北中大学感染控制科学研究生院，东京市北区市根5-9-1，邮编108-8641gydF4y2Ba
电子邮件:gydF4y2BaaagydF4y2Ba
日本抗结核协会结核研究所，东京清濑松山3-1-24，邮编204-8533gydF4y2Ba
北中大学感染控制科学研究生院，东京市北区市根5-9-1，邮编108-8641gydF4y2Ba
北中生命科学研究所，北中大学，东京市北区十根5-9-1，邮编:108-8641gydF4y2Ba
DOI: 10.15761 / BRCP.1000126gydF4y2Ba
溃疡分枝杆菌gydF4y2Ba感染会导致布鲁里溃疡，这是一种慢性破坏性皮肤坏死性溃疡。布鲁里溃疡的症状主要是由独特的毒性大环内酯引起的，称为菌内酯。Th的抑制gydF4y2Ba1gydF4y2Ba类型的免疫反应和炎症反应是由真菌内酯在人和动物模型中引起的。然而，菌内酯对血清免疫反应的影响尚不清楚。在本研究中，我们将含有部分纯化菌内酯的模型抗原注入小鼠体内，观察其对血清中抗体产生的影响。含有霉菌内酯的部分以剂量依赖性的方式抑制对共给抗原的抗体产生。当抗原和菌内酯制剂在不同部位注射时，未观察到抑制作用。此外，该效应仅被证实针对共给的抗原。此外，含有菌内酯的部分被认为是安全的，即使在剂量比抑制抗体反应的剂量高十倍的情况下，这表明菌内酯作为一种新的免疫调节剂的潜在用途，可以专门防止对共给抗原的抗体反应。gydF4y2Ba
溃疡分枝杆菌，布鲁里溃疡，免疫抑制，分枝杆菌内酯gydF4y2Ba
布鲁里溃疡是一种坏死性皮肤感染，由gydF4y2Ba溃疡分枝杆菌gydF4y2Ba[1 - 3]。该病主要流行于西非，其发病率在亚洲、澳大利亚和拉丁美洲呈上升趋势[1-3]。布鲁里溃疡的发病机制依赖于菌内酯，一种由细菌产生的脂质毒素gydF4y2Ba溃疡分枝杆菌gydF4y2Ba[4]。菌内酯是一种聚酮衍生的大环内酯[5]，可对培养的L929小鼠成纤维细胞产生细胞病变作用[4,6]。在豚鼠体内注射真菌内酯可产生类似于布鲁里溃疡[4]的溃疡。霉菌内酯可抑制免疫细胞如单核细胞[8]、巨噬细胞[9]、树突状细胞[10]和T细胞等产生各种细胞因子、趋化因子和其他分泌免疫调节剂[7][11-13]。当一株缺乏霉菌内酯的菌株gydF4y2Ba溃疡分枝杆菌gydF4y2Ba将其注射到模型动物体内，成功形成肉芽肿，并将细菌从感染区域清除[14,15]，这表明真菌内酯对细胞介导的免疫反应具有抑制作用。然而，真菌内酯对血清免疫反应的影响仍然知之甚少。我们之前证明用福尔马林杀死的小鼠免疫gydF4y2Ba溃疡分枝杆菌gydF4y2Ba没有产生gydF4y2Ba溃疡分枝杆菌gydF4y2Ba特异性血清IgG[16]。另一方面，用脱蜡全细胞免疫的小鼠产生高滴度的gydF4y2Ba溃疡分枝杆菌gydF4y2Ba-特异性IgG[16]，使我们推测含有菌内酯的蜡质细胞壁抑制了抗体反应。在这项研究中，我们检查了菌内酯对抗共给抗原抗体产生的抑制作用。gydF4y2Ba
特异性无病原体雌性BALB/c小鼠来自日本SLC (Hamamatsu, Japan)。所有小鼠都被安置在北中大学的动物护理设施中。小鼠在室温为23±2℃，湿度为55±10%的条件下，自由饮水和12 h明暗循环的标准饮食。所有的笼子都装满了木屑。该研究由北中大学动物研究委员会批准，并根据日本文部科学省的指导方针进行。gydF4y2Ba
溃疡分枝杆菌gydF4y2BaTMC1615(产生菌内酯a /B的临床分离物)和gydF4y2Ba溃疡分枝杆菌gydF4y2Ba本研究使用的菌株为ATCC19423(一株分枝杆菌内酯缺乏菌株)。我们证实，在制备的脂质部分中没有检测到真菌内酯活性gydF4y2Ba溃疡分枝杆菌gydF4y2BaATCC19423的方法如下所述。为了进行常规繁殖，将细菌培养在Middlebrook 7H9肉汤(BD Biosciences, Sparks, MD, USA)中，添加0.05% (w/v)介于80 - 10% (v/v)之间的Middlebrook OADC富集液(BD Biosciences)中，在32°C下培养3周。gydF4y2Ba
