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摘要

骨再生是再生医学面临的最重要挑战之一。在上颌面区，牙槽嵴骨吸收发生在拔牙后，导致康复治疗的一些风险，包括种植牙程序。我们的研究目的是证明一种名为Rigenera的骨组织工程创新临床方案的有效性，旨在创建和优化由胶原生物材料和人类自体骨膜衍生的微移植物组成的生物复合物。我们评估了这些生物复合物预防牙槽嵴骨吸收的能力，并对新形成的骨组织进行组织学评估。我们证明，与单纯的胶原蛋白相比，自体生物复合物显著降低了牙槽嵴水平和垂直维度的骨吸收。我们还表明，这些生物复合物加速骨化过程，在治疗后45天后触发新骨组织的形成，并在60天后增加钙化基质，对于胶原蛋白，直到120天。总之，这些数据显示了由骨膜衍生的微移植物和胶原蛋白组成的生物复合物在牙槽嵴保存中的效果，通过减少骨吸收和增强新骨组织的形成。

关键字

自体，骨，微移植物，骨膜，再生，干细胞

简介

骨再生代表了当今再生医学和颅面再生领域的一个重要挑战。特别是，在种植牙过程中，拔牙后骨吸收导致牙槽嵴缺损，进而导致牙槽嵴[2]发生显著尺寸变化，从而限制了种植牙的放置。这导致牙槽嵴的高度和宽度减少，用于种植体放置的剩余骨数量减少。因此，牙槽嵴保存(ARP)是当代临床牙科的一个关键步骤。拔牙后可采用多种临床技术和骨替代材料填充牙槽。对于所有这些，目的是保持拔牙的骨窝的形状和大小，以便种植体的位置[3]。骨再生是一个复杂的过程，需要特定细胞的迁移和增殖到愈合区域，以便为新组织的生长提供生物基质。虽然调节骨再生过程的确切机制尚不清楚，但已经提出了几种可预测骨重建的方法。关于牙槽窝的保存，常用的移植材料包括特异性自体、异体移植物、异体移植物或同种异体质体切片[5]。自体骨的使用被认为是黄金标准在骨再生;然而，由于在口腔内收集的骨量较少，以及从口腔外部位(如髂骨、颅骨等)收集的术后发病率和再吸收，该方法存在局限性[6-7]。另外，其他的嫁接材料也显示出一些限制，如缺乏由异体移植物、异种移植物和同种异体质体携带的活细胞群，这只决定了骨传导性能[5]。为了克服这些限制，在颌面重建的不同领域中，使用载体中包含的生长因子，通过基因治疗刺激生长因子的选择性生产，以及提供扩展细胞结构。另一方面，使用间充质干细胞(MSCs)是一种很有前途的方法，特别是在口腔骨再生方面，因为这些细胞也在牙区、牙髓的血管周围龛和牙周韧带[9]中被发现。

骨膜是覆盖在骨骼上的一层薄薄的纤维层，为多能细胞提供了一个生态位，也是调节细胞行为的分子因子的来源。骨膜源性祖细胞(PDPCs)在软骨再生、骨愈合和口腔颌面组织工程[10]等方面有着广泛的临床应用。

目前的研究集中在基于Rigenera协议的可植入生物相容性材料与微移植技术相结合的颅面组织再生、修复和重建。特别是，我们证明了由骨膜来源的自体微移植物和胶原蛋白组成的生物复合物在拔牙后的牙槽嵴保存中的有效性，而不是单纯的胶原蛋白。

患者和方法

病人

我们的方案得到了帕维亚大学伦理委员会的批准(2014年3月31日正式提交)，共有35名患者(21名女性和14名男性)参与了这项研究，年龄从25岁到64岁，正在接受牙周病治疗。参与者的合格标准和设置如下:需要拔除2颗多根牙，具有密切可比的条件和适应证，进行种植体支持假体;没有系统性疾病;未怀孕(女性);没有常规药物使用。通过病史筛查，所有患者身体健康，无潜在系统性疾病。在进入研究之前，患者被告知调查的性质，并签署了知情同意书。所有患者均接受基础牙周治疗，口腔卫生良好。如果脓肿存在，在拔牙前2周给予全身抗生素治疗。患者的一颗牙被安排作为测试地点，另一颗作为对照地点。 In order to perform the socket preservation, in the test site we grafted bio-complexes composed by biomaterial (collagen) and periosteum-derived micro-grafts, while in the control site we used only the biomaterial (collagen).

