药物具有重要意义。虽然生物发光存在发光强度低于荧光的缺点,但我们在之前的报道中成功开发了一种新的单细胞水平生物发光成像光学系统,该系统将显微镜与传统的冷电荷耦合器件相机相结合[24]。在本研究中,我们证明了这种新的LV200光学系统使我们不仅可以在瞬时转染的癌细胞中获得足够的实时监测发光强度,而且可以在稳定转染报告基因的癌细胞中获得长期观察的发光强度。
恶性胶质瘤是成人原发性恶性脑肿瘤中最常见和最致命的一种,尽管手术治疗有了显著的进步,但完全切除是非常困难的[25]。此前有报道称,Bip是改善恶性胶质瘤化疗敏感性的新靶点,能够抑制Bip的药物与替莫唑胺等常规抗癌药物联合使用,将成为消除术后残留癌细胞、提高恶性胶质瘤化疗有效性的新途径[10]。在本研究中,通过单细胞水平的实时监测,发现在癌细胞生长过程中,在2D和3D细胞培养条件下,Bip启动子周期性地被激活,特别是在分裂细胞中。这一发现得到了先前一份报告的支持,该报告指出,在有丝分裂期间,几种伴侣蛋白(如Hsp70)的合成水平增加,尽管细胞中蛋白质合成的总速率在有丝分裂期间因伸长因子2的磷酸化增加而降低[26,27],这表明这些伴侣蛋白在细胞周期的这一阶段是不可或缺的。我们还发现,肿瘤切片的外区发光强度高于内区。这些结果表明,Bip启动子在旺盛生长的肿瘤细胞中被激活。因此,本研究显示的生物发光实时监测Bip启动子活性将为恶性胶质瘤的有效化疗方案的确定或新型抗癌药物的开发提供新的途径。
在本研究中,我们使用了Cellbed sheet,它由灭菌的高纯度二氧化硅纤维组成,具有适合癌细胞在培养基中三维生长的结构,如图补充图S2A所示。与使用富含层粘胶蛋白的细胞外基质(如Matrigel)相比,使用该薄片进行三维细胞培养更加简单方便[22,23]。Luca等人最近报道,癌细胞的3D微环境降低了表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)的表达水平,并且与2D培养相比,3D细胞培养中基因表达模式明显改变[23]。如补充图S2C所示,与2D培养相比,使用Cellbed sheet进行3D细胞培养后,EGFR、蛋白激酶B (Akt)等几种蛋白的表达水平也发生了变化。这表明,该薄片的培养条件不同于二维单层条件,可能与上述常规方法提供类似的三维微环境,尽管需要进一步的微环境研究来证实这一假设。我们还证明,在3D细胞培养过程中,可以使用3D生物发光图像中选择的roi来执行Bip启动子激活的时间过程分析,其中包括几个细胞。因此,使用从3D细胞培养中获得的3D生物发光图像进行时间过程分析可能会提供使用常规2D癌细胞培养成像难以获得的新信息。
我们还发现,生物发光成像使我们能够使用LV200系统在培养基中培养期间监测肿瘤切片中Bip启动子的活性(图5B,5C)。然而,当我们使用肿瘤切片进行实时监测时,肿瘤切片的整体发光强度逐渐下降(图5B,5C)。先前有报道称,在培养过程中,氧化荧光素是由d -荧光素在培养基中氧化产生的[28],并且在观察过程中提出氧化荧光素可以影响肿瘤切片的发光强度。虽然利用生物发光技术对培养基中的肿瘤切片进行超过6天的实时监测还需要进行一些改进,但与LV200系统相比,使用生物发光技术具有几个优点,例如对活细胞的损伤较小。因此,我们可以在单细胞水平上利用生物发光成像获得实时监测的可用信息,这是传统方法难以获得的。结合我们之前的报道[13],本研究中基于单细胞水平生物发光成像的延时分析与传统荧光成像或荧光计报告基因分析相比有几个优势,并将为癌细胞内质网应激反应提供进一步的重要信息或发现。
结论
总之,目前的数据描述了单细胞水平的生物发光成像系统如何不仅可以用于实时监测2D和3D细胞培养过程中单个细胞中的启动子激活,还可以用于实时监测从肿瘤中获得的组织切片在体外。因此,这些观察结果将有助于进一步研究基因分析,信号转导,以及基于生物发光的报告细胞试验中每个细胞器和细胞器特异性应激反应的动力学调节在体外和在活的有机体内。
利益冲突
明吉龙太郎、畑大洋子、铃木博美都是奥林巴斯公司的员工。Koji Kawakami是奥林巴斯公司的科学顾问。其他作者都没有潜在的利益冲突。
致谢
我们感谢Keiko shimura, Mitsuko Tachi和Yoshie Masuda(京都大学医学和公共卫生研究生院药物流行病学系)在细胞培养方面的技术援助。我们也感谢Masaaki Kawabe博士、Rie Watanabe博士、Takuya Iwasa博士和Kouhei Sasaki博士(日本Vilene)通过扫描电子显微镜观察了细胞片,并就3D细胞培养提供了技术建议。本研究由科学研究资助基金(B)资助(批准号:26290052)和青年科学家(B)(批准号:24790072),来自日本科学促进会。这项研究也得到了奥林巴斯公司合作研究基金的部分支持。
补充材料和方法
材料
抗bip小鼠单克隆抗体购自R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)。抗egfr、抗akt和抗erk1 /2抗体购自Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)。抗β-肌动蛋白抗体购自Sigma (St. Louis, MO, USA)。CellMask购自Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)。
西方墨点法
如前所述[1]进行Western blotting。简单地说,用报告蛋白裂解缓冲液(Promega, Madison, WI, USA)裂解的细胞制备总蛋白提取物,通过SDS-PAGE分离,然后根据制造商的方案使用iBlot系统(Invitrogen)转移到硝化纤维素膜上。用抗体探测淬火膜,并使用增强试剂Chemi-Lumi One Super (Nacalai Tesque)和LAS-3000 LuminoImage分析仪(富士胶片公司,东京,日本)进行分析。
补充参考
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