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摘要

我们最近的研究显示了热应激下小鼠成纤维细胞神经酰胺(Cer)糖基化和Cer相关基因的激活。我们研究了通过转染Cer半乳糖基转移酶(GalT，又称UGT8)基因将Cer半乳糖基化引入成纤维细胞Mop8时，是否会影响Cer水平。当细胞被标记为¹⁴c -半乳糖，亲代Mop8细胞在2d -高性能薄层色谱(HPTLC)上只在单己基神经酰胺区显示糖基神经酰胺(glucosyl神经酰胺，GlcCer)，而转染细胞(MopGT)除表达GlcCer外，还表达了一个与GalCer对应的斑点。MopGT细胞内癌明显减少。这些结果表明，Cer的糖基化作用于细胞调节的Cer，这是一个被称为促凋亡因子。顺便说一下，在MopGT中通过代谢标记观察到另一个比GalCer移动更慢的新点(我们称为GTX)。与之前的报道相比，在转染脑GalT基因的CHO细胞中，除了GalCer外，半乳糖-烷基甘油也能稳定表达，并且在碱性处理下容易水解产生半乳糖-烷基甘油作为lyso形式[van der Bijl P等．(1996)物化学J317: 589-597]表明我们的GTX对应于半乳糖烷基甘油。的确，当HPTLC制备的GTX用质谱(MS)分析时，m/z 501, 527和529主要观察到[m +Na]⁺，结果与烷基链分别为16:0、18:1和18:0的单半乳糖-单烷基甘油一致。采用制备薄层色谱法，不经碱性处理，制备半乳糖烷基烯基甘油(即GTXorg)。GTXorg质谱显示的分子离子分别对应16:0烷基和16:0酰基链、18:1烷基和16:0酰基链、18:0烷基和16:0酰基链。这些发现支持GalT的神经酰胺结合位点的底物识别不是非常特异性的观点，接受甘油脂作为底物。

关键字

神经酰胺(Cer);galactosyl-alkylacyl甘油;galactosylceramide (GalCer);半乳糖基转移酶(高尔特)基因;collision-induced离解(CID);基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)

简介

Cer是真核细胞中主要的生物活性脂质，在细胞信号转导中起脂质第二信使的作用[1,2]。Cer被认为参与多种细胞功能，包括调节细胞生长、分化和活力。此外，许多抗癌药物能够诱导内源性神经酰胺产生，促进癌细胞凋亡[3]。众所周知，高温和紫外线照射等各种应激会提高细胞内的Cer水平，进而导致细胞凋亡[4]。在之前的研究中，我们证实了MDCK细胞高渗胁迫增加了Cer含量，并上调了GalT的mRNA水平，导致GalCer积累[5]。高渗胁迫还通过MAPK信号通路[6]影响更复杂的糖鞘脂的合成，如硫代糖脂。在我们最近的研究中，热应激MDCK细胞中Cer的含量增加，通过代谢标记[7]，表明从丝氨酸的de novo合成以及从Cer的GlcCer和GalCer合成均增加。热胁迫下，癌糖基转移酶(GlcT)和GalT基因表达显著增加。因此，我们推测热应激下的Cer积累可能是激活单己基神经酰胺(GlcCer和/或GalCer)合成的一个触发器，以降低细胞内的Cer水平，避免细胞凋亡。我们证实，在热应激[8]下Mop8(多瘤病毒转化小鼠成纤维细胞)细胞中也发生了Cer的增加及其随后的糖基化。 In the present study, we investigated whether the Cer level was affected or not when the Cer galactosylation was introduced into Mop8 by transducing GalT gene. In the transfectant, which we referred to as MopGT, novel galactosyl glycerolipid was stably expressed in addition to GalCer in accordance with the previous study with CHO cells [9], and this lipid was easily hydrolyzed with alkaline treatment to produce galactosyl-alkyl glycerol as the lyso form. The Cer metabolism in this transfectant, molecular species of the newly expressed glycosyl glycerolipid characterized with matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) with high energy collision-induced dissociation (CID) are discussed.