患者术前一周接受专业口腔卫生检查。然后指导他们正确进行口腔卫生，包括在刷牙后用0.2%洗己泰(CHX)漱口，每天两次，直到手术完成。

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采用Rigenera协议采集自体微移植物

为了分解骨膜样本，我们使用了一种名为Rigeneracons (Human Brain Wave srl，都灵，意大利)的一次性医疗设备，这是一种人类结缔组织的生物干扰剂，能够过滤和选择50微米大小的前体细胞。该装置允许获得自体微移植物，无需大量操作，即可以安全、简单的方式使用。每个设备都有一个带有100个夸张孔的网格，每一个孔都被六片用于有效切割软硬组织的微型刀片包围。简单地说，我们收集了一小块组织(1-2毫米到10mm)，用1ml生理溶液插入Rigeneracons装置(图1A和1B)。在此之后，我们将组织分解，将过滤器插入Rigenera机器中，通过旋转(75 r/min和15 Ncm)激活中断。2分钟后，用注射器使用专用孔收集微移植物悬浮液(图1C)。用细胞悬浮液浸泡胶原蛋白海绵10分钟，以构建生物复合物，并直接移植到牙槽窝上(图1D)。

图1所示。Rigenera协议的示意图。(A)收集1-2毫米至10mm的骨膜样本;(B)将骨膜样本插入Rigeneracons医疗一次性用品中，加入1ml生理溶液。然后将Rigeneracons插入到Rigenera机器中以激活中断(75 r/min和15 Ncm)。(C)使用专用孔的注射器收集含有自体骨膜衍生微移植物的细胞悬液。(D)将胶原蛋白海绵与微移植物浸泡8-10分钟，形成生物复合物(试验部位)。

手术及嫁接程序

在这项研究中，8个不同临床中心的8名不同的手术人员进行了手术。局部麻醉后，拔除了牙齿。彻底清除窝口以去除肉芽组织。采用测量方法评估愈合过程后的吸收情况。使用探针，我们确定了水平和垂直的尺寸，测量前庭和舌皮质之间的空间，并参考颈部的松驰牙齿线，分别位于手术位点前后。用树脂夹具记录观察点。拔牙后，在附近的位置收集一小块骨膜样本，将上述获得的自体微移植物用注射器轻轻地固定在胶原海绵支架上(Gingistat, Vebas, San Giuliano Milanese, Italy)，放置8-10分钟后再进行移植物。在植骨手术前，为了获得一个只有一个腔的大牙槽缺损，移除牙槽内骨间隔，然后将生物复合体移植到该部位。海绵/微移植物复合物用于填充试验(T)部位提取过程中留下的空间，而不含微移植物的海绵用于填充对照(C)部位，以实现血块自然愈合。T和C部位的皮瓣都进行了缝合，没有试图实现手术伤口的初步闭合。

患者用0.2%的氯己啶醋酸盐冲洗，每日2次，持续2周。拔牙后1周拆除缝合线。不使用抗生素治疗，术后疼痛只建议使用镇痛治疗。

Post-surgicalevaluation的病人

进行了临床和放射学控制。第一次对照安排在术后第7天，拆除缝合线，用rinn准直仪行根尖周x光检查。水肿、炎症和功能也进行了临床评估。在取出后45天至90天在T和C位置安装夹具。在局部麻醉和抬高全层颊和舌皮瓣后，以与基线临床检查中描述的类似的方式重复新的测量。记录三个标志距夹具的距离和牙槽嵴新定位的位置。然后这些孔被扩大和加深，以允许内质植入物的插入。

