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摘要

背景:先前的研究表明银屑病患者患心血管疾病的风险增加。我们也知道，异常水平的microRNA (miRNA)有助于银屑病及其共病的发病机制。此外，miRNA基因内的单核苷酸多态性(SNPs)或miRNA靶基因的3'UTR可改变基因表达，从而参与疾病的发病机制。

目标在中欧高加索血统的银屑病患者的大队列(n=558)中，评估HSPB7 3'UTR范围内的SNP rs1048261，并评估其在银屑病患者心血管疾病(CVD)风险增加中的可能作用。

方法:本研究纳入558例银屑病患者;30%的患者有心血管病史。在网上分析用于确定一个候选SNP，该SNP与mirna介导的翻译调节的潜在损伤相关。所选SNP rs1048261采用PCR-RFLP进行基因分型，所有统计分析均采用统计学软件R进行。

结果测试了基因型和个人CVD病史之间可能的相互作用，但未发现显著关联。随后，对银屑病的临床亚型(斑块型银屑病、脓疱型银屑病和点滴型银屑病)以及银屑病发病年龄进行分析，以确定其基因型与CVD的相关性，但均未发现相关性具有统计学意义。最后，建立逻辑回归模型来检验与个人CVD病史的任何可能联系，但所有结果都是不确定的。

结论:尽管我们的研究没有提供SNP rs1048261与心血管发病率的任何显著关联，但我们建议在一组独立于牛皮癣的正确诊断的心血管疾病患者中研究该多态性。此外，miRNA-mRNA相互作用和SNP rs1048261参与的验证需要研究。

关键字

HSPB7, SNP, rs1048261, miRNA, microRNA，牛皮癣，心血管疾病，共病

简介

银屑病是一种慢性炎症性皮肤病，在高加索人群中估计患病率约为3%。该疾病的特征是皮肤上出现界限明确的红色鳞状斑块，这是角质形成细胞异常增殖和分化和炎症[2]的结果。除了皮肤表现外，银屑病是一种复杂的疾病，因此与多种共病相关，如银屑病性关节炎、糖尿病、肥胖、高血压[3]，最重要的是，与心血管疾病的风险增加[4-8]。

炎症途径的一个共同特征，包括银屑病的炎症，是氧化应激的产生和活性氧(ROS)的产生，这可能对细胞[9]中的脂质和蛋白质造成氧化损伤。然而，细胞受到进化保守防御和修复机制的保护，以中和这些损伤。因此，这些机制中的任何失衡都可能增加细胞中ROS的数量或未修复的损伤，从而导致疾病的病理状态。这种缺陷可能被认为是银屑病CVD的危险因素[10-11]。

细胞对氧化损伤的防御反应之一是诱导热休克蛋白(Hsp)的表达，它能够修复变性蛋白并促进其降解[12]。在这项研究中，我们专注于小Hsp家族的心脏特异性成员，HSPB7。HSPB7也被称为cvHsp[13]，其特点是相对较小的分子量18,6 kDa和高度保守的α-结晶蛋白结构域，这对其伴侣样活性很重要[14,15]。这种丰富的蛋白在心肌细胞中选择性表达，但在骨骼肌和脂肪组织[13]中也有较低的表达。它的分子结构显示了小Hsp家族的特性，似乎与心脏应激反应[16]有重要关系。虽然其生物学功能尚不清楚，但HSPB7似乎具有保护功能，防止心肌梗死时变性细胞骨架蛋白在急性应激下的错误折叠或再折叠。然而，高水平的HSPB7与急性冠状动脉综合征[17]的风险增加相关。

MicroRNAs (miRNAs)是一种长约21nt的小分子非编码RNA，可通过与靶mRNA[18]的3'UTR的不完全碱基配对，在转录后水平调控基因表达。对于目标的识别和调节，miRNA从5'端开始到3'端的前2-8nt计数序列似乎是重要的[19]。最近的研究表明，MiRNAs参与了各种疾病的病理，包括牛皮癣[20,21]和心血管疾病[22,23]。然而，不仅仅是miRNA表达的变化与疾病病理有关。最近的研究表明，在靶基因3'UTR的种子区或靶序列内的snp可以产生、干扰或改变miRNA-target相互作用，从而可能导致其生物学功能的中断，从而影响许多疾病的发展和表型[24,25]。

