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摘要

我们提出了一个单细胞应用程序来确定PIK3CACTCs突变，揭示了转移性激素受体阳性乳腺癌(HR)患者体内异质性的程度⁺MBC)和高CTC计数(>10 CTC /7.5mL)。我们使用CellSearch和DEPArray从外周血中分离出循环肿瘤细胞(CTCs)和白细胞(wbc)并进行测序PIK3CA外显子9和20通过靶向扩增子测序。对26例CTCs的原发肿瘤(PT, 27例)、循环无细胞DNA (cfDNA, 31例)、单个CTCs (n=146个)和池(n=70个CTC悬浮液，范围为5-120个/悬浮液)和转移瘤/ dtc (n=11例)进行了比较分析。PT突变频繁(15/27(55.5%))，与cfDNA有轻微和实质性的一致性(n=21;kappa=0.14)和ctc (n=22;分别k = 0.6733)。wbc的野生型基因型具有较高的特异性。13/18(72.2%)患者间室一致性，4/18(22.2%)患者时间异质性。CTC分析揭示了突变的同质性和异质性，一些病例显示存在不同的突变型和野生型CTC亚群。此外，8/26例(30.7%)患者检测到独特的双突变CTCs。开发的液体活检提供了对患者内部和内部的洞察PIK3CAHR患者的突变异质性⁺MBC，为更加个性化的药物应用铺平了道路。

关键字

PIK3CA，循环肿瘤细胞，异质性，乳腺癌，液体活检

简介

乳腺癌是一种异质性疾病，特定的基因改变可能与对特定治疗的反应或耐药性有关[1,2]。PI3K-Akt-mTor通路是治疗乳腺癌的有效靶点[3,4]。磷酸肌苷-3激酶(PIK3CA)在25%的乳腺癌患者中发生突变，在激素受体阳性(HR⁺子组(5、6)。螺旋结构域和激酶结构域的热点突变导致组成性酶活性、致瘤性增强和形成异质肿瘤的能力[7-9]。

PTs和转移之间的基因不一致已经被反复观察到，这强调了实时癌症基因和表型分型的必要性。由于对转移性肿瘤中的生物标志物的顺序评估不是常规的，具有循环肿瘤细胞(CTCs)分子特征的实时“液体活检”可能是一种替代方法[10,11]。在局限性和晚期乳腺癌中，CTCs的列举在无进展和总生存[12]方面都证明了临床有效性。此外，这些细胞的分子特征可以帮助识别相关的生物标志物[13-15]。

对患者间异质性的评估可以根据组织学、分子和功能亚型对患者进行有益的分层，但不能预测在任何特定时间点单个患者疾病进展的主要驱动机制。癌症的异质性可以通过早期和晚期疾病分子图谱的差异和细微差异来证明[16,17]。这些观察结果可能部分是因为在原发和/或转移部位出现了不同的肿瘤细胞亚群[18,19]。在临床上，接受治疗时这种亚克隆性发展转化为疾病进展，并被定义为耐药。因此，进展性肿瘤负荷的分子表征和纵向随访是实现个性化医疗的必要前提。这强调了使用ctc作为实时输入材料的液体活检的吸引力，它可以推断潜在的PT和/或转移[20,21]。单细胞测序可以检测到罕见的亚群体，评估治疗期间的遗传异质性水平及其克隆进化[22-24]。

在本研究中，我们利用之前报道的方法通过双向电泳[25]获得单个ctc，并将这些样品置于aPIK3CA大规模并行测序(MPS)的突变分析。我们评估了HR患者PT、cfDNA、CTCs和转移瘤的突变异质性程度⁺MBC。此外，这代表了在常规临床环境中通过液体活检进行CTC突变分析的可行性研究。

材料和方法

细胞培养和血钉实验

质量控制和性能特点PIK3CA通过对乳腺癌细胞株(MCF-7、BT-20、MDA-MB-361、MDA-MB-231和SK-BR-3)[26]的谱线和峰刺实验评价了上述方法的有效性。细胞系在37°C和5% CO的条件下单分子培养₂添加rmi -1640培养基(10% FBS, 1% Glu和1% Anti-Anti) (Invitrogen, BE)。MCF-7、BT-20和SK-BR-3细胞被添加到从健康捐献者(hd)收集的7.5mL血液样本中，并在CellSearch系统(Janssen Diagnostics, LLC, USA)上进行处理。从同一批收获的细胞中，DNA被纯化，作为阳性对照。

患者积累和样本收集

我们总共招募了60名HR患者⁺2011年9月至2014年6月期间，在圣奥古斯丁努斯GZA医院(安特卫普，比利时)肿瘤中心接受治疗。PT和/或转移灶的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织切片取自病理部门。在一个新的治疗方案之前，收集时间匹配的CTC计数血样和血浆。我们还从两名患者中获得了胸膜液(PF)、腹水(A)和/或骨髓(BM)活检，用于分析播散性肿瘤细胞(dtc)。血液样本在CellSave (Janssen Diagnostics)和细胞制备管(CPT, Becton Dickinson)中收集。研究参与者(包括患者和患者)都给予了书面的知情同意。Sint-Augustinus GZA医院的机构审查委员会/独立伦理委员会/研究伦理委员会批准了临床方案。

从FFPE组织切片和血浆中提取DNA

病理学家在FFPE组织切片(5µm)上标记肿瘤丰富区域，人工宏观解剖并收集在1.5 mL Protein LoBind微离心管(Eppendorf, DE)中。根据制造商的说明，使用QIAamp DNA FFPE组织试剂盒(Qiagen, USA)提取DNA。所有血液样本在采集后1小时内处理。在细胞制备管(CPT, BD Biosciences)中收集的血液允许分离血浆和外周血单个核细胞(PBMCs)。使用QIAamp Micro kit (Qiagen, USA)从400 μL血浆中提取cfDNA。纯化后，用Nanodrop分光光度计系统(Nanodrop Technologies, USA)对DNA样品进行定量，并在-20°C保存直到使用。

cellsearch -枚举的CTC囊中单细胞的DEPArray纯化和全基因组扩增

在cellsave收集的样本进行基于epcam的免疫磁性CTC富集，并用CellSearch CTC试剂盒(Janssen Diagnostics, USA)进行计数。枚举的CellSearch墨盒储存在4°C，直到CTC细胞悬浮液被吸入并转移到A300K墨盒中，使用DEPArray系统(Silicon Biosystems, Italy)通过双向电泳分离单个或组细胞，如前面所述[25]。恢复和体积减少后，单个或池的CTCs或白细胞(wbc)， 1ng未扩增基因组DNA (gDNA)作为阳性对照和反应混合水(阴性对照)，使用Ampli1试剂盒(Silicon Biosystems, IT)[27]进行全基因组扩增(WGA)。使用Ampli1 QC4试剂盒(Silicon Biosystems, Bologna, Italy)评估WGA的成功程度。