材料和方法

试剂和标准

本实验室分别从马肾和人肾制备了GlcCer和laaccer。牛脑中的GalCer，磷脂酰丝氨酸(PS)，磷脂酰胆碱(PC)，磷脂酰乙醇胺(PE)和鞘磷脂(SM)从Sigma-Aldrich公司(St. Louis, MO, USA)获得。牛脑中的Cer购自Funakoshi Co.(日本东京)。用快速启动Bradford染料试剂(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)测定蛋白质浓度。薄层色谱(TLC)在硅胶60高性能薄层色谱(HPTLC)板(Merck, Darmstadt, Germany)上进行。糖脂类的检测采用醇类试剂，脂类的检测采用樱草胺试剂。

细胞培养

Mop8细胞[10]具有由融合到多瘤病毒早期区域的SV40早期启动子组成的混合转录单元，购买于美国类型培养集合，并在含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基(Nissui Pharmaceutical Co, Tokyo, Japan)中培养(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。

质粒pSV-GT-E22的构建及转染

以大鼠脑mRNA为模板和引物(5 ' -ggacgcgctatgaagtcttata-3 '和5 ' -tcaatgaccgacacatatctgc-3 ')，采用一步RNA PCR试剂盒(Takara Bio, Ohtsu, Shiga, Japan)克隆大鼠脑GalT基因[11]。PCR扩增子(1679 bp)与载体(pSV2neo)连接，构建psvv - gt - e22，转染Mop8细胞，筛选出耐新霉素MopGT细胞。该转化细胞永久表达GalCer。

肿瘤和糖脂的代谢标记

¹⁴C (U) -L-serine (24.7 kBq /毫升;Moravek Biochemicals Inc.， Brea, CA, USA)在不同条件下加入Cer 16小时。提取脂质，用含0.88%氯化钾的Folch溶剂体系进行分离。采用两种溶剂逐步展开的HPTLC法对下相进行了分析:第一种溶剂为氯仿/甲醇/醋酸(9:1:1,v/v)至板顶，第二种溶剂为氯仿/甲醇/氨(65:35:5 .5,v/v)至板顶60%。在薄层色谱后，使用成像分析仪(FLA-7000, Fujifilm，东京，日本)来确定脂质中包含的放射性。以Cer、PE、PS、PC、SM为薄层色谱标准，采用喷雾法测定。与[1 -标签¹⁴C]- d -半乳糖(Moravek Biochemicals Inc.)在定向条件下进行。细胞培养5 h¹⁴c -半乳糖(37kbq /mL)，之后用氯仿/甲醇(2:1和1:2,v/v)提取脂质两次。然后用碱性甲醇处理细胞脂质。中和和脱盐后，使用DEAE- Sephadex®a -25 (Pharmacia精细化学品AB, Uppsala，瑞典)色谱柱获得中性糖脂部分。在HPTLC平板上采用氯仿/甲醇/水(60:25:4,v/v)和2-丙醇/氢氧化铵/醋酸甲酯/水(15:2:1:3,v/v)二维制备中性糖脂[5-7]。使用液体闪烁计数器(Packard Instrument Co. Inc.， Downers Grove, IL, USA)测量纳入糖脂的总放射性。在没有碱性处理的情况下，细胞与[1-]培养24 h¹⁴C] -D-galactose (7.4 kBq /毫升)。按上述方法提取细胞脂质后，粗提物经分馏部分纯化。采用氯仿/甲醇/水(60:25:4,v/v)薄层色谱法分离GTXorg。经碱性处理后，薄层色谱法制备GTX。

糖脂的制备及薄层色谱分析

通过氯仿/甲醇萃取、温和碱性处理、DEAE-Sephadex®A-25柱层析和上面提到的薄层色谱法从细胞中制备非放射性糖脂。薄层色谱中可见醇醇- h₂所以₄在120°C加热几分钟。

质谱分析

脂质样品的MALDI-TOF MS是在AXIMA性能质谱仪(Shimadzu Biotech, Manchester, UK)上进行的，使用的是氯化钠作为基质饱和的2,5-二羟基苯甲酸(DHB, Bruker Daltonics, Bremen, Germany)。血管紧张素II(岛津GLC Ltd.;M + H⁺的m/z 1046.54)， C16 Cer (Funakoshi;M + H⁺的m/z 537.90)和α-氰基-4-羟基肉桂酸(Shimadzu GLC Ltd.;M + H⁺m/z 190.05)进行质量校准。将脂质溶液(0.5 μL)与基质溶液(0.5 μL)混合在MALDI-TOF不锈钢板表面。所有光谱都是在正离子反射模式下使用配备氮紫外激光器(337 nm)的质谱计获得的。用MALDI-MS软件采集所有质谱数据进行分析。通常，每个MS光谱采集4000次激光，为了尽可能提高分辨率和峰值强度，一般在80激光功率下采集光谱，并使用MALDI-MS软件进行分析。采用氦气进行高能CID裂解，用于MS/MS分析。