丙酮可溶性脂质(ASL)的制备，一种部分纯化的菌内酯，按照George的描述进行gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba[6]。简单地说，将细菌培养物离心以收集细胞。在细胞颗粒中加入氯仿和甲醇的混合物(2:1,v/v)，在室温下轻轻搅拌4 h。离心后(23,800 ×gydF4y2BaggydF4y2Ba， 10分钟，4℃)，将有机溶剂层转移到棕色玻璃瓶中，用蒸发器去除溶剂。加入冰冷的丙酮来溶解除磷脂以外的脂类。离心后(950 ×gydF4y2BaggydF4y2Ba4℃，30 min)，将上清装入棕色玻璃瓶中，用蒸发器除去溶剂。加入丙酮，我们称之为丙酮可溶性脂类(ASL)的溶液保存在-20°C，直到进一步使用。gydF4y2Ba
CCL-1小鼠成纤维细胞，L929细胞衍生物，购买自美国类型培养集合(ATCC, Manassas, VA, USA)。细胞生长在Eagle的最低必需培养基中，其中含有10%热灭活胎牛血清(FCS, Moregate Biotech, Bulimba, QLD, Australia)，青霉素(100 U/mL)和链霉素(100µg/mL)， 37℃，5% CO的气氛中gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在空气中。在96孔微量滴定板的每孔中连续加入两倍稀释的样品，每孔含5 × 10gydF4y2Ba4gydF4y2Ba37°C孵育48 h。然后，在每个孔中加入10µL的AlamarBlue (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)，孵育2 hgydF4y2Ba560gydF4y2Ba)和ODgydF4y2Ba595gydF4y2Ba每口井的含量都用微孔板读取器测量。代谢活性指数(MI)的计算公式如下:MI = [(ODgydF4y2Ba560gydF4y2BaodgydF4y2Ba595gydF4y2Ba）gydF4y2Ba样本gydF4y2Ba——(ODgydF4y2Ba560gydF4y2BaodgydF4y2Ba595gydF4y2Ba）gydF4y2Ba空白gydF4y2Ba] / [(ODgydF4y2Ba560gydF4y2BaodgydF4y2Ba595gydF4y2Ba）gydF4y2Ba控制gydF4y2Ba——(ODgydF4y2Ba560gydF4y2BaodgydF4y2Ba595gydF4y2Ba）gydF4y2Ba空白gydF4y2Ba］．用含有真菌内酯的脂类治疗可导致CCL-1细胞围拢[4,6]，并降低MI值。观察到形态变化的细胞百分比(细胞病变活性单位，CPU)[6]与MI(图1)之间有很强的相关性。最小有效剂量(MED)被定义为将MI降低到0.3所需的最小剂量。gydF4y2Ba
位的1。gydF4y2BaCCL-1细胞形态变化百分比与代谢活性指数的相关性。用不同剂量的ASL处理CCL-1细胞，孵育48 h，孵育后计数圆细胞数，然后在细胞中加入AlamarBlue。代谢活性指数(MI)的计算方法参见《材料与方法》。Pearson相关系数(r)为0.83。gydF4y2Ba
6周龄雌性小鼠腹股沟区皮下注射10µg的ASL抗原免疫。免疫后3周，麻醉抽血，安乐死取脾。牛γ球蛋白(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)和卵白蛋白(OVA, Sigma-Aldrich)被用作抗原。gydF4y2Ba
小鼠后足垫接种10µL的ASL。接种后21天，处死小鼠，取足垫组织进行组织病理学检查。后脚垫的样品固定在中性缓冲福尔马林中，并在4°C的5% EDTA (pH 7.4)中脱钙。这些组织被埋在石蜡中。组织切片(4 μ m厚度)用苏木精和伊红染色。gydF4y2Ba