引物设计和外显子靶向PCR

的MseI在下游的融合引物设计中考虑了限制，这适用于Ampli1全基因组扩增(图1)PIK3CA放大和焦磷酸测序。此外，我们评估了外显子9引物对之间的鉴别能力PIK3CA基因22号染色体上的一个伪基因(NCBI参考序列:NG_027450.1)与>95%序列同源[29]。如表1所示，使用现有的目标特异性序列PIK3CAEx9(28、29)。从FFPE组织切片中提取50纳米克DNA，从血浆中提取2 μL cfDNA，从单个和组deparray纯化细胞中提取1 μL WGA产物，在25 μL的最终体积中进行PCR，其中包含1xFastStart高保真反应缓冲液，1.6和1.4 mM MgCl₂(分别用于Ex9和20)，400 nM hplc纯化的融合引物(IDT Technologies, BE)， 200μM dNTPs, 1.25U FastStart高保真聚合酶(所有罗氏分子系统公司，美国)和PCR级水。程序条件为:95°C 4分钟;随后在95°C 30个周期，61.8或65.6°C 45秒(分别为Ex9和20)，72°C 1分钟;在72°C加热8分钟。PCR扩增子用aggent AMPure XP珠(Beckman Coulter, Spain)按1:6 .6的比例进行纯化，并保存在-20°C下使用。

图1所示。PIK3CA外显子9和20的MseI限制图和454 fusionprimer设计。A) PIK3CA外显子9(染色体3上的gi|383087749|ref|NG_012113.2|:74685-74946智人磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶，催化亚基α (PIK3CA)， RefSeqGene (LRG_310))引物设计，选择靶向特异的反向引物，避免假基因(染色体22上的ref|NG_027450.1|:智人磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶，催化亚基α假基因(LOC100422375)扩增。

表1。引物设计和序列PIK3CA用454 MPS进行突变分析。本序列概述了靶向扩增子测序的fusionprimer设计，包括一个通用(即测序适配器)、多路复用标识符(MID)和目标特异性片段

外显子	链	通用部分	中期段	目标具体细分	参考
9	前轮驱动	CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAG	中1 - 6	AACAGCTCAAAGCAATTTCTACACG	[29]
	牧师	CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAG	中期1 - 8 *	CCATTTTAGCACTTACCTGTGAC	[30]
20.	前轮驱动	CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAG	中1 - 6	AGGAGATGTGTTACAAGGCTTATCTA	454 FusionPrimers (IDT)
	牧师	CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAG	中期1 - 8 *	AATCCATTTTTGTTGTCCAGCC	454 FusionPrimers (IDT)
			中期段
		中期1	ACGAGTGCGT
		中期2	ACGCTCGACA
		中期3	AGACGCACTC
		中期4	AGCACTGTAG
		5年中	ATCAGACACG
		中期6	ATATCGCGAG
		7年中	CGTGTCTCTA
		8年中	CTCGCGTGTC

*由于无法产生PCR扩增子，将MID 4排除在反向引物中。

中期:多路复用标识符,前轮驱动:向前,牧师:反向

tcg: Roche 454测序密钥

PIK3CA454焦磷酸测序的突变筛选

纯化的PCR产物在BioAnalyzer (Agilent Technologies, USA)上测定，稀释至1 × 10⁹分子/µl在1xTE缓冲液中，等量聚集形成PIK3CA1 × 10的扩增子库⁷分子/µl。标记和患者样本的扩增文库进行了15次独立的定向焦磷酸测序。文库的乳剂PCR使用Lib-A钛乳剂PCR (emPCR)试剂盒进行，每个捕获珠输入0.5分子文库DNA。总共有500000个富集珠被装载在钛PicoTiterPlate (PTP)上，并放置在GS Junior仪器中。用钛试剂对文库进行测序，用GS Amplicon Variant Analyzer软件(All Roche Molecular Systems Inc.， USA)中的“fullprocessingamplicon”运行处理器设置执行碱基调用。读取被过滤为混合和点读取，适配器修剪和使用' Both '编码多路复用器去复用。筛选器传递的读取与PIK3CA参考序列(NCBI NG_012113.2)，并与COSMIC和dbSNP数据库进行比较。

统计和性能分析

在参考细胞系模型的血液峰值实验中，真/假阳性和阴性的水平允许计算试验的性能参数PIK3CA单个CTCs的突变检测。变异等位基因频率(VAF)严格度的最佳敏感性和特异性通过诊断奇比[30]进行评估。研究疾病发生之间的一致性和相关性PIK3CA在检测PT、血浆和CTC样本突变时，采用标准的统计分析技术，包括Cohen’s kappa检验(一致性)和Pearson相关系数。双侧P<0.05被认为有统计学意义。所有的统计分析和图形表示均采用SPSS和Microsoft Excel进行。

结果

PIK3CAPCR检测方法的验证和质量保证PIK3CA突变分析

在进行磷酸磷酸测序之前，通过在3730XL ABI DNA测序仪(Applied Biosystems, Foster City, CA)上使用Big Dye terminator V1.1 DNA测序试剂盒对MCF7、BT20和健康供体WBC基因组DNA进行直接测序来验证PCR检测。对外显子9和20进行PCR优化得到的扩增子分别为165bp和301bp。Sanger测序揭示了靶向特异性，并分别从肿瘤细胞系(MCF7和BT20)和健康供体白细胞的基因组DNA中识别出杂合突变(MT)和野生型(WT)序列(图2)。我们对从细胞系(也就是说,BT-20, MDA-MB-361, MDA-MB-231, MCF-7, SK-BR-3)和gDNA来自外部验证的ffpe患者组织切片(n=3)。所有从细胞系样本中进行的技术复制均产生预期结果PIK3CA变异系数在0 - 5,17%之间的突变型。FFPE组织切片的重复分析显示了运行间的重复性和一致性PIK3CA两个外显子的基因型(图3)。

图2。PIK3CA外显子9和20 PCR检测的验证A) PIK3CA的片段分析显示，产生了单克隆PCR片段，外显子9和外显子20分别为165bp和301bp。B)对MCF-7、BT-20和WBC的gDNA进行靶向Sanger测序，揭示了外显子9和20的预期MT和WT序列。L为DNA梯，WBC为白细胞，bp为碱基对，Ref为参考序列。

图3。验证454焦磷酸测序法确定FFPE组织切片基因组DNA中PIK3CA突变。A) GEN-B112的靶向扩增子测序显示9号外显子(上)存在错义E542K, 20号外显子(下)存在同义T1025T突变，分别高于5和10%的变异读取频率。B) 454张图谱通过对外显子9(上)和外显子20(下)的参考碱基和读碱基流的碱基数量的比较分析，证明了提取突变的有效性。C)通过sanger测序对样本B112进行外部质量保证，该样本同时显示E542K(检出限小于5%)和T1025T突变。