组织学分析

使用内径为3mm、长度至少为6mm的手术用环形钻从已有的关节窝的中心部分采集骨样本。然后，这些孔被精炼以接受内腔植入物。所有样本分别于45、60、90和120天从对照组和试验点(分别为单独胶原蛋白和胶原蛋白加微移植物)采集。骨芯立即在10%福尔马林中固定，在EDTA溶液中脱钙(Osteodec, Bio-Optica, Mian, Italy)和石蜡包埋。使用microtome (Leica Biosystem, Milan, Italy)制备5个m厚切片，并安装在镀膜玻片上。随后，切片在二甲苯中脱蜡，浸泡在浓度降低的乙醇中，并在水中再水化。最后，切片用苏木精和伊红染色进行组织学评估，以确定新的牙周形成。

统计分析

术后测量的统计分析采用双侧Student t检验，考虑显著性P值≤0.05。所有分析均使用GraphPad 5.0软件(圣地亚哥，加州)进行。

结果

我们的数据显示了正常愈合和在牙槽窝中应用微型移植之间的差异。从临床角度来看，拔牙后所有T和C位点的愈合都很顺利。拔牙后一周，T组和C组拔牙窝周围软组织的临床表现相似。2周后，T组和C组牙窝均被软组织覆盖。两组术后时间基本相同。7名受试者在前2天仅使用少量镇痛支持剂。最有趣的数据是第二期手术时的手术测量，结果显示实验组(T)的整体牙槽嵴吸收明显低于对照组(C)。事实上，T位水平吸收比C位低38.3%(图2A)，而T位垂直吸收比C位低36.5%(图2B)。

图2。在样本采集过程中测量测试部位和对照部位的牙槽嵴水平(A)和垂直尺寸(B)。水平和垂直尺寸分别测量前庭和舌皮质之间的空间，并参照松脱牙颈线，分别位于手术部位前后。用树脂夹具记录观察点。图中显示了试验部位(含胶原蛋白的微移植物)相对于对照部位(仅含胶原蛋白)的骨吸收明显减少(***P≤0.001试验部位相对于对照部位，使用Graphpad 5.0软件进行T检验分析计算)。

我们进一步评估了治疗后45、60、90、120天用环钻采集的标本的组织学切片。单纯用胶原蛋白处理与用胶原蛋白处理的骨膜源性微移植物比较，试验组骨化过程各点均明显快于对照组。特别是45 d时，对照组出现炎症细胞，未见骨形成。相反，试验组在45 d时已经出现骨形成，60、90和120 d时钙化基质较对照组增加，而对照组的有机基质更为明显(图3)。

图3。对治疗后45、60、90和120天从试验和对照地点收集的核心骨切片进行组织学评价。切片用苏木精和伊红染色，根据患者的适当切片和方法进行染色。白色箭头为钙化基质，黑色箭头为有机基质。对比单纯胶原蛋白处理(对照组)和胶原蛋白骨膜源性微移植物处理(试验)的结果表明，试验组骨化过程在各个点上都比对照组快得多。

讨论

牙槽窝或牙槽嵴保存被定义为在拔牙后阻止或减少牙槽嵴吸收的过程，以备将来的治疗，包括种植体的放置，但需要对其有效性进行评估。最近的一篇文献综述[5]报道了有限的临床证据表明，与用于种植体放置的简单拔牙不保存处理相比，牙槽保存可以减少骨丢失，也没有令人信服的证据表明用于牙槽保存的不同材料和屏障之间有显著差异[5]。应该强调的是，有几种arp技术，包括使用或不使用膜放置不同的移植材料，以保存和减少骨吸收[11-12]。在本研究中，我们发现与胶原蛋白相比，自体骨膜衍生的胶原蛋白微移植物在保持水平和垂直尺寸方面更有效，我们用组织学分析对获得的骨再生进行了挑战。微型植牙的功效已经在牙科领域得到证实，有报道称，它可以增强牙周组织再生[13]和萎缩上颌骨[14]的骨再生。也有报道称，牙髓来源的微型移植物可以有效地修复人类下颌骨缺损[15]，并促进慢性牙周炎患者[16]的非包涵性骨内缺损的闭合。