取96孔板的孔，在50 mM碳酸钠包覆缓冲液(pH 9.6)中，以浓度为1µg/mL的100µL抗原溶液包覆于4℃下18 h。用含0.05% (v/v) Tween 20(洗涤缓冲液)三次洗涤后，加入含10% (w/v)脱脂奶粉(孵育缓冲液)的300 μ L洗涤缓冲液，室温孵育30min。洗三次后，加入两倍连续稀释的血清，室温孵育2 h。洗三次后，加入孵育缓冲液中5000倍稀释过氧化物酶-亲和力纯山羊抗小鼠IgG (Jackson实验室，Bar Harbor, MA, USA) 100µL，室温孵育2 h。然后洗孔，100µL底物(TMB底物试剂盒;添加了Thermo scientific, Waltham, MA, USA)。在室温下黑暗孵育3分钟后，100 μ L的2 M HgydF4y2Ba2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba4gydF4y2Ba添加到每口井，ODgydF4y2Ba450gydF4y2Ba测量。AP-AffiniPure山羊抗小鼠IgG, Fc γ亚类1 (Jackson实验室)，AP-AffiniPure山羊抗小鼠IgG, Fc γ亚类2a特异性(Jackson实验室)，测定IgG滴度gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和免疫球蛋白gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,分别。碱性磷酸酶偶联二抗体检测使用FAST-pNPP试剂盒(Sigma Aldrich)和3m NaOH(停止液)。在这种情况下，吸毒过量gydF4y2Ba405gydF4y2Ba测量。gydF4y2Ba
抗体浓度表示为血清稀释度(效价)的倒数，吸光度等于阴性对照孔值的平均值加上三个标准偏差(SD)。gydF4y2Ba
使用GraphPad Prism软件版本6 (GraphPad software, LA Jolla, CA, USA)进行统计分析。采用方差分析和Dunnett检验检验不同组间结果的统计学差异。gydF4y2Ba
我们检测了牛γ球蛋白和ASL混合免疫小鼠的血清IgG反应。将10µg的牛γ球蛋白和1000 MED的ASL混合注射到小鼠右腹股沟区皮下组织。注射后21天采集小鼠血清，用ELISA法测定小鼠血清中牛γ球蛋白特异性IgG滴度。单注射牛γ球蛋白的小鼠血清中牛γ球蛋白特异性IgG滴度高(图2)。相反，注射该抗原和ASL混合物的小鼠血清中牛γ球蛋白特异性IgG滴度低于检测极限(<50)(图2)，这表明ASL抑制了抗共注射抗原的IgG的产生。另一方面，当将抗原和ASL分别注入不同部位时，即分别将牛γ球蛋白和ASL注入腹股沟右区和左区，检测到高滴度的牛γ球蛋白特异性血清IgG(图2)。观察结果表明，ASL仅抑制对共注射抗原的抗体产生，而对与ASL注射部位不同的抗原的抗体产生无抑制作用。当我们以OVA作为抗原重复这个实验时，ASL抑制了血清对OVA的抗体反应(日期未显示)，这表明ASL的免疫抑制作用不依赖于抗原。gydF4y2Ba
位的2。gydF4y2Ba小鼠血清中γ-球蛋白特异性IgG的滴度测定gydF4y2Ba
我们从一株缺乏分枝杆菌内酯的菌株ATCC19423制备了ASL，并测定了其对共给抗原产生血清IgG的影响。用10µg牛γ-球蛋白与提取的ASL混合免疫小鼠gydF4y2Ba溃疡分枝杆菌gydF4y2BaTMC1615(含1000 MED的ASL的284.7µg)或ATCC19423(含未检测到真菌内酯的ASL的284.7µg)。用牛γ球蛋白和TMC1615菌株制备的含有真菌内酯的ASL混合免疫的小鼠血清中未检测到牛γ球蛋白的血清IgG应答(图3)。然而，在用牛γ球蛋白免疫的不含真菌内酯的ASL的小鼠血清中检测到高滴度的抗牛γ球蛋白IgG(图3)。数据表明，ASL对抗体产生的抑制作用依赖于真菌内酯的存在。gydF4y2Ba
位的3。gydF4y2Ba对共给抗原的抗体反应的抑制可能是由菌内酯引起的gydF4y2Ba
将10µg牛γ球蛋白与1000 MED ASL混合注入小鼠右侧腹股沟区皮下组织，10µg OVA注入左侧腹股沟区皮下组织。免疫3周后测定牛γ球蛋白和OVA特异性血清抗体滴度。γ-球蛋白特异性IgG水平低于检测限(图4A)。与此相反，OVA特异性IgG水平较高，与只接种OVA的小鼠抗OVA IgG水平无明显差异(图4B)。这一结果表明，含有霉菌内酯的部分不影响抗体反应的抗原被注射到不同的位置。观察表明，菌内酯不影响全身抗体的产生。gydF4y2Ba