单细胞PIK3CA乳腺癌细胞系突变分析

我们通过对供体血液中的肿瘤细胞(tc)进行独立分选实验来评估我们工作流程的性能。在CellSearch枚举后，我们分离单个(n=64)和组(n=9) MCF-7、BT-20和SK-BR-3 tc和wbc (n=64)也就是说,内阴性对照)。打穗和德拉法尔纯化后的TC样品(n=9)每组20个细胞。在WGA上，QC PCR结果显示，92个、2%和60%的单个tc基因组完整性指数(GII, 0-4级)≥1和≥3。ctc和wbc回收池中GII分别为66、67%和83,33%。选择GII≥1的细胞进行下游分析。我们测试了我们的分析区分突变细胞和WT细胞的能力PIK3CAEx9在≥5%的筛选变异读数的灵敏度和特异性分别为85.3%和90%，而Ex20在≥10%的筛选变异读数的灵敏度和特异性最高，分别为71%和100%。使用严格过滤器，我们分析了18个单个tc和2个wbc池，并将其与亲代细胞系的基因组DNA (gDNA)进行了比较。杂合子的WT/MT等位基因频率在DEPArray-recovered池tc中被保留(图5)。单细胞样本(n=54)可以显示出等位基因频率的不平衡。在Ex9和20的7个和5个细胞中分别观察到预期突变等位基因的缺失。在Ex9和20的6个和1个细胞中分别观察到WT等位基因的丢失。检测到2个假阳性E545A (VAF: 100%)错义突变，提示假基因扩增。定性上，单细胞检测分别在Ex9和20中鉴定出29/36(80,5%)和13/18(72,2%)的预期突变。所有SK-BR-3和WBC样品均显示WTPIK3CA基因型。

图4。对阳性测试结果的可变读频率的诊断阈值的评估。A)获得乳腺癌细胞系SK-BR-3、MCF-7和BT-20在交替变读频严格水平(0%、1%、5%、10%、25%、50%)下单细胞(n=54)的突变谱。B)评估不同VR%严格程度的敏感性、特异性、PPV和NPV。C)不同VR%严格程度的诊断优势比。THEO为理论预期剖面，PPV为正预测值，NPV为负预测值。

图5。三种乳腺癌细胞系(BT-20、MCF-7和SK-BR-3)中大块DNA和deparray恢复肿瘤细胞中PIK3CA WT/MT等位基因比例。上面的图表示体DNA和组deray纯化的tc和wbc的WT/MT等位基因频率。下图为全基因组扩增后单个tc的WT/MT等位基因平衡。

患者人群和样本收集

对HR患者进行CTC计数采血⁺MBC (n=60)，在开始新的系统治疗之前。我们定义了38例(38/ 60,63.3%)有5个或更多CTC的队列(表2)。中位CTC计数为29个/7.5 mL, 25个^th和75年^th百分位CTC值分别对应13和182 CTC。高CTC计数与骨转移灶的存在相关(p=0.024484, c²-test)或合并内脏和骨转移(p=0.017163, c²以及)。除CTC活检样本外，本研究还收集了纳入患者的FFPE PT样本(n=27)、转移灶(n=11)和血浆样本(n=31, CTC匹配)(图6)。转移灶包括9个FFPE组织，包括腹部去体积样本(n=1)、BM活检(n=1)、胸膜病变(n=1)、皮肤转移灶(n=2)、骨转移灶(n=1)和淋巴结(n=3)。除腹部病变和一个皮肤病变外，其余均与CTC抽血时间匹配。此外，我们分析了来自两名患者(15个单个样本和11个组样本，共覆盖139个dtc)腹水、胸膜和/或骨髓的deparray纯化dtc。

表2。研究队列的临床、病理和生物学特征(n=60)。报告了所有队列的临床病理数据，并按5个CTC /7.5mL的CTC切断率分层。在治疗特征方面，由于联合治疗方案，总人口的绝对数量(或百分比)可能超过患者总数。

			# ctc / 7,5 mL PB
	总没有。 的患者		＜5		≥5		P
所有的病人	60	100.0%	22	36.7%	38	63.3%
从初次手术到CTC采样的时间间隔
≤5 y	32	53.3%	13	21.7%	19	31.7%
> 5 y	28	46.7%	9	15.0%	19	31.7%
疾病晚期的年龄
平均值±SD (y)	65±13.8
≤50 y	9	15.0%	4	6.7%	5	8.3%
> 50 y	51	85.0%	18	30.0%	33	55.0%
年级(诺丁汉系统)
我,分化良好	9	15.0%	4	6.7%	5	8.3%
二世,中度分化	18	30.0%	7	11.7%	11	18.3%
第三,低分化	22	36.7%	9	15.0%	13	21.7%
未知的	11	18.3%	2	3.3%	9	15.0%
组织学类型
浸润性导管癌(IDC)	44	73.3%	18	30.0%	26	43.3%
浸润性小叶癌(ILC)	12	20.0%	2	3.3%	10	16.7%
这两个	2	3.3%	1	1.7%	1	1.7%
未知的	2	3.3%	1	1.7%	1	1.7%
激素受体状态
ER + / PR + / HER2 +	7	11.7%	3.	5.0%	4	6.7%
ER + / PR + / HER2 -	45	75.0%	16	26.7%	29	48.3%
ER + / PR - / HER2 +	1	1.7%	1	1.7%	0	0.0%
ER + / PR - / HER2 -	6	10.0%	2	3.3%	4	6.7%
ER - / PR + / HER2 -	1	1.7%	0	0.0%	1	1.7%
CTC采样治疗
化疗	27	45.0%	6	10.0%	21	35.0%
激素治疗	26	43.3%	12	20.0%	14	23.3%
靶向治疗	16	26.7%	6	10.0%	10	16.7%
姑息疗法相结合
激素+目标	4	6.7%	1	1.7%	3.	5.0%
化疗+目标	8	13.3%	3.	5.0%	5	8.3%
在CTC采样时开始#治疗线
1	38	63.3%	18	30.0%	20.	33.3%
2	8	13.3%	2	3.3%	6	10.0%
3.	2	3.3%	0	0.0%	2	3.3%
≥4	12	20.0%	2	3.3%	10	16.7%
原发转移部位
发自肺腑的	15	25.0%	10	16.7%	5	8.3%
Non-viscerral	27	45.0%	7	11.7%	20.	33.3%	＊
这两个	16	26.7%	4	6.7%	12	20.0%	**
未知的	2	1.7%	1	1.7%	1	1.7%

* P为二尾卡方检验= 0.024484

** P为二尾卡方检验= 0.017163

图6。研究图:患者登记和临床样本收集。60例(n=60)激素受体阳性乳腺癌患者纳入研究，其中38例ctc超过5 /7.5mL。从后者中，我们收集了早期(如原发性肿瘤)疾病和晚期(如转移性)疾病的临床样本。