在本研究中，我们旨在确定可能破坏miRNAs调控HSPB7表达机制的HSPB7 3'UTR内的SNP rs1048261是否与银屑病患者心血管发病率增加有关。

材料和方法

主题

银屑病患者队列(n=558;性别比例M / F = 244/314;平均年龄49.7±16.4;银屑病发病时的平均年龄为26.9±15.9)，收集于捷克布尔诺圣安妮大学医院皮肤科第一科。所有参与研究的患者均为白种人。对临床诊断为银屑病的个体进行详细描述，记录银屑病和心血管疾病的家族史和个人病史。所有患者被分为3种临床亚型(斑块型银屑病n=428;脓疱性银屑病n = 22;点滴型牛皮癣n=106)，根据Griffiths定义的标准et al。[26]。30%的患者患有心血管疾病。

该研究得到了捷克共和国布尔诺马萨里克大学人体医学实验伦理委员会的批准，并按照《赫尔辛基宣言》准则的伦理标准进行。所有参与者都提供了书面知情同意，随后将其存档。

生物信息学

在数据库MirSNP[27]和miRNASNP2[24]中搜索HSPB7中可能的mirna相关snp(最后访问时间为2016年3月16日)。

然后对查询结果进行过滤，以满足以下条件:

• 次要等位基因频率(MAF)高于5%
• 相关miRNA的平均表达量至少为10 reads / million (RPM)
• SNP在全基因组关联研究(GWAS)连锁不平衡(LD)区域

只有rs1048261 SNP符合列出的条件，然后在中欧银屑病患者的一个大队列中作为CVD的可能危险因素进行分析。rs1048261 SNP和相关miRNAs的信息列在图1中。

图1所示。rs1048261 SNP特征和相关的miRNAs/SNP相互作用

基因分型

采用蛋白酶k法从外周血中提取被分析基因组DNA，采用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析HSPB7基因3'UTR中rs1048261位点。219 bp的扩增片段由以下引物生成:正向5 ' - gtgctgctttgtcactga -3 '和反向5 ' -CCAGGGTTAAGGCTGATGGA-3 '。以0.1µg基因组DNA为模板，在95°C变性10 min;95°C变性30s, 60°C退火20s, 72°C延伸30s 32个循环;最后在72℃下延长5分钟，然后冷却至15℃。PCR产物(10µl)用3单位带Buffer g的限制性内切酶PvuII酶切进行RFLP分析。酶切在37℃下进行12小时，然后在4%用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶上分离产物。A等位基因的片段长度为140-79 bp, T等位基因的片段长度为50-90-79 bp(等位基因被报道为正向基因组)。

统计数据

统计软件R(3.2.1版)进行所有的统计分析。连续变量用平均值±标准差表示，分类变量用百分比表示。渐近的皮尔逊c²Fisher精确检验用于检验Hardy-Weinberg平衡。分类变量之间的关系用皮尔逊c检验²独立测试。组间比较采用非参数Kruskal - Wallis检验，而两两比较采用Wilcoxon秩和检验(Benjamini和Hochberg p值调整)。以个人CVD病史为因变量，以HSPB7基因型、性别、银屑病发病年龄和银屑病临床亚型为自变量，建立logistic回归模型。然后基于赤池信息准则(AIC)进行后向逐步回归约简。