自体微移植物在术后复杂创面[17]、创伤后病变[18]和病理性疤痕[19]的愈合等其他临床应用中也有报道。自体移植无疑是更好的选择，尽管它们在组织牺牲和供区发病率方面有一定的限制[6-7]。此外，自体移植物的一个关键问题是细胞和组织活力在收集后急剧下降，降低了自体移植物的再生能力[6-7]。细胞死亡是由于血管中断和随之而来的组织供给量减少，但也由于移植物的尺寸减小，骨组织碎裂成小颗粒或碎片，使骨组织碎片与生物液体之间有更多接触，细胞死亡问题仍然存在。

在本研究中，我们从骨膜样本中获得了通过Rigenera协议分离的自体微移植物，我们先前证明了这些微移植物既保持了较高的细胞活力，又对CD73、CD90、CD105[20]等干细胞标记物具有高阳性。此外，也有报道称，人骨膜细胞保持自我承诺成骨的特性，代表了颌骨-面部组织工程ap的创新干细胞来源皱纹[21]。

到目前为止，在临床医学中，利用组织再生潜力的唯一方法是通过移植手术，将基质、细胞和因子从健康的生态位移动到损伤的生态位。Rigenera协议是通过CE I类创新医疗设备Rigeneracons获得的自体微移植物实现人体组织临床再生的一种新方法。本方案的目标是在无菌悬浮液中进行特定过滤(在过程结束时可自行使用)后，或在与生物材料混合后进行生物复合物移植(如已报道的[18])后，帮助收集可存活的祖细胞。

可用于种植体的骨的质量和数量对于种植体存活的可预测性和其长期稳定性的维持都是至关重要的。在牙槽嵴骨体积不足或颌骨间垂直、水平或矢状关系不佳的情况下，可能需要额外的外科手术来重建和增加[22]缺损。因此，牙槽嵴已被广泛应用于骨的增强，使水平和垂直体积损失最小化，并在拔牙后最大限度地形成新骨。这种方法在技术上是相当敏感的，然而它需要特殊的手术技巧，对病人来说是昂贵的，并有潜在的危险，有伤口感染和排斥的风险。Cardaropoliet al。(2012)报道用骨移植物填充牙槽窝是减少牙槽嵴吸收的有效方法，因为骨移植物保持了牙槽嵴的垂直和水平尺寸[24]。另一方面，在这项研究中，我们发现应用胶原蛋白的微移植物显著地阻止了相对于单独胶原蛋白的脊的垂直和水平尺寸的减小。此外，组织学分析表明，与对照组相比，在45 d时，与胶原蛋白相结合的微移植物加速了试验组的骨化过程，钙化基质增加。因此，Rigenera协议促进和加速新骨组织的形成。

总之，我们的数据报道了来自骨膜样本的自体微移植物在减少牙槽嵴骨吸收方面的效果，表明这可能是一种保存牙槽嵴的最佳方法。

的利益冲突

作者aquino R、Trovato L和Graziano A是人类脑电波医学和科学部门的组成部分，该公司开发了Rigenera协议和Rigeneracons一次性设备。