CTC分离和全基因组扩增

选取≥10个CTC /7.5mL的CTC墨盒进行脱射线排序。平均样本年龄(也就是说,根据CellSearch枚举和DEPArray分离之间的时间计算)为1.29±0.61年，且与总体WGA成功率无关(图7B)。我们总共分离了249个单个CTC(每个患者平均8个和中位数10个单个CTC回收)，134个CTC池，共覆盖2709个CTC(每个患者平均4个和中位数3个CTC池回收，范围为2-120个CTC /池)和69个WBC回收(5个和64个池，n=20个WBC /池)。在较低的CTC范围内(<250 CTC /7.5 mL)， CellSearch CTC计数与DEPArray检测相关性良好(图8)(Spearman’s rho相关性，n=20, r=0.96, p<0.01)。平均回收率为47%±22%，范围为5.3% ~ 80%(中位数52.2%)。如果计算理论期望值(包括细胞悬浮从CellSearch转移到DEPArray的死亡体积)，平均回收率为70%±35%，范围为7.9% ~ 114%(中位数为80%)。

图7。质量控制评估ampli1扩增标记TC、患者循环(CTC)和播散(DTC)肿瘤细胞和白细胞(WBC)的基因组完整性指数(GII)。A) depararray回收BT20的QC4片段分析的代表性DNA 1000 (Agilent)凝胶电泳图。QC4 POS和QC4 NEG分别表示QC4 PCR阳性和阴性对照，20ng新鲜基因组DNA和分子级水(用于PCR主混合物)。WGA POS QC和NEG QC分别表示Ampli1 WGA程序的阳性和阴性对照样品，即0.5ng新鲜基因组DNA和分子级水(用于WGA母混合)。sCTC为单个离体恢复肿瘤细胞。gWBC和gCTC分别表示白细胞和肿瘤细胞的群体恢复。L表示DNA大小标尺。B) WGA成功率(定义为GII≥1)与样本年龄(n=29)的函数关系。C) WGA在加标乳腺癌细胞(n=3)和患者CTC样本(n=29)中的成功率。D)基因组完整性指数(GII 0(浅色)至GII 4(深色))在单个和组标记肿瘤细胞(TC)、循环肿瘤细胞(CTC)、播散性肿瘤细胞(DTC)和白细胞(WBC)之间的分布。 PB denotes peripheral blood. GII denotes genomic integrity index.

图8。CellSearch和dearray计数实验的相关性。A) CellSearch(绿色)和DEPArray(蓝色)检测到的20例CTCs <250 /7.5mL的患者的CTCs数量。B)观察20例激素受体阳性乳腺癌患者的CellSearch和DEPArray CTC计数的相关性(Spearman’s rho相关系数r = 0.97, P < 0.01)。C) CellSearch和DEPArray计数在<100 CTC范围内，与理论预期的CTC在DEPArray上的计数相比(绿线)。

我们对383例(88.7%)CTC恢复患者进行了340例(也就是说,223单，117池)，54/54 (100%)DTC恢复(24单，29池)和69/69 (100%)WBC恢复(5单，64池)到WGA。我们通过Ampli1 QC4分析deparray恢复细胞的基因组完整性指数(GII)，以确定适合下游分析的单个和组细胞样本。图7给出了一个代表性的WGA质量控制实验的电泳图，其中检测到的扩增子的数量(从0到4)决定了GII值。总体而言，全基因组扩增分别在87%和95%的单个和组CTC样本中成功(定义为在Ampli1 QC4分析中产生至少一个PCR片段)，且与给定样本的年龄无关。基因组完整性指数显示出良好的分布，在单个恢复的CTC患者中，约50% (n=104个CTC)具有GII³3，也就是说,高质量DNA(27)。QC4 PCR片段缺失率为7.8% (5/64);CTCs和dtc分别为13%(29/223)和4.2%(1/24)。从26例患者中，我们选择216个deparray纯化的CTC样本(146个单个样本和70个组样本，共覆盖1036个CTC)用于下游分析。

的评估PIK3CA跨越不同车厢的状态

PIK3CA在足够的覆盖范围内对样本(n=447，包括患者样本、加标肿瘤细胞样本和对照样本)进行大规模并行测序进行突变筛选(图9)。平均产生243.809±50.517个读信号，得到133.270±32.118个过滤读。平均而言，未经过滤的序列库包含12%±5,6%的点读和混合读。在分析的患者样本(n=347)中，发现了2.6% (n=9)和4% (n=14)的缺失PIK3CA分别是9和20号外显子。平均而言(不包括极端测序深度的异常值，见覆盖率>5000)，我们获得的平均折叠覆盖率为1384±788次读取(中位数1274，范围4-5029)和1567±811次读取(中位数1530，范围5-5822)PIK3CA分别是9和20号外显子。

图9。454次焦磷酸测序的测序深度。A)所有测序样本PIK3CA外显子9和20的覆盖深度散点图(n=447)。B)外显子9 (n=333，上)和20 (n=332，下)的患者样本覆盖深度范围。C) PIK3CA Ex9 (n=333)和Ex20 (n=332)的覆盖率分布。D)不同样品类型PIK3CA外显子9和20的覆盖深度。PT为原发肿瘤，NORM为正常(即白细胞)。元表示转移。CTC为循环肿瘤细胞

原发肿瘤突变分析

分析苏木精/伊红染色PT组织切片(n=27, n_艾达= 20 n_伊拉=7)显示平均肿瘤细胞含量(TCC)为58%±21%(中位数50%，范围10%-90%)(图10和11)。我们根据经验将VAF的截断值设为5%±2.5%，假设最终突变具有杂合性，并假设最低TCC=10%，在使用的测序深度下，最终突变的变异读数为20-30。所有PT样品(23个技术重复)在两次独立运行中进行测序。我们描述了一个同义词Q546Q (1638G>A)替换，在2/27例患者中检测到(7.4%，见样本1529和1839)和5个错义替换:P539R (3/27;11.1%), E542K (3/27;11.1%), E545K (18/27;66,7%)，一个以前未知的L997F (2989C>T;2/27;7.4%)和H1047R (7/27;26%)。 Additionally, double hotspot-mutated genotypes were detected in 8/27 (29.6%) patients. We observed how the TCC of a mutant PT correlated (n=16, r=0.5393, p=0.0311) with the VAF of the hotspot mutation (Figure 12).

