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摘要

高胆固醇血症患者会增加氧化应激和血管内皮功能障碍。在这项双盲安慰剂对照交叉研究中，我们测试了抗氧化剂和膳食补充剂α-硫辛酸短期治疗是否能逆转7名高胆固醇血症患者的全身氧化应激和内皮功能障碍。受试者服用安慰剂或300毫克α-硫辛酸，每天两次，持续4周。经过6周的洗脱期后，他们又开始使用另一种研究药物4周。在两种治疗前后的四次就诊中，通过桡动脉压平血压计的脉搏波分析，评估脂质谱和氧化应激标志物，以及一氧化氮依赖性和非依赖性血管舒张。除高胆固醇血症(低密度脂蛋白，LDL = 179±21 mg/dl)外，受试者均健康，无明显心血管疾病。然而，他们尿液中的2,2-二氢-5,6-二氢-15- f浓度确实升高_{2 t}-异前列腺素，一种测量全身氧化应激的方法。增强指数，一种由脉搏波分析得出的动脉硬度的测量，与低密度脂蛋白胆固醇浓度相关。吸入沙丁胺醇后，一氧化氮依赖性血管反应性(通过增强指数下降来测量)在这些受试者中受到损害，但一氧化氮非依赖性反应性得以保留，这反映在舌下硝酸甘油后增强指数的预期下降上。这些结果表明受试者处于氧化应激增加和内皮功能障碍。然而，α-硫辛酸治疗4周后，两种缺陷均未能逆转。

关键字

氧化应激，硫辛酸，内皮功能障碍，脉搏波分析，高胆固醇血症

介绍

动脉粥样硬化，至少在其早期阶段，是一种炎症性疾病，通常由不适当的高浓度低密度脂蛋白(LDL)引发。LDL可在供血心脏和大脑的动脉壁上缓慢积聚，形成斑块，导致脑血管疾病、心血管疾病和动脉粥样硬化[1-3]。LDL被巨噬细胞和其他炎症细胞摄取后，激活氧化应激途径，自身在内皮下空间被氧化，从而导致内皮功能障碍，这是动脉粥样硬化的早期表现之一。特别是，氧化LDL通过降低其合成和生物活性来损害一氧化氮依赖性血管舒张。抗氧化剂，包括维生素C和E，在细胞培养中，甚至在人类中，都能有效地减少氧化应激引起的脂质过氧化。然而，这些维生素治疗动脉粥样硬化的临床试验结果却令人失望。

其他抗氧化剂可能有更有益的作用。例如，α-硫辛酸(LA)是一种抗氧化剂和膳食补充剂，已被用于治疗与“氧化应激”相关的各种疾病超过40年。糖尿病控制不佳的患者血浆抗氧化剂浓度低，血浆脂质过氧化物浓度升高[4]。后者包括硫代巴比妥酸反应物质、脂质氢过氧化物和F₂-isoprostanes[5 - 8]。糖尿病患者使用600 mg/天硫辛酸治疗超过3个月，可显著降低血浆脂质氢过氧化物，这一作用与血糖控制无关[9]。即使在没有糖尿病的健康人群中，连续2个月每天服用600毫克硫辛酸也能降低尿F₂-异前列腺素与血浆和LDL对体外氧化[10]。

先前的研究表明，高胆固醇血症可诱导氧化应激和内皮功能障碍，后者表现为一氧化氮依赖性血管反应性受损[10-13]。马兰根的试验结果et al。表明LA可能有利于减少氧化应激和高LDL水平引起的内皮功能障碍[10]。因此，我们对高胆固醇血症患者进行了短期LA治疗的双盲、安慰剂对照交叉试验。