统计分析

使用未配对的方法评估统计学意义t测试;P<0.05认为差异有统计学意义。

结果

转染GalT基因的Mop8细胞中新糖脂的合成

用PCR方法克隆大鼠脑GalT基因，构建到质粒载体pSV2neo上，构建新的psvv - gt - e22载体。用该载体转染Mop8细胞，筛选出新霉素耐药转化细胞MopGT。从Mop8和MopGT细胞中分别通过氯仿/甲醇萃取，然后进行温和碱性处理，DEAE-Sephadex®A-25柱层析和薄层色谱制备糖脂。Mop8细胞和MopGT细胞的糖脂被代谢标记¹⁴采用双溶剂体系的2D-HPTLC分析分离中性糖脂。用成像分析仪对平板进行分析(图1)。图1A和1B分别显示了Mop8细胞和MopGT细胞的糖脂谱。Mop8细胞的GlcCer和lacer与它们的真实参考因子共同迁移。整合¹⁴转染GalT基因后，c -半乳糖在GlcCer和lacer中的表达不变(图1C和1D)。比GlcCer移动更慢的点(被指定为GalCer)与真实的GalCer共迁移(图1B)。在这个板块中，另一个新的光点(被指定为GTX)被检测到比真正的LacCer移动得更快(图1B)。这两种新脂类是根据HPTLC上的甲酚阳性反应确定为糖脂类(数据未显示)。

图1。MopGT细胞中新糖脂的合成。融合细胞在37°C培养15 h。然后用¹⁴C-半乳糖(37 kBq/mL)在37℃下加热5小时。如材料和方法部分所述，制备中性糖脂，并采用2D-HPTLC法，垂直方向为氯仿/甲醇/水(60:25:4,v/v)，水平方向为2-丙醇/氢氧化铵/醋酸甲酯/水(15:2:1:3,v/v)。的¹⁴用射电成像分析了c与中性糖脂的结合。用喷雾剂观察参比糖脂。(A)对照组Mop8细胞，(B) MopGT细胞，A;GlcCer(马肾)，b;GalCer(牛脑)，c;lacer(人肾)，(C)与GlcCer合并，(D)与GalCer、lacer和X (GTX)合并。

MopGT细胞中的Cer和磷脂代谢

从细胞中提取的细胞和磷脂用HPTLC分析，采用两步发展过程和两种溶剂体系。MopGT细胞合并明显减少¹⁴与Mop8细胞相比，c -丝氨酸进入Cer的比例降低了42%，进入PC的比例也显著降低了33%(图2B)。喷洒primuline试剂测定的Cer含量显示MopGT细胞降低29%(图2C和2D)。这些结果表明，在不改变GlcCer和lacer的情况下，半乳糖化的Cer降低了细胞内的Cer含量，说明GalT在控制Cer浓度方面发挥了作用。鞘磷脂合成酶从癌中合成的SM也没有明显下降。

图2。MopGT细胞中Cer和磷脂代谢的变化。融合细胞用¹⁴C-丝氨酸(37 kBq/mL)在37℃下持续16小时。在材料和方法部分中所制备的总脂类在第一次运行时用氯仿/甲醇/醋酸(9:1:1,v/v) HPTLC分离，然后干燥，然后用氯仿/甲醇/醋酸/水(25:15:4:2,v/v)重新显像，直到第一次运行时溶剂顶部的65%。(A)脂质代表性TLC成像模式，(B)¹⁴C-脂质掺入，(C) primuline试剂检测脂质的代表性TLC成像模式(D) primuline试剂测定的Cer含量。*差异显著，P<0.05 (n=4)。

MALDI-TOF MS分析MopGT细胞中GTX和GTXorg

细胞被标记后¹⁴从Mop8和MopGT细胞中提取c -半乳糖、脂类，并在HPTLC上进行比较(图3)。在MopGT细胞中，在未进行碱性处理的提取物(巷2)中检测到比GlcCer移动更快的斑点(命名为GTXorg)，在进行碱性处理的提取物(巷4)中检测到比GalCer移动更慢的斑点(命名为GTX)。当从HPTLC中分离出GTXorg斑点(巷2)并进行碱处理时，产品(第六道)与HPTLC上的GTX点(第四道)融合。随后，GTX和GTXorg从非标记细胞提取物中经或不经碱性处理，用制备HPTLC进行MALDI-TOF MS分析。