图10。原发肿瘤FFPE组织切片特征。A)获得原发肿瘤组织的手术或干预类型。B)免疫组化评估原发肿瘤组织中激素受体状态的分布。我表示乳房切除术。TE表示tumorectomy。PT为原发肿瘤。HR为激素受体。ER为雌激素受体。PR为孕激素受体。HER2为人表皮生长因子受体2

图11。在两次独立测序中，PT样本的错义和同义突变的频率图。A)检测到的变量的热图，显示检测到的变量读频率(见色标)，范围从>2%到50%。关于唯一变量，见补充表14。下:PIK3CA状态外显子宽(上)，热点聚焦(下)。B)基于对给定突变所拾取的最大变异读频率，对不同变异读频率截止点(2%、5%和10%)通过的(蓝色)变异数进行评估。C) FFPE原发肿瘤样本(n=27)中突变频率(%)，P539R、E542K、E545K、Q546Q、L997Fn(新)和H1047R是最常见的替换。表示可变读频率。MT为MT, WT为WT, MT≠为技术重复间不一致变量。WT/MT表示技术重复之间的WT或MT基因型。a/b表示独立测序运行I，“分别表示复制1和复制2。

图12。FFPE组织切片肿瘤细胞数与突变频率的相关性。主调的可变读频率(VR%， in %)PIK3CAFFPE原发肿瘤组织切片肿瘤细胞含量(TCC, in %)功能热点突变(n=16)。

15例(15/ 27,55.5%)患者表现出明显的热点突变，在13例选定的患者样本中可重现。大多数突变发生在Ex9(12/15例(80%))或Ex9和20例合并(2/15例(13.3%))。1例患者样本(1/15;6.7%)显示Ex20特异突变(样本2000)。2977例和1839例患者中E545K/H1047R双突变基因型可复制。检测VAFs的变异系数(CV)为2.98% ~ 54.74%。例如，样本3564 (TCC=90%)显示有VAF的E542K错义突变_的意思是= 39.7%和简历_VAF=2.98%，表明TC为同质无性系。然而，一个复制体另外出现了低频率的E545K突变。另外，样本2977 (TCC=85%)与E545K突变(CV_VAF=3.48%)可复制的Ex20 H1047R突变，具有较低和更多的可变VAFs (CV_VAF=44.03%)，这可能表明存在h1047r的亚种群。27个肿瘤中有6个(22.2%)表现为WT基因型(患者3707、2648、3404、3557、2989和3936)，这一结果在5个选定样本中重现。技术复制的MPS也提供了不一致的结果。3个样本(11%)给出了WT或MT基因型(患者2788、3355和3626)，在3/27的样本(患者3068、889和3516)中检测到不可复制的变异(VAF <5%)。

cfDNA在疾病进展中的分析

我们从患者(n=31)和供体(n=5)血浆样本中提取cfDNA。MBC患者的CfDNA产量显著更高(p=0.012)(平均0.665±0.42 ng/μL血浆)，但与CTC数量无关(图13)。在1600x覆盖率下应用2%的VAF截止值，结果表征了28个替换(图14)。31个cfdna中有6个(19.3%)表现为WT基因型(患者889、3301、3495、3713、3754和2749)，在一个选定样本(也就是说,889)。25例患者(25/ 31,80%)发生肝移植PIK3CA基因型。最常见的变异为P539R (n=5/ 31,16.1%)、E542K (n=4/ 31,12.9%)、E545K (n=17/ 31,54.8%)、L1036L (n=5/ 31,16.1%)和H1047R (n=6/ 31,19.4%)。4个内运行cfDNA复制样本(1个健康样本和3个患者样本)复制双MT (E542K/E545K，平均CV)_VAF=14.49%)和WT基因型分别为3564和889例。健康对照(H3)和患者(3470)样本的结果不一致。H3同时携带WT和MT基因型(也就是说,同义S1015S突变(VAF=2.09%))。样品3470生成了可复制的WT Ex9，但Ex20替换不一致。9/31(29%)例患者检出双热点突变基因型。

图13。转移性乳腺癌患者和健康对照组循环游离DNA (cfDNA)的纯化A)健康个体(n=5，平均0.164±0.14 ng/μL血浆)与转移性乳腺癌患者(n=31，平均0.665±0.42 ng/μL血浆)cfDNA产量有显著差异。B) cfDNA产量(ng/μL血浆)与CTC数(N / 7.5 mL血液)之间的相关性，不包括异常值CTC数。

图14。cfDNA样本外显子9和20的错义和同义突变的频率图。A)检测到的变量的热图，显示检测到的变量读频率(见色标)，范围从>2%到>10%。下:PIK3CA状态外显子宽(上)，热点聚焦(下)。关于唯一变量，见补充表15。B)基于给定突变所采集到的最大变异读频率，评估不同变异读频率截止点(2%和5%)通过的(蓝色)变异的数量。C) cfDNA样本(n=31)的突变频率(%)，P539R、E542K、E545K、Q546Q、L1036L(新)和H1047R是最常检测到的取代。表示可变读频率。太表示突变。WT表示野生型。MT≠表示技术重复之间不一致的变量。 WT/MT denotes WT or MT genotypes between technical replicates.

疾病进展过程中CTCs的分析

对26例预后不良、>10CTCs/7.5mL患者纯化的CTCs进行突变分析。汇集的白细胞(在CTC纯化过程中恢复)显示WT序列，表明特异性高。我们从富集的CTC片段中选择了10个CTC和大块DNA池;与患者3466和2000的三个ctc池和PT池一起，在Illumina HiSeq平台上通过全外显子组测序(WES)交叉验证。在3466和2000患者的所有样本中分别检测到一致的E542K和H1047R错义替换(图15)。

图15。在Illumina HiSeq上，通过454靶向扩增子测序和全外显子组测序比较CTC样本的突变状态交叉验证。A)靶向扩增子测序显示外显子20中存在误义H1047R。B) 454张图谱通过比较分析参考碱基数和读碱基数，证明了提取突变的有效性。C)在Illumina HiSeq上交叉验证池CTC样品，重现H1047R错义替换。D)靶向扩增子测序显示9号外显子存在误义E542K。E) 454张图谱通过比较分析参考碱基数和读碱基数之间的碱基数，证明了检测到的突变的有效性。F)在Illumina HiSeq上交叉验证池CTC样品，重现E542K错义替换

4/26(15.4%)患者(3707、1529、3403和3557)的CTCs中均观察到WT状态。其余22/26例(84.6%)患者表现出多种驱动突变和低频率突变(n=34)，以同质和异构的方式发生(图16)。在对所有216个CTC样品进行分组时，我们观察到热点取代基P539R(4.2%)、E542K(12.5%)、E545K(19.9%)和H1047R(1.6%)是最常见的。较少出现的和罕见的PIK3CA变异(n=23/34, 67.6%)是在整体GII较低的单个CTC样本中发生的独特事件。反之，我们观察到三个Ex20取代，这是唯一检测到的池CTC样品。在选定的患者队列中，我们确认了P539R(6/ 26,23.1%)、E542K(6/ 26,23.1%)、E545K(13/ 26,50%)和H1047R(10/ 26,38.5%)错义取代的总体最高突变频率。