实验程序

病人的选择

研究组包括7名高胆固醇血症患者(5名女性和2名男性)，年龄50-75岁，低密度脂蛋白胆固醇升高(160-190 mg/dl)，但没有明显的动脉粥样硬化性血管疾病。该研究的其他排除标准包括糖尿病、前6个月吸烟、除了高胆固醇血症、维生素或抗氧化剂补充、高血压、降脂药物或肝肾功能检查异常外，还存在2种或2种以上心血管危险因素。受试者给予书面知情同意，范德比尔特大学机构审查委员会批准了这项研究。

研究设计

这是一项双盲安慰剂对照交叉试验，受试者被随机分配服用安慰剂或300毫克外消旋LA，每天两次，持续4周，随后是6周的洗脱期，然后是4周的安慰剂或第一期未服用的研究药物。范德比尔特研究药房在相同的胶囊中制备了LA和安慰剂，并保留了药物研究代码，直到研究完成。在每次访问时通过药丸计数监测受试者对药物的依从性。在研究期间，受试者遵循常规饮食和锻炼。初步筛选后，受试者在每个研究期之前和之后，在范德比尔特临床研究中心的4次禁食访问中进行评估。

样品采集和分析

4次就诊均静脉穿刺采血，采集于乙二胺四乙酸(EDTA)管中。血浆通过低速离心从红细胞中分离出来，在-70°C下单独保存，直到检测。范德比尔特临床实验室测量了血浆代谢和脂质谱，以及c反应蛋白。血浆维生素C和α-生育酚浓度采用高效液相色谱法(HPLC)测定，电化学检测方法如前所述用于豚鼠血浆[14]。血浆α-生育酚浓度与同一样本血浆LDL浓度归一化[15]。在4次访问中，每次取尿，在-70°C冷冻，并在一批中检测15-F的主要尿液代谢物_{2 t}-异前列腺素，称为2,2-二-5,6-二氢-15- f_{2 t}-isoprostane (15-F_{2 t}-IsoP-M)。该分析使用稳定同位素稀释质谱法定量15-F_{2 t}-尿中的isop - m，并按照前面的描述进行[16]。异前列腺素是一类类似前列腺素的化合物，由花生四烯酸的非酶自由基催化过氧化作用产生[17]。15-F浓度_{2 t}尿液中的isop - m已被证明受到人体体内氧化应激增加相关条件的强烈影响，包括高胆固醇血症[16]。尿15-F_{2 t}-IsoP-M浓度与尿肌酐浓度归一化[16]。

血管反应性测量

在每名受试者的4次就诊中，每次通过桡动脉脉搏波分析对沙丁胺醇或硝酸甘油的反应性进行评估。使用米勒血压计(SPT-301B)评估桡动脉远端脉搏波分析，累积13个心动周期的数据。利用SphygmoCorPx Version 6.1软件(AtCor Medical, Sydney, Australia)，采用经过验证的传递函数算法，从平均复合径向波形中得出主动脉压波形[18]。增强指数(AIx)是衡量动脉硬度的一种指标，计算方法是中心压波形的第一个和第二个收缩期峰值之差，以脉冲压的百分比表示。该方法的有效性已被前瞻性地确立[19]。在获得静息和平卧受试者10分钟的基线数据后，使用间隔装置在吸入沙丁胺醇(200 mg)后10-15分钟测定AIx中一氧化氮依赖的变化。随后在30分钟内通过舌下硝酸甘油喷雾(每次喷射2次，每次0.4 mg)评估一氧化氮独立血管扩张，并在10-15分钟测量动脉压脉搏波。这种评估一氧化氮依赖和独立血管扩张的方法先前已在正常和高胆固醇血症受试者中得到验证，因为β后Aix降低₂静脉注射一氧化氮合酶特异性抑制剂N-ϖ-nitro-monomethyl-L-精氨酸可减弱-肾上腺素能受体的刺激[20-22]。另一方面，n -w-硝基-单甲基- l-精氨酸不影响硝化甘油引起的血管扩张[20-22]。

数据分析

结果以均数±标准差计算。采用SigmaStat 2.0软件程序(Jandel Scientific, San Rafael, CA)，通过配对t检验或符号秩检验(当数据非正态分布时)确定统计显著性。所有分析均为双尾分析，p值<0.05为显著性基础。