参考文献

1. Pagni G, Kaigler D, Rasperini G, Avila-Ortiz G, Bartel R，等(2012)骨修复细胞在颅面再生中的作用。药物输送64: 1310 - 1319。(Crossref)
2. Avila-Ortiz G, Elangovan S, Kramer KW, Blanchette D, Dawson DV(2014)拔牙后牙槽嵴保存的效果:系统综述和meta分析。J削弱Res93: 950 - 958。(Crossref)
3. 达比，陈ST, Buser D(2009)种植体治疗中脊保存技术。口腔颌面种植体24增刊:260 - 271。(Crossref)
4. Dimitriou R, Jones E, McGonagle D, Giannoudis PV(2011)骨再生:当前概念和未来方向。BMC医学9: 66。(Crossref)
5. Atieh MA, Alsabeeha NH, Payne AG, Duncan W, Faggion CM，等(2015)缺失牙的置换干预:种植体发育的牙槽嵴保存技术。Cochrane数据库系统版本5: CD010176。(Crossref)
6. Nkenke E, Weisbach V, Winckler E, Kessler P, schultz - mosgau S，等(2004)髂嵴骨移植用于假体前增强手术的发病率:一项前瞻性研究。口腔颌面外科33: 157 - 163。(Crossref)
7. Barone A, Ricci M, Mangano F, Covani U(2011)髂骨收集治疗上颌和下颌萎缩的相关发病率:10年分析。J口服MaxillofacSurg69: 2298 - 2304。(Crossref)
8. Padial-Molina M, Rios HF(2014)牙周工程的干细胞、支架和基因治疗。现时口腔健康报告1:16-25
9. Shi S, Bartold PM, Miura M, Seo BM, Robey PG，等(2005)间充质干细胞在牙齿结构再生和修复中的作用。OrthodCraniofac Res8: 191 - 199。(Crossref)
10. Ferretti C, Mattioli-Belmonte M(2014)骨膜衍生干细胞用于再生医学的建议:提高当前的知识。世界J干细胞6:266 - 277。(Crossref)
11. Hämmerle CH, Araújo MG, Simion M;骨科学共识小组2011(2012)关于拔牙窝生物学和治疗的循证知识。临床口腔植入物保留区23增刊5:80-82。(Crossref)
12. Vignoletti F, Matesanz P, Rodrigo D, Figuero E, Martin C，等(2012)拔牙后牙嵴保存的手术方案。系统回顾。临床口腔植入物保留区23补充5:22-38。(Crossref)
13. Graziano A, Carinci F, Scolaro S, D 'Aquino R(2013)使用自体牙韧带微移植物生成牙周组织:6个月随访的病例报告。AOMFS1:20。
14. Brunelli G, Motroni A, Graziano A, D'Aquino R, Zollino I等(2013)使用自体牙髓微移植物的窦性提升组织工程:骨密度评估的一例报告。J印度SocPeriodontol17: 644 - 647。(Crossref)
15. d'Aquino R, De Rosa A, Lanza V, Tirino V, Laino L, et al.(2009)牙髓干细胞/祖细胞和胶原海绵生物复合物移植修复人下颌骨缺损。欧元细胞板牙18: 75 - 83。(Crossref)
16. Aimetti M, Ferrarotti F, Mariani GM, Cricenti L, Romano F(2013)牙髓干细胞/胶原海绵生物复合物治疗非含包膜内缺损:一个病例系列。牙周病临床专家5:2。
17. Giaccone M, Brunetti M, Camandona M, Trovato L, Graziano A(2014)一种基于Rigenera协议的新型医疗设备在复杂伤口管理中的应用．干细胞研究进展1:3。
18. Purpura V, Bondioli E, Graziano A, Trovato L, Melandri D，等。(2014)一种新的皮肤微移植物生成分解方法后的组织表征。J Vis实验e53579。
19. Svolacchia F, De Francesco F, Trovato L, Graziano A, Ferraro GA(2016)一种创新的疤痕再生治疗方法。J CosmetDermatol(Crossref)
20. Trovato L, Monti M, Del Fante C, Cervio M, Lampinen M, et al.(2015)一种新型医疗设备rigeneracons允许从人体组织的机械分解中获得存活的微移植物。J细胞杂志230:2299 - 2303。(Crossref)
21. Ceccarelli G1,Graziano A, Benedetti L, Imbriani M, Romano F，等。(2016)来自不同口腔来源的人口腔骨膜细胞(PCs)的成骨潜力:一项体外研究。J细胞杂志231: 607 - 612。(Crossref)
22. Aghaloo TL, Moy PK(2007)哪种硬组织增强技术在为种植体植入提供骨支持方面最成功?口腔颌面种植体22增刊:49 - 70。(Crossref)
23. 王若然，郎NP(2012)拔牙后牙脊保存。临床口腔植入物保留区23增刊6:147-156。(Crossref)
24. Cardaropoli D, Tamagnone L, Roffredo A, Gaveglio L, Cardaropoli G(2012)牛骨矿物和拼贴的窝窝保存N膜:一项带有组织学分析的随机对照临床试验。牙周病修复凹陷32:421 - 430。(Crossref)