图16。CTC样本外显子9和20的错义和同义突变的热图和频率图。A)检测到的变量的热图，显示检测到的变量读频率(见色标)，范围从>5%到>50%。下:PIK3CA状态外显子宽(上)，热点聚焦(下)。关于唯一变量，请参见补充表17。CTC样本还显示其基因组完整性评分(见患者ID下面的配色方案)。蓝色表示GII为4，白色表示GII为3，粉色表示GII为2，红色表示GII为1。B)所有CTC样本中PIK3CA突变频率(n=216)。C)转移性激素受体阳性乳腺癌患者(n=26) CTC区突变频率(%)，P539R、E542K、E545K和H1047R是最常检测到的替换

患者内突变分析显示，WT和MT型CTCs共存，偶尔出现双基因型突变的CTCs。为了探索这种患者内部突变异质性的程度，我们对热点位点进行了深入分析(图17)。我们定义了CTC样本池，包含一个PIK3CA由于临床前性能研究表明MT和WT等位基因扩增不平衡，使得评估组样本中MT细胞的百分比充满了一些不确定性。大多数突变异质性是在单细胞中检测到的。热点基因型允许患者分为4类:WT, MT克隆(也就是说,75%的CTCs有一个热点突变)，MT亚克隆(也就是说,>25%的MT ctc)和混合居群(也就是说,显示WT和MT两种基因型的混合)。热点分析显示，7/26例(26.9%)CTCs均为WT基因型(患者2788、3707、1529、3404、3557、3936和3380)，突变频率为73%。6例患者(6/ 26,23.1%)的CTC显示出整体克隆热点突变人群(患者3564、3466、705、3468、3626和2000)。这些“克隆”样本中的小亚群由CTCs组成，包含WT(4/6例)、不同的热点(1/6例)或双突变(3/6例)基因型。26例患者中有7例(26.9%)有轻度MT亚群(患者388、889、3301、3340、3591、3705和2648)。最后，我们确定了6例(23.1%)具有WT、热点和双突变CTCs混合群体，从而表现出最高程度的突变异质性的患者(患者3355、3470、3546、3439、3057和3516)。8/26例(30.7%)患者检出双突变CTCs。值得注意的是，患者随访数据显示如何存在PIK3CACTCs突变与转移性乳腺癌患者的生存率相关(log rank, p=0.002)，根据患者的肿瘤水平进行分层PIK3CA突变异质性(图18)。

图17。

HR患者CTC区PIK3CA热点突变分析⁺MBC。A) CTC的热点突变谱。深蓝色为组CTC样品。浅蓝色表示单细胞样品。B)PIK3CAHR患者CTC的突变异质性⁺MBC (n = 26)。柱状图上面显示了被计数的(CellSearch)和分析的ctc数量，以及平均基因组完整性指数(GII)。患者被分为WT、MT克隆型、MT亚克隆型或MIX PIK3CA基因型。克隆CTC样本显示75%的>细胞存在热点突变(E542K, E545K或H1047R)。

图18。HR+ MBC患者的总生存率。根据MT或WT PIK3CA基因型(A)和其CTC区异质性水平(B)进行分层:WT (n=7)和MT (n=19)与MIX (n=6)， MT < 25% (n=7)和MT > 75% (n=6)。

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疾病进展阶段的转移分析:

我们从11例患者中收集转移瘤，其中7例FFPE样本作为内循环重复进行分析(图19)。3名患者(3/11;27.3%)表现出清晰的WT基因型，在选定的样品3707和3705中可复制。3936号患者的所有BM和胸膜dtc均表现为WT状态。7/11例(63.6%)患者(样本705、3546、3380、3439、2780、2486和3647)检测到突变基因型，且在突变热点水平上具有可重复性。错义替换E542K(3/ 11,27.3%)和E545K(6/ 11,54.5%)是最常见的检出变异。VAFs的内部运行cv从0.1%到59.2%不等。患者2486的胸膜病变复制样本(TCC>90%)携带CV的E542K错义突变_VAF= 0, 1%。另外，重复分析患者样本2780的LN样本(TCC=85-90%)，总reads中E545K分别为46.37%和19.01% (CV=59.2%)。

图19所示。检测到的变量的热图，用检测到的变量读频率表示。范围:>2% ~ >50%。下:PIK3CA状态外显子宽(上)，热点聚焦(下)。DTC样本还显示其基因组完整性评分(见患者ID上面的配色方案)。蓝色表示GII为4，白色表示GII为3，粉色表示GII为2，红色表示GII为1。B)转移瘤的突变频率(%)(n=11)， E542K和E545K是最常检测到的替换。表示可变读频率。MT为MT, WT为WT, MT≠为技术重复间不一致变量。WT/MT表示技术重复之间的WT或MT基因型。

的比较分析PIK3CA突变状态

的评估PIK3CA在不同的隔室中进行突变状态，以便进行比较分析(图20)。重点关注已验证的突变热点(P539R, E542K, E54K和H1047R)PIK3CAPT、cfDNA或CTC检测分别为21例和22例。7例和10例患者的转移灶和CTCs和cfDNA的时间匹配比较是可能的。通过关注突变热点来确定各部门之间的一致性水平(图21)。PT组织的MT或WT状态与cfDNA有轻微和实质性的一致(n=21;33%的差距;k=0.14)和ctc (n=22;14%的差距;分别k = 0.6733)。比较CTCs和时间匹配的cfDNA样本显示轻微的一致性(n=22;36%的差距; k=0.0833). When comparing CTCs and metastases, a proper agreement was observed (n=7; 29% disparity, k=0.4167).

图20。的比较分析PIK3CA原发肿瘤、血浆、CTCs和转移瘤的基因型和VAFs。PIK3CAex9和20个HR患者不同隔室的突变热图⁺MBC。ex9和20框中从浅到深红色的颜色梯度分别表示特定替换的低(2)和高(>80%)VAFs。CTC和DTC样本上面的色标(用带虚线边框的方框对每个患者进行分组)表示基因组完整性指数(GII)，由Ampli1 QC4分析确定(红色:GII1;粉色:GII2;白色:GII3，蓝色:GII4)。底部柱状图表示在分析的患者样本中检测到的最大VAF，并显示(与PT和血浆相比)在分析纯化的CTC时，给定突变的VAF增强。PT为原发肿瘤，CTC为循环肿瘤细胞，META为转移灶，VAF为变异等位基因频率。(*)表示由多个细胞组成的组CTC/DTC样本。(**) 42个转移瘤样本包括FFPE组织(n=9例)和来自2例患者(15个单个样本和11个组样本，共覆盖139个dtc)的deparray纯化播散性肿瘤细胞(dtc)。