结果

研究招募了5名女性和2名男性，平均年龄为57±5岁，身体质量指数(BMI)为25 ~ 31 kg/m²，平均值为27±2 kg/m²。表1显示了四次研究访问中所有受试者的血压和临床实验室结果的平均值。除低密度脂蛋白胆固醇升高179 mg/dl外，脂质参数正常，未受硫辛酸影响。血浆葡萄糖、抗坏血酸和α-生育酚浓度(即使与血浆LDL浓度标准化)正常，也不受硫辛酸的影响。c -反应蛋白在所有受试者的参考范围(0-10.0 mg/L)内，也不受硫辛酸的影响。异前列腺素代谢物15-F_{2 t}与正常受试者0.46 +/- 0.09 mg/mg肌酐相比，这些高胆固醇血症受试者每次研究访视时的isop - m平均值(表1，最后一行)均显著升高[16]。然而，安慰剂或LA对尿15-F没有影响_{2 t}-IsoP-M浓度(表1)。图1显示了个体受试者的浓度。两个基线LDL胆固醇浓度的平均值与平均基线尿15-F没有相关性_{2 t}-IsoP-M浓度(R = 0.12)。

测量	安慰剂		硫辛酸
	基线	4周	基线	4周
收缩压(mmHg)	121±5	118±9	111±5	111±7
舒张压(mmHg)	70±9	69±11	67±8	66±8
总胆固醇(mg/dl)	267±19	284±40	273±32	263±28
甘油三酸酯(mg / dl)	123±63	151±96	117±52	135±64
高密度脂蛋白(mg / dl)	63±10	64±11	64±1 1	57±11
低密度脂蛋白(mg / dl)	179±21	191±41	185±31	179±33
葡萄糖(mg / dl)	94±6	95±7	94±5	90±8
c反应蛋白(mg/l)	3.7±2.7	3.8±2.6	3.8±3.0	4.3±4.0
抗坏血酸(μ米)	31±18	26±8	31±20	27±1 0
α生育酚(米米)	31±18	29±7	27±14	33±18
α生育酚(米摩尔/更易与)一个	6.9±3.4	6.2±2.2	5.6±2.6	7.1±3.3
8-Iso M (ng/mg肌酐)	0.88±0.51	0.71±0.28	0.75±0.35	0.72±0.26

表1:硫辛酸对临床参数的影响

^一个标准α-生育酚=血浆α-生育酚/(LDL胆固醇× 0.0259)

图1:尿15-F的变化_{2 t}-处理后的isop - m浓度。箭头显示初始和最终的15-F_{2 t}-个体研究对象安慰剂和LA治疗前后的isop - m浓度。

经沙丁胺醇和硝酸甘油治疗后的血管反应性(AIx)下降，可见一氧化氮依赖性和非依赖性血管反应性如图2所示。尽管在安慰剂和LA治疗后，大多数受试者吸入沙丁胺醇后的AIx都有所下降，但这在两组治疗中都没有达到统计学意义。吸入沙丁胺醇后，LA治疗对每个受试者的AIx(校正心率)变化没有影响(p = 0.58)。在两个治疗组中，每个受试者的AIx对硝酸甘油的反应都有所下降(图2)，尽管LA没有改善AIx对硝酸甘油的反应(p = 0.14)。两个基线LDL胆固醇浓度的平均值与相应的AIx之间无相关性(R = 0.11, p = 0.82)。