位的4。gydF4y2Ba含有菌杆菌内酯的脂质部分对抗体反应的局部抑制gydF4y2Ba
我们测定了小鼠血清中牛γ-球蛋白特异性IgG的滴度，这些小鼠注射了10µg的牛γ-球蛋白混合不同剂量的ASL (0, 10, 100, 1000 MED)。正如预期的那样，当剂量从10到1000 MED变化时，观察到剂量依赖性反应(图5A)。ASL 10 MED及以上免疫小鼠血清中牛γ球蛋白特异性IgG滴度显著低于单纯免疫小鼠血清。免疫组ASL滴度1000 MED低于检测限。gydF4y2Ba
我们还检查了牛的水平gydF4y2BaγgydF4y2Ba-globulin-specific免疫球蛋白gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和免疫球蛋白gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在免疫了该抗原和不同剂量的ASL的小鼠血清中。牛γ球蛋白特异性IgGgydF4y2Ba1gydF4y2Ba滴度呈剂量依赖性变化(图5B)，与整个IgG反应类似。然而，牛γ球蛋白特异性IgG的滴度gydF4y2Ba2gydF4y2Ba未在所有组中检测到(日期未显示)。gydF4y2Ba
位的5。gydF4y2Ba含有霉菌内酯的部分产生抗体的剂量依赖性抑制gydF4y2Ba
在小鼠脚垫上注射10000 MED的含有真菌内酯的部分，进行组织病理学分析，这是完全抑制抗牛γ球蛋白抗体产生的剂量的10倍。小鼠分别注射或不注射10,000 MED的ASL。按照材料和方法中所述的方法准备脚垫的部分。两组之间的足垫组织病理学没有观察到差异(图6)。此外，注射ASL不会导致足垫肿胀(数据未显示)。gydF4y2Ba
位的6。gydF4y2Ba小鼠脚垫注射ASL的组织病理学分析。小鼠注射DPBS (A)和10,000 MED的ASL (B)。接种3周后，小鼠脚垫组织学切片用苏木精和伊红染色。的放大;×100。gydF4y2Ba
结果表明，在其中毒剂量下，菌内酯可影响抗体的产生。gydF4y2Ba
先前的研究已经报道ThgydF4y2Ba1gydF4y2Ba与健康对照组相比，布鲁里溃疡患者血清中细胞因子的产生受到抑制[17,18]。此外,一些gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba有研究表明，菌内酯可以抑制免疫细胞如T细胞、巨噬细胞和树突状细胞产生细胞因子和趋化因子[9-13]。这些观察清楚地表明，菌内酯具有免疫抑制作用，并可能在成功感染gydF4y2Ba溃疡分枝杆菌gydF4y2Ba在人类身上。然而，迄今为止，关于菌内酯对血清免疫反应的影响的报道很少。我们之前报道过gydF4y2Ba溃疡分枝杆菌gydF4y2Ba-特异性血清IgG在福尔马林灭活小鼠免疫后未检测到gydF4y2Ba溃疡分枝杆菌gydF4y2Ba细胞[16]。然而，当用脱蜡的全细胞免疫gydF4y2Ba溃疡分枝杆菌gydF4y2Ba，小鼠产生了大量的gydF4y2Ba溃疡分枝杆菌gydF4y2Ba特异性血清IgG[16]。我们推测，细菌蜡质细胞壁中的菌内酯可能会抑制其产生gydF4y2Ba溃疡分枝杆菌gydF4y2Ba特定的血清免疫球蛋白。gydF4y2Ba
在本研究中，ASL抑制了抗共给药牛γ-球蛋白(图2)和OVA抗体的产生(数据未显示)。如果是分枝杆菌内酯缺乏引起的ASL，则没有观察到效果gydF4y2Ba溃疡分枝杆菌gydF4y2Ba用菌株代替含菌内酯的ASL(图3)，提示效果是由菌内酯引起的。菌内酯的作用不依赖于抗原，而且菌内酯只抑制对共给抗原的抗体反应(图4)。这一观察表明，抗体抑制是基于注射部位的局部活性，而不是基于菌内酯的全身效应。霉菌内酯可能影响注射部位周围和最近的外周淋巴结(PLN)的免疫细胞。之前的一项研究表明，大剂量(50或100 μ g)的菌内酯影响了PLNs[19]中T细胞归巢的关键过程。