图21。的比较分析PIK3CAPT、血浆、CTCs和转移瘤的基因型。A) HR患者不同间室热点位点PIK3CA突变谱⁺MBC (n = 38)。从黄到红的颜色梯度分别表示低(2-10%)和高(85%)VAFs。(y)表示患者编号3754PIK3CACTC或cfDNA的突变状态以及相应的PTs和转移病灶。k表示Cohen Kappa统计量

PIK3CA18例患者的PT、cfDNA和CTCs数据均可用。本组有12例患者PIK3CAPT的畸变，在3例(3/ 12,25%)血浆源性cfDNA中未检测到，而相应的CTCs显示了预期的突变(患者3301、889和3470)。值得一提的是，患者3301和3470的cfDNA样本确实携带了预期的突变，但低于所选的VAF严格水平。在3/18可评估患者(16.7%)中检测到cfDNA突变，而在PT和匹配的CTCs中未检测到任何畸变(患者3404、2788和3936)。患者3936的其他骨髓和胸膜dtc也显示为WT基因型。一个太PIK3CA在11/18(61.1%)样本中观察到所有隔室(PT、cfDNA和CTCs)的状态。在cfDNA和CTC样本旁分析转移病灶的6例病例中，结果一致PIK3CA观察三个病例的状态。3380例和3546例的CTCs和cfDNA样品分别遗漏了MT基因型，而MT基因型出现在各自的转移中。在3705例患者中，转移灶的WT状态在携带突变的CTCs和cfDNA中没有重现。总的来说，在四个病例(1529、2139、2648和3516例)中观察到早期和晚期疾病之间的突变不一致。在2例患者中观察到突变的增加，患者2648的cfDNA证实了这一点。

在两种情况下，ctc能够解剖PT或cfDNA中观察到的热点突变的突变异质性。在3564例患者中，我们注意到PT重复分析显示E542K (VAF=38.85%)或E542K (VAF=40.52%)伴低频率E545K (VAF=2.94%)突变。cfDNA重复分析重现双突变基因型(VAFs>5%)。对CTC样本的分析显示，总体上e542k突变人群均质，其中一个CTC携带双突变基因型。3470例患者的PT显示E545K (VAF=38.85%)或E545K (VAF=29.45%)伴低频率H1047R (VAF=3.36%)突变。这些畸变出现在一个重复的cfDNA样本中。单个和两个ctc池显示存在相互排斥的E545K和h1047r阳性亚群。此外，我们还发现了一株携带双突变E545K/H1047R基因型的CTC。

讨论

我们提出了一个深入的验证，可行性评估和临床应用PIK3CAHR患者原发肿瘤、CTCs、cfDNA和转移的突变检测⁺MBC。所有分析的转移瘤样本(包括组织和播散性肿瘤细胞积液)均与CTC抽血时间匹配，腹部病变和一个皮肤病变除外。我们之前报道了使用CellSearch和DEPArray来获得纯CTCs (CellSearch to DEPArray恢复效率为62±12%)，用于单细胞水平的分子表征，并证明了其在不同癌症中的适用性[13,25,27,31-34]。使用fda批准的CellSearch CTC计数已证明其可作为临床预后生物标志物。然而，该技术是基于EpCAM的积极选择⁺这些细胞可能错过了经历上皮-间质转化(EMT)的肿瘤细胞。最近，Sawada等人演示了一种新型的独立于标记的流体装置的捕获和枚举效率的增强，与CellSearch相比。在患者样本中，他们的平台检测到的CTCs明显多于CellSearch，其中9例检测到CTCs，根据CellSearch[49]，这些CTCs均为阴性。探索PIK3CA通过标记独立技术获得的CTCs的突变异质性将是本研究的一个逻辑延伸。

我们从理论上计算，一个含有5个ctc的CellSearch盒将允许我们在DEPArray上最小限度地恢复2个和最大限度地恢复4个ctc。然而，由于样本年龄和性质的变化，考虑到7.8%的加标单细胞的WGA不成功，我们通过经验选择了一个有10个以上CTCs的患者子集，对至少1-2个细胞进行分析。在我们的60例HR+ MBC患者队列中，29例患者(约占总人口的50%)ctc等于或超过10个/7.5mL。我们选择了26例患者PIK3CA突变分析在谁是可行的确定PIK3CA状态在至少一个CTC中。对ctc进行MPSPIK3CAEx9和20在WGA后，使用特定的Ex9反向引物，避免了假基因[29]的扩增。在本研究中，我们确定了VAF严格过滤器的基本原理，用于分析来自单个ctc的NGS数据。通过刺突乳腺癌细胞，携带杂合子PIK3CA突变，并将这些细胞进行CTC富集、纯化和WGA的相同流程，通过计算不同VAF截止水平的敏感性和特异性，我们确定了热点变异的可靠定性评估VAF截止值。来自尖化tc的单细胞数据显示，与新鲜gDNA相比，WT/MT等位基因不平衡，这在CTCs池中也被注意到，尽管程度较轻。我们工作流程的目标是评估一个样本是否存在PIK3CA突变。我们报告了在小细胞池或单细胞水平上进行突变分析时，检测到的变异等位基因频率的不平衡。这种不平衡的起源不确定，但可能追溯到操作步骤，包括细胞固定，渗透和染色过程。此外，CellSearch细胞盒平均在4℃下储存1.5年，随后细胞进行介电电泳和下游WGA，由于上述所有原因，可能会导致偏置。Gash和他的同事在最近的报告中也描述了这一观察结果。无论使用哪种WGA方法，在分析的CTCs[48]的一个子集中都注意到一个等位基因的优先扩增。由于PT、转移瘤和cfDNA样本与纯化的CTCs相比具有可变性，有时TCC较低，我们基于所进行的测序实验的覆盖深度，经验地定义了这些基质的VAF截止值。此外，我们需要强调的是，在分析cfDNA样本时，我们没有纠正样本之间来自溶解的白细胞的WT cfDNA，这可能导致PT/CTC和cfDNA之间的一致性较差。