图2:每次治疗的基础和刺激的AIx变化。箭头表示安慰剂(上图)和LA治疗对每个研究对象吸入沙丁胺醇和舌下硝酸甘油反应的影响。

讨论

这项短期交叉研究的结果测试了LA对氧化应激的影响，通过测定血浆抗坏血酸和α-生育酚的水平以及尿液中的15-F水平_{2 t}-IsoP-M未表现出LA处理的保护作用。本研究受试者除轻度肥胖外，唯一明显的代谢异常是LDL胆固醇中度升高。研究表明，α-硫辛酸单独或联合EPA治疗可能对限制热量饮食的肥胖或超重女性的体重产生有益影响[23]。根据目前国家胆固醇教育计划的成人治疗小组III指南，这些受试者的平均LDL浓度(160-190毫克/分升)，考虑到他们的低风险因素，将他们置于不强制使用降胆固醇药物治疗的群体中。尽管如此，正如先前对血清总胆固醇水平>240 mg/dl或低密度脂蛋白水平>160 mg/dl受试者的研究一样，本研究中的受试者通过尿15-F测量氧化应激水平升高_{2 t}-IsoP-M浓度。重要的是，所有这些测定都是在同一个实验室进行的。平均15华氏度_{2 t}- Morales研究中高胆固醇血症受试者的isop - m浓度et al。为0.85±0.21 ng/mg肌酐，而在本研究中，两个基线期的平均浓度为0.82±0.44 ng/mg肌酐。高胆固醇血症受试者的两组结果几乎是无高胆固醇血症受试者的两倍，并且有显著差异。虽然血浆α-生育酚与血浆LDL胆固醇的标准化浓度在正常范围内，但未补充的受试者血浆抗坏血酸浓度在较低的正常范围内[15,24,25]。这些结果证实，即使是轻度至中度高胆固醇血症的受试者也处于显著的氧化应激下。

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尽管这些受试者以交叉方式作为自己的对照，4周补充LA未能降低尿15-F升高_{2 t}-IsoP-M浓度。这可能与本研究中相对较短的治疗时间(4周)有关。比如莫拉莱斯et al。发现给高胆固醇血症患者补充高剂量抗氧化剂(每天8克维生素C，每天3200国际单位维生素E，每天240毫克β-胡萝卜素)4个月后尿15-F正常_{2 t}-IsoP-M浓度[16]。此外,Marangonet al。研究发现，正常志愿者每天服用600毫克LA，连续8周显著降低尿F₂-异前列腺素和其他氧化应激标志物[10]。尽管啮齿类动物研究表明，在葡萄糖喂养诱导的胰岛素抵抗和高血压模型中，氧化应激只需3周的LA就能逆转，但对于人类而言，情况可能并非如此[26]。在一项随机对照试验中，与罗格列酮或二甲双胍相比，LA对接受短期连续皮下胰岛素输注(CSII)的2型糖尿病患者的ß-细胞功能没有任何额外的益处，而罗格列酮或二甲双胍则优于CSII单药治疗[27]。

未能看到LA治疗对氧化应激的影响并不一定意味着它不会改善内皮功能障碍。在这项研究中，后者是通过中央脉冲波分析响应β的变化来评估的₂肾上腺素能刺激，已被证实能准确反映一氧化氮介导的血管扩张变化[20,22,28]。本研究的受试者在沙丁胺醇诱导下的AIx没有明显下降，尽管所有受试者在舌下硝酸甘油后都显示AIx下降。这表明一氧化氮介导的血管扩张的可能性是存在的，但一氧化氮不足导致整个研究组的血管明显松弛和AIx下降，这是内皮功能障碍的标志。此外，使用LA治疗并没有增强AIx的降低。此前有报道称，单次口服600 mg剂量的LA不会影响健康老年男性的AIx[29]。另一方面，对代谢综合征患者进行为期4周的每日300毫克LA治疗，确实使内皮依赖性血流介导的舒张增加44%，但对血浆8-异前列腺素浓度没有影响，尽管白细胞介素-6和纤维溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1)浓度降低[30]。考虑到本研究在相同时间内服用更高剂量的LA，我们的研究结果表明，高胆固醇血症和可能潜在的(尽管临床上没有症状)动脉粥样硬化的受试者对LA没有改善的一氧化氮依赖性血管反应性。

致谢

这项工作得到了NIH基金AT001062的支持。

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