真菌内酯对T细胞归巢的抑制可能是抑制血清抗体产生的机制之一。我们测量免疫球蛋白gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和免疫球蛋白gydF4y2Ba2gydF4y2Ba目的:观察注射ASL和牛γ-球蛋白的小鼠的ThgydF4y2Ba1gydF4y2Ba/ ThgydF4y2Ba2gydF4y2Ba菌内酯诱导平衡。然而,免疫球蛋白gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在任何组中均未检测到(图5)gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba提示菌内酯抑制人T细胞[11]产生IL-4和IFN-γ。真菌内酯对细胞因子产生的抑制作用可能与抑制抗体产生有关，因为IL-4是诱导Th的重要细胞因子gydF4y2Ba2gydF4y2Ba类型的免疫反应。有趣的是,革命联合阵线gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．显示B细胞在感染部位的聚集gydF4y2Ba溃疡分枝杆菌gydF4y2Ba在一个鼠标脚垫模型[20]。B细胞的积累可能是由菌内酯引起的，提示菌内酯也可能直接或间接影响B细胞，干扰B细胞的活化和/或分化为产生抗体的浆细胞。gydF4y2Ba
近年来，对真菌内酯的分子靶点进行了研究。Wiskott-Aldrich syndrome protein (WASP)和neural WASP (N-WASP)被报道为真菌内酯的直接结合靶点[7,21]。这些蛋白是支架蛋白家族的成员，可转导参与肌动蛋白细胞骨架动态重构的信号[22-25]。霉菌内酯通过劫持WASP家族发挥作用，导致细胞质[21]中肌动蛋白不受控制的激活。N-WASP是b细胞信号的负调控因子[23,24]，提示真菌内酯激活N-WASP家族可诱导b细胞受体(B-cell receptor, BCR)失活。阻断BCR信号通路可能与抑制依赖菌内酯的抗体反应有关。gydF4y2Ba
另一方面，其他研究人员报道mycolactone抑制Sec61易位子的功能[7,9,26]。Sec61介导抗原在核内体膜上的转运，并影响树突状细胞[27]的交叉呈递。真菌内酯对Sec61的抑制可能是本研究中观察到的抑制抗体产生的机制之一。gydF4y2Ba
血管紧张素II型2受体(AT2Rs)也被报道为霉菌内酯结合蛋白[7,28]。AT2R阻滞剂抑制ThgydF4y2Ba1gydF4y2Ba和ThgydF4y2Ba2gydF4y2Ba小鼠的免疫反应[29,30]。此外，mycolactone通过抑制AT2R信号[28]影响巨噬细胞样小鼠细胞系RAW267.4引起超极化。这种菌内酯与AT2R的关系可能也参与了菌内酯的免疫抑制作用。gydF4y2Ba
溃疡分枝杆菌gydF4y2Ba存在于细胞外区域，不像其他细胞内分枝杆菌如gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba(16、20)。因此，特异性抗体gydF4y2Ba溃疡分枝杆菌gydF4y2Ba可能对清除gydF4y2Ba溃疡分枝杆菌gydF4y2Ba．gydF4y2Ba溃疡分枝杆菌gydF4y2Ba可以用菌内酯逃避免疫反应吗gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba通过抑制抗体的产生。gydF4y2Ba
含有真菌内酯的部分只抑制了针对共给抗原的抗体的产生，而没有抑制不同部位的抗原，这表明真菌内酯只有局部作用(图4)。此外，根据注射后至少21天的组织病理学分析，诱导抗体抑制的剂量显示没有明显的不良反应(图6)gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．报道了100µg的纯化菌内酯注射明显诱导足垫肿胀和雪旺细胞核[31]的丢失。另一方面，在我们的研究中，小鼠脚垫注射10,000 MED的ASL没有出现任何肿胀(数据未显示)。结果表明EngydF4y2Ba等gydF4y2Ba．可能会使用比我们研究中更高剂量的菌内酯。可能有必要进一步详细评估菌内酯的神经毒性。gydF4y2Ba