图3。GTX和GTXorg的制备。细胞脂质提取物的tlc放射成像。以氯仿/甲醇/水(60:25:4)为溶剂制备标记脂类。

Lane 1, Mop8细胞未经碱性处理的总脂质提取物。

Lane 2, MopGT细胞未经碱性处理的总脂质提取物。

Lane 3, Mop8细胞总脂质提取液经碱性处理。

Lane 4, MopGT细胞总脂质提取物，经碱性处理。

第五道，GTXorg由TLC板制备。

第六道，GTXorg经碱性处理后的产物。

采用MALDI-TOF MS对GTX进行分析(图4)，其光谱显示在m/z为501.19、527.27和529.31的三个离子峰。在m/z 501、527和529处的峰对应于钠化分子离子([m +Na])⁺)的烷基链分别为16:0、18:1和18:0的单己基单烷基甘油(图4A)。MS/MS分析m/ z501和高能CID碎片显示，典型的碎片离子来自一部分己糖(Hex) (m/z 113和157)，一个Hex (m/z 185和201)和一部分己糖甘油(m/z 243)(图4B和4C)。离子团簇(m/z 317、331、345、359、373、387、401、415、429、443、457、471和485)相差14 Da (-CH₂-)，表明离子来源于C16:0的烷基链。其他片段离子的分配如图4C所示。我们还对m/ z529的分子离子进行了CID裂解分析，揭示了含有C18:0的单己基单烷基甘油的结构(图4D)。C18:1对应的分子离子m/ z527作为一个小峰没有进行CID碎片分析。

图4。GTX的MALDI-TOF MS分析。(A). GTX分子离子[M+Na]+。*身份不明的信号。(B) GTX (C16:0)中m/ z501分子离子的CID质裂谱。(C) GTX的质量碎片分配(m/ z501)。(D) GTX (C18:0)中m/ z529分子离子的CID质裂谱。

GTXorg光谱显示有三个分子离子m/z 739.35、765.36和767.37，分别对应C16:0烷基和C16:0酰基链、C18:1烷基和C16:0酰基链、C18:0烷基和C16:0酰基链的组合(图5A)。峰在m/z 739处对应的是单己基-单烷基-单酰甘油的钠化分子离子，其中烷基链为C16:0，酰基链为C16:0。用高能CID碎片对m/z 739进行MS/MS分析显示，典型的碎片离子来自部分Hex (m/z 113和157)、一个Hex (m/z 185和203)和一部分己糖甘油(m/z 243)(图5B和5C)，如GTX中观察到的(图4B和4C)。一个优势离子(m/ z483)可能来自GTXorg，没有酰基链(图5B和5C)。该离子(m/ z483)也可以在GTX光谱(图4B)中观察到[m - H₂O - Na)⁺．相反，没有烷基链的GTXorg生成一个小离子(m/ z499)(图5B和5C)。甘油的C-1和GTX的烷基链之间同样的裂解显示了一个离子的m/z 259(图4B和4C)。离子团簇(m/z 555、569、583、597、611、625、639、653、667、681、695、709和723)相差14 Da (-CH₂-)，表明离子依次从C16:0的烷基链或酰基链离开亚甲基(图5B)。同时对m/z 765-767分子离子区进行CID裂解分析，发现单己基-单烷基-单酰甘油的结构中，烷基链为C18:1或C18:0，酰基链为C16:0(图5D)。由于GTX的分析中已经检测到C18:1和C18:0的烷基链(图4)，因此排除了GTXorg存在C16:0的烷基链和C18:1或C18:0的酰基链的可能性。

讨论

在我们之前的研究中，我们证实了在热应激[8]下，Mop8成纤维细胞中GlcT基因的表达以一种温度依赖性的方式被激活。这种GlcT基因的激活导致GlcCer的增加，从而导致细胞内癌的减少。小森等．[13]报道称，GlcT在B16黑素瘤细胞内的癌细胞过多时，通过糖基化作用调节其水平。田等．[14]还报道，角化细胞中GlcCer合成的上调可能会保护细胞免受过量Cer的有害影响。在本研究中，通过转染GalT基因将Cer半乳糖基化引入Mop8成纤维细胞后，Cer含量也显著降低(图2)。糖基化和/或半乳糖基化对细胞内Cer的挽救可能会防止应激相关细胞凋亡。另一方面，Beier和Görögh[15]假设，许多癌症表面GalCer的积累可能是由转录性GALC(溶酶体半乳糖脑苷酶)基因抑制所解释的。此外，半乳糖酰神经酰胺的增加本身是乳腺癌细胞[16]的一种促生存机制。然而，还需要进一步的分析来阐明鞘脂代谢的调节与正常细胞和癌细胞凋亡之间的联系。基于cer的治疗方法在癌症治疗中的潜力以及鞘磷脂参与癌症耐药性的研究已经在其他地方得到了很好的综述[17,18]。