结果

研究对象的基本特征见表1。

	男人				女性				整体
	AA	在	TT	没有数据	AA	在	TT	没有数据
没有心血管疾病历史	87	65	12	10	93	84	24	15	390
斑块性银屑病	64	46	9	8	68	59	19	13	286
脓疱性银屑病	2	4		1	3.	4			14
银屑病	21	15	3.	1	22	21	5	2	90
化学汽相淀积积极的历史	31	30.	4	5	32	45	12	9	168
斑块性银屑病	26	25	3.	5	27	37	10	9	142
脓疱性银屑病	1	3.	1		1	2			8
银屑病	4	2			4	6	2		18
整体	118	95	16	15	125	129	36	24	558

表1．研究对象的基本特征

rs1048261 SNP在HSPB7中的基因型分布

HSPB7中rs1048261 SNP基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡(p=0.971)。rs1048261 SNP的AA、AT和TT基因型频率分别为10.0%、43.2%和46.8%。A等位基因的等位基因频率为31.6%，T等位基因频率为68.4%。性别间基因型分布无统计学差异。

两个范畴变量之间的关系

分析分类变量(基因型、性别、银屑病临床亚型和个人CVD病史)之间可能的关系²测试。rs1048261基因型与性别显著相关(p=0.05)，而Cramér基因型的V值(V=0.107)则提示其影响较弱。银屑病临床亚型与CVD之间存在统计学意义上的相关性(p=0.004)，但Cramér的V (V=0.141)也表明这两个变量之间的相关性较弱。

组间比较

在rs1048261基因型的分布方面，组间比较没有发现疾病的临床亚型和/或心血管共病之间的显著差异(p=NS)。唯一观察到的心血管共病与疾病临床亚型之间的相关性与发病年龄和入组年龄有关(分别为p<0.001和p<0.001)。

个人心血管病史的Logistic回归模型

为进一步分析，以个人CVD病史为因变量，以基因型、性别、银屑病临床亚型和银屑病发病年龄为自变量，建立logistic回归模型。然后采用基于AIC的后向逐步回归进行模型约简。用似然比检验比较两种模型的拟合优度，结果无统计学差异。最终模型显示，只有银屑病的临床亚型和银屑病发病年龄具有统计学意义。完整模型和简化模型均未证实rs1048261基因型与银屑病患者CVD发生之间的显著相关性。在logistic回归模型中，rs1048261遗传变异性对银屑病患者CVD的预测作用未被证实。

讨论

虽然研究银屑病皮肤特征的病因和试验适当的治疗似乎至关重要，但很少关注银屑病的共病。值得注意的是，撇开混杂因素，银屑病患者患心血管疾病的相对风险增加了25%，即。吸烟、肥胖、血脂异常、高血压和糖尿病。然而，到目前为止，对于解释牛皮癣中CVD患病率较高的潜在机制知之甚少。在本研究中，我们研究了在3'UTR内的rs1048261 SNPHSPB7作为银屑病CVD的独立危险因素。SNP在3'UTR范围内提示可能与miRNA转录后基因调控的去调控机制有关，该机制可能被SNP所破坏。这种损伤会影响细胞中心脏特异性HSPB7的蛋白水平，从而增加银屑病患者的心血管疾病发病率。因此，我们研究了SNP rs1048261在银屑病患者(n=558)中可能存在的相关性，其中30%的患者有个人CVD病史。

当我们假设银屑病和CVD风险之间可能存在联系时，我们关注的是银屑病发病的主要因素，即慢性炎症和氧化应激的产生。虽然这两个过程在银屑病的发病机制中密切相关，但氧化应激负责细胞损伤和蛋白质、脂蛋白和脂类的修饰。这些损伤可能显著促进CVD的发生[10,29,30]。尽管细胞具有多种防御机制，但这种机制的损害可能被认为是CVD的一个危险因素。在这种损伤中可能起作用的候选基因之一是HSPB7，这是一种在氧化应激反应中表达增加的心脏特异性Hsp[31,32]。例如，在伴有急性冠状动脉综合征[17]的急性胸痛患者的血浆中检测到HSPB7浓度显著升高。