综上所述，菌内酯可能是一种新的免疫调节剂。用于医疗的纳米机器正在被研究[32,33]。特别是，基于蛋白质的纳米机器是基于积累的生物活性结构域和序列知识的最有前途的进展之一[32,33]。研究人员可以设计这些结构域的人工组合，并通过使用任何蛋白质表达系统，如gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba．然而，这种策略的一个关键问题是蛋白质的抗原性。一般来说，宿主对非自身蛋白可产生免疫反应，而免疫效应器(主要是抗体)可使蛋白质活性失活(中和)。菌内酯可以抑制抗体对共给药的蛋白质基纳米机器的反应，从而提高蛋白质基治疗的疗效。我们的研究结果表明，真菌内酯可能在开发用于医疗用途的蛋白质基纳米机器时有用。为此，需要更安全的菌内酯衍生物。我们目前正在研究与菌内酯结合的蛋白质的抗原性。研究真菌内酯抑制抗体的机制是很有趣的，未来可能会使用一些药物。gydF4y2Ba
我们证明了部分纯化的菌内酯抑制了与菌内酯共同给药的抗原特异性抗体的产生。含霉菌内酯部位的抑制作用呈剂量依赖性。在足以诱导免疫抑制的剂量下，真菌内酯是安全的。我们的结果表明，菌内酯可能是一种有用的新的免疫调节剂。gydF4y2Ba
我们感谢筑田直也、石田小uri和小林Eri为我们提供的技术援助。我们也感谢Small博士(美国田纳西大学诺克斯维尔分校)提供分枝杆菌菌株gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
所有作者对这份手稿的贡献都是相同的。NS设计了这项研究，分析了数据，并准备了手稿。HN协助数据分析和稿件准备。MW协助研究设计、数据分析和稿件准备。gydF4y2Ba
作者声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba
那种NishizawagydF4y2Ba
军事大学gydF4y2Ba
研究文章gydF4y2Ba
收稿日期:2016年11月14日gydF4y2Ba
录用日期:2016年12月30日gydF4y2Ba
发布日期:2017年1月05日gydF4y2Ba
©2017 Shinoda N.这是一篇开放获取的文章，根据创作共享署名许可条款发布，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。gydF4y2Ba
Shinoda N, Nakamura H, Watanabe M(2017)溃疡分枝杆菌中含有分枝杆菌内酯的部分对共接种抗原抗体产生的抑制作用。生物医学医学临床应用2:DOI: 10.15761/BRCP.1000126gydF4y2Ba
北中大学感染控制科学研究生院，东京港区Shirokane 5-9-1，邮编:108-8641，电话:+81-3-3444-6161分机:3872;传真:+ 81-3-5791-6122;电子邮件:watanam@lisci.kitasato-u.ac.jpgydF4y2Ba
位的1。gydF4y2BaCCL-1细胞形态变化百分比与代谢活性指数的相关性。用不同剂量的ASL处理CCL-1细胞，孵育48 h，孵育后计数圆细胞数，然后在细胞中加入AlamarBlue。代谢活性指数(MI)的计算方法参见《材料与方法》。Pearson相关系数(r)为0.83。gydF4y2Ba
位的2。gydF4y2Ba小鼠血清中γ-球蛋白特异性IgG的滴度测定gydF4y2Ba
位的3。gydF4y2Ba对共给抗原的抗体反应的抑制可能是由菌内酯引起的gydF4y2Ba
位的4。gydF4y2Ba含有菌杆菌内酯的脂质部分对抗体反应的局部抑制gydF4y2Ba
位的5。gydF4y2Ba含有霉菌内酯的部分产生抗体的剂量依赖性抑制gydF4y2Ba
位的6。gydF4y2Ba小鼠脚垫注射ASL的组织病理学分析。小鼠注射DPBS (A)和10,000 MED的ASL (B)。接种3周后，小鼠脚垫组织学切片用苏木精和伊红染色。的放大;×100。gydF4y2Ba