在MopGT中检测新表达的甘油型糖脂，并用MALDI-TOF ms分析其分子种类。该糖基甘油脂含有C16:0、C18:0或C18:1的烷基链，而只含有C16:0的酰基链。在我们之前的研究中，我们证实了Mop8细胞中Cer和GlcCer的优势脂肪酸为C16:0[8]。烷基甘油[19]和癌[20]都是在内质网中生物合成的，因此它们的酰基链可能是相同的。由于GTXorg的质谱中几乎没有观察到14 Da(酰基链的羰基与烷基链的亚甲基的差值)较大的分子离子，半乳糖酰二酰基甘油类型可能是MopGT细胞的小半乳糖甘油脂。相比之下，转染脑GalT基因的CHO细胞同时表达半乳糖-烷基酰基和半乳糖-二酰甘油[9]。众所周知，GalT半乳糖酸酯既可降解羟基脂肪酸，也可降解非羟基脂肪酸，这取决于它们在当地的可用性。因此，MopGT中的GalT可能主要利用上述烷基烷基甘油作为前驱物底物。

在我们之前的研究[8]中，我们对Mop8细胞中的GlcCer (d18:1, C16:0)进行了MALDI-TOF MS分析，MS条件与本研究几乎相同。当GTXorg (C16:0, C16:0)(图5C)与GlcCer (d18:1, C16:0)(图5E)进行CID碎片模式比较时，检测到一些相同或可区分的离子。可以理解，相同的离子在m/z 185 (B1)和203 (C1)是由GTXorg (C16:0, C16:0)和GlcCer (d18:1, C16:0)的Hex (Gal或Glc)产生的。相比之下，GTXorg的典型离子(C16:0, C16:0)在m/z 243和499分别来自一个Hex和一部分甘油，以及一个Hex和一部分甘油和一个酰基链(C16:0)。GlcCer (d18:1, C16:0)在m/z 244 (E)和304 (a3 - OH+Na)分别从一个Hex和一个鞘状碱的一部分，以及一个Hex和一个鞘状碱的一部分和一个酰基链(C16:0)中生成典型离子。B1、C1、E和a3是碳水化合物的离子命名及其与Cer的连锁部分[12,21-23]。从技术角度来看，在上述4个片段离子中，m/z 499和304可能有助于GTXorg (C16:0, C16:0)和GlcCer (d18:1, C16:0)的区分。田中等．[12]报道了一系列离子的差异为14 Da (-CH₂-)在[M+Na]的MS/MS分析中观察到来自酰基链和鞘状基的衍生物。⁺Cer和hexer的离子。据报道，这些离子团簇是由电荷远端碎片产生的[24,25]。在GTX和GTXorg中也检测到相应系列的离子(图4B, 5B和5D)。与除Cer外的中性糖鞘脂类似，MALDI-TOF MS结合高能CID对中性糖甘油脂进行分析，也是一种有效的结构信息收集方法。

图5。GTXorg的MALDI-TOF MS分析。(一)GTXorg的MS谱。(B) m/ z739在GTXorg (C16:0烷基，C16:0酰基)中的CID质量破碎。(C) GTXorg的质量碎片分配(m/ z739)。(D) GTXorg (C18:1烷基，C16:0酰基和C18:0烷基，C16:0酰基)m/ z765 -767区CID MS碎片谱。在上面展开的图中，带闭星的质量数(美女百科)来自GTXorg (C18:1烷基，C16:0酰基)。(E)从Mop8细胞(m/z 723)[7]中分配GlcCer (d18:1鞘状基，C16:0酰基)的大量片段。

在动物组织中，糖甘油脂的表达似乎是有限的，其定位可能只在睾丸和神经系统。半乳糖甘油脂主要与大鼠脑内微粒体、髓磷脂和突触囊泡有关。在髓鞘形成活跃时，可以观察到大鼠脑中半乳糖甘油脂浓度的短暂增加，这表明该分子[19]的表达受到发育调控。HT29结肠癌细胞[26]中也检测到半乳糖烷基烯基甘油脂。诱导HT29细胞分化时，半乳糖甘油脂的表达明显减少。这种半乳糖甘油脂表达的缺失表明，甘油脂可能在结肠细胞[26]分化的某些阶段表达。同样，有可能Mop 8成纤维细胞在恶性转化时表达半乳糖烷基烯基甘油脂，但需要更详细的研究来解决这个问题。此外，目前尚不清楚半乳糖烷基烯基甘油是否比GalCer更能作为癌症诊断/预后的标志物。

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