除了热点，我们还发现了其他PIK3CA编码序列中的突变。这些低频率和罕见的取代在独特的样品中被检测到，在某些情况下可能具有功能获得活性[35,36]。我们强调了pfa固定细胞和组织的性质，这可能会影响DNA质量，导致固定偏差和随后的测序错误[37]。因此，这就提出了技术错误导致的错误发现问题。因此，缺乏验证或可重复性使得这些罕见变异的有效性存在不确定性。这样就不清楚为什么在一些重复的原发肿瘤样本中存在变异。在测序实验中，我们偶尔进行无模板对照(H₂O用于生成PIK3CA测序库)，它不提供任何DNA序列。此外，内部阴性对照样本(也就是说,患者wbc与ctc共纯化)显示为野生型PIK3CA所有情况下的基因型。然而，我们注意到这些不一致的结果是如何在原发肿瘤样本的测序过程中获得的，该测序是在两个独立的序列运行中执行的，其中一个序列运行只提供单向读取，而不是双向覆盖的目标外显子，这可能形成了观察到的不一致结果的基础。相反，我们验证了我们的方法，通过不同的方法检测和复制热点P539R, E542K, E545K和H1047R突变。我们分析了几种乳腺癌细胞系，其中含有已知的PIK3CAWT或MT状态，在大体积和单细胞水平。我们复制了FFPE肿瘤组织切片的突变状态，该切片由外部实验室报道，携带两种不同的PIK3CA最后，我们通过全外显子组测序(WES)对所选患者CTC样本的所得结果进行交叉验证。此外，为了验证非热点突变的体细胞性质，我们从白细胞池中对种系DNA进行了测序，包括在试验验证和患者分析阶段。在这里，所有WBC样本都生成野生型PIK3CA基因型，这可以表明真正的体细胞性质的非热点拾取的变种。

我们选择PIK3CA因为它是HR中最常见的突变癌基因⁺据报道，高达40%的乳腺癌患者[38]发生突变。超过80%的这些改变发生在螺旋结构域(Ex9)和激酶结构域(Ex20)[39]。我们选择通过对转移性乳腺癌患者实时液体活检的单个CTCs进行分析，研究这些热点位点的突变异质性。CTC分析显示突变PIK3CA21/26(80%)患者的基因型，而之前的研究报道的突变频率为15%到37%[27,33,40-42]。这种较高的比率可以部分解释为选择纯HR⁺MBC队列，CTC计数>10 CTC /7.5mL。这导致了对147个单一和多个ctc池的查询，覆盖了来自26名患者的1036个ctc。增加的CTC样本量可能提高了我们检测低频率MT细胞的灵敏度。

的概念PIK3CA其他研究小组已经描述了转移性乳腺癌中的突变异质性，观察到不同水平的患者内部异质性[27,33,40-42]。我们对患者进行了突变分析，所有患者在诊断时均为HR+亚型，抽血时均为晚期疾病，使其成为一个更加同质的目标人群。此外，我们想指出的是，通过对单个循环肿瘤细胞与原发肿瘤、循环细胞游离DNA、组织和DTC转移的比较分析，我们是第一批证明mBC患者内部异质性解剖能力的科学家之一。最近，Gash等人观察到与本研究相似的突变模式，有4例患者同时具有这两种突变模式PIK3CA野生型和突变亚群。总之，研究人员得出的结论是突变异质性是频繁的，正如我们目前的研究[48]的情况。此外,不同的PIK3CA从同一患者不同步采集的血液样本中检测到突变。在我们的研究中，在4例患者中观察到时间异质性，在2例患者中检测到突变的增加。在对异步收集的患者样本进行比较的研究中也观察到这一点，发现7%至40%的病例存在突变不一致性[43-45]。除了时间上的差异外，单个的、同步收集的CTCs之间存在突变异质性，这些CTCs具有不同的突变甚至双突变和WT基因型。有趣的是，据报道，突变不一致可能发生在CTC样本中，从一个特定的患者内的临时匹配的血液样本，表明一个人需要如何接近PIK3CA慎用单次抽血进行突变分析[40,41]。我们报告如何PIK3CA在同步收集的ctc中，突变是频繁的，可能以同质或异质的方式发生。然而，分析的患者数量相对较少，限制了在原发肿瘤、CTC、ctDNA和转移病灶之间的突变发生率和突变不一致频率方面得出强有力结论的可能性。因此，观察到的异质性程度强调，需要通过更大的前瞻性临床研究，在转移性背景下进行深入的单一和联合CTC分析。

单细胞分析允许识别小的CTC亚群。除了热点和罕见PIK3CA改变，我们还观察到患者样本在热点位点内含有双突变基因型。这些事件是罕见的，但表明异质性的性质PIK3CA致癌基因(46、47)。在这里，我们观察到两例PT和血浆样本的分子异质性通过单一和合并CTC分析进行解剖。我们确定了一个有双基因的CTC群体是如何突变的PIK3CA或者包含一个突变的异质CTC亚群可以相邻共存。因此，探索PIK3CA突变异质性证明了在一个给定的PT小体中PIK3CA可以存在MT亚克隆，在疾病的晚期可以在循环中检测到。对少量ctc或单细胞水平的分析使我们能够证明这些独立亚种群的存在。我们的研究提供了一个洞察复杂性的突变异质性PIK3CA在乳腺癌晚期我们观察到如何的存在PIK3CACTCs突变与HR患者的生存率无关⁺MBC，这与之前报道的结果[42]形成对比。有趣的是，我们确实观察到了克隆的存在PIK3CACTCs突变与较差的生存率相关。

我们提供了一个有效的和敏感的MPS方法来确定PIK3CACTCs突变，允许研究突变异质性。所提出的液体活检可以在多个单一的ctc池中进行高通量的100%纯度，从一个或多个血液样本，使其适合在诊断设置中使用。我们提供了支持性的证据PIK3CA热点突变经常出现在HR患者的epcam阳性CTCs中⁺MBC和可能以同质或异质的方式发生，这需要通过更大的前瞻性临床研究来验证。

在比较早期和晚期疾病时，除了突变异质性外，我们还观察到时间不一致性。使用我们的方法，测序深度和VAF严格水平，CTCs的突变分析可能与来自血浆的cfDNA样本更好地相似于原发性和转移性肿瘤组织切片。然而，我们确实强调我们cfDNA样本的测序深度和高VAF截止水平。尽管如此，使用平均测序深度1600x和VAF截止2%允许我们检测PIK3CA晚期MBC患者血浆中的热点突变在67%的病例中与PT结果一致。低样本输入、测序深度和严格的VAF过滤可能是观察到的不一致的基础。然而，我们想强调的是，我们针对的是晚期转移性疾病患者群体，具有高循环肿瘤负担，在这些患者中，也许较低的测序深度足以检测克隆驱动突变，如PIK3CA致癌基因。总之，该研究提出了利用液体活检在单细胞水平，解剖PIK3CA个体患者血管内腔内的突变异质性，从而为液体活检模型作为个性化医疗的一部分在转移性癌症患者的管理中成功实施铺平了道路。

致谢

这项工作得到了比利时抗癌基金会的支持。我们感谢Op de Beeck博士在检测开发阶段提供Sanger测序服务，感谢Denkert Carsten博士提供参考FFPE肿瘤组织切片。我们感谢Diana Cunati和Elena Peruzzi(均来自意大利博洛尼亚Silicon Biosystems)对协议和DEPArray系统操作的帮助。

给予的支持

我们感谢比利时抗癌基金会(Leuvensesteenweg 479, B-1030 Brussels, Belgium) 2012转化与临床研究基金(LD, SVL, BDL)的财政支持。

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