不仅是蛋白质浓度升高，还有内部的遗传变异HSPB7既往观察到与缺血性和非缺血性心肌病相关[33,34]。另一项研究描述了SNP rs1739843HSPB7扩张型心肌病是一种结构性心脏病[35]。同样,维拉德et al。[36]在特发性扩张型心肌病广泛性GWAS中发现了与该病理相关的SNPs。这是迄今为止第一项也是唯一一项提及SNP rs1048261与CVD[36]相关的研究。在银屑病患者[37]中也观察到这种病理性心脏病的患病率增加。GWAS与rs1048261 SNP的小等位基因(A)与扩张型心肌病[36]风险降低相关。

在在网上通过对SNP rs1048261的分析，发现了miRNA-mRNA相互作用的几种可能影响的预测。我们用于分析的数据库(MirSNP, miRNASNP2)大多预测了在主等位基因t的情况下，结合位点的丢失。因为SNP在SNP数据库中是向前定向进入基因组和编码序列的HSPB7的方向相反，结合位点的实际破坏与mRNA中的互补碱基A有关HSPB7．SNP的变化可能因此改变miRNA的结合HSPB7mRNA，从而影响mirna介导的翻译抑制的效率HSPB7．

虽然我们的研究结果没有显示在我们的银屑病患者队列中SNP rs104261基因型与CVD的任何关联，但没有分析的变量，即性别、银屑病的临床亚型、银屑病发病时的年龄;我们还可以讨论SNP和相关miRNAs的可能作用。由于miRNA具有多效性，因此能够调节多个靶基因的表达，我们可能会观察到miRNA有助于疾病病理的几种途径。因此，在PubMed上搜索与心血管发病率和/或氧化应激相关的候选miRNAs时，发现了它们之间的几种关联。然而，只有miR-15a和miR-195在银屑病患者心血管事件频繁发生时被观察到。MiR-15a在急性冠状动脉综合征[38]患者中被发现下调，而急性冠状动脉综合征属于影响银屑病患者[39]的主要心血管事件之一。MiR-195在心肌细胞中过表达，产生ROS并诱导凋亡。miR-195的下调减少了棕榈酸刺激心肌细胞的ROS产生和凋亡。Sirt1对细胞凋亡有抑制作用，被确定为直接靶点[40]。

观察到的这些mirna的失调本身可以促进疾病病理，因此，即使是这种平衡机制中的微小变化也可能是至关重要的。在我们的病例中，与主要等位基因T结合位点的丢失会导致过表达HSPB7在急性胸痛[17]的患者中观察到。另一方面，小等位基因A可能与基因表达的标准调控有关，这可能与GWAS研究表明的小连列[36]的保护特性一致，也可能不一致。HSPB7的结构和功能特征表明，在心血管事件中，过表达可能是有益的。相反，虽然标准调控可以保证调控过程的正常进行，但标准版本的调控也可能涉及到未调控的miRNAs的结合，这可能会显著改变表达HSPB7．

除了使用miRNA/SNP数据库，miRdSNP数据库(http://mirdsnp.ccr.buffalo.edu/;)将rs1048261与另外两个miRNAs (miR-874, miR-143)结合在SNP位点下游的3'UTR上。这两个miRNA结合位点都经过了实验验证，数据库显示SNP rs1048261可能对这两个miRNA的调控功能有影响。

该研究的主要优势在于队列中包括的大量患者，均来自中欧高加索人群。然而，银屑病的发展和疾病的临床过程都受到大量混杂因素的影响，包括本研究中未调查的社会经济因素，因此可能存在局限性。此外，还需要更多关于所研究的多态性的实际功能影响的信息。

尽管我们的研究没有发现SNP rs1048261基因型与银屑病患者CVD的任何关联，但我们认为该多态性应该在其他专注于特定的、正确诊断的CVD的研究中独立研究。同样，对候选miRNAs与的mRNA结合的实验验证HSPB7我们将不胜感激。

2021年版权燕麦。所有权利reserv

确认

该研究得到了捷克共和国教育、青年和体育部(LM2011028)支持的CETOCOEN PLUS项目和RECETOX基础设施的支持。

参考文献

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