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摘要

目的:培养猪内皮祖细胞(EPCs)。在体外用于将来的局部移植。材料与方法:EPCs were isolated from peripheral blood of a domestic swine. After isolated with density gradient centrifugation, EPCs were cultured with EGM-2 medium in a standard condition for 12 daysand identified by fluorescence microscopy and immunocytochemistry tests.Results: EPCs were successfully isolated,cultured and characterized. From day 1 to day 12 after culture, their morphology changed from round cells to cobble-stone or spindle cells. On day 4, EPCs showed adhesion ability to the flask wall. The EPCs were characterized with phenotype expressions and specific functions.Conclusion: It is feasible to culture swine EPC在体外用于将来的移植。

关键字

内皮祖细胞，内皮化，在体外

背景

内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells, EPCs)具有修复损伤血管、促进缺血组织新生血管即血管生成的能力[1]。众所周知，如果能够实现快速再内皮化(具有固有的非血栓形成潜能，并阻断血管内侧组织中细胞因子驱动的SMCs激活)，则可能实现病变部位伤口的加速正常愈合[2]。

为了促进快速再内皮化和改善病变血管的通畅，作者培养了猪内皮祖细胞(EPCs)。在体外用于将来的局部移植。

材料与方法

内皮祖细胞的分离、培养和鉴定

采用密度梯度离心法从新提取的猪外周血中分离EPCs[3]。选取健康的年轻成年家猪(雌性，体重25kg)(Jingling Farm Center for Animal Experiments，南京，中国)，经股动脉穿刺取外周血20 mL，并用抗凝肝素(100 IU/mL，肝素钠，Qianhong Inc，江苏，中国)消毒。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)按1:1比例稀释血液。采用密度梯度离心(Biofuge, Heraeus, Germany)， 2000 rpm, 24-25℃，淋巴细胞分离培养基histopaque 1077 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)，分离EPCs 30分钟。收集外周血单个核细胞沉淀层，PBS洗涤2次，1000 rpm离心2次，每次10分钟。用细胞仪计数沉淀的细胞颗粒，用2ml微血管生长培养基2 (egm - 2mv)重生;Cambrex, Walkersville, MD)在T25培养瓶中，预涂有纤维连接蛋白(Chemicon)，并在37°C，全湿度，5% CO2 (CO2培养箱，贺利氏，德国)下培养。每500 mL egm -2培养基中含有FBS 25 mL、氢化可的松0.2 mL、hFGF-B 2 mL、VEGF 0.5 mL、R3-IGF-1 0.5 mL、抗坏血酸0.5 mL、hEGF 0.5 mL、GA-1000 0.5 mL。4天后取出悬浮细胞，每隔4天用新鲜培养基更换粘附细胞。在第8-12天，当细胞占微场的75%以上时，传代开始用0.25%胰蛋白酶(trypsin, Sigma)消化细胞，并将颗粒转移到更大的玻璃培养瓶(50 mL)中。

EPCs吞噬了dii标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-Ac-LDL, Biomedical Technologies Inc.， Stoughton, MA)并结合异硫氰酸荧光素(FITC)标记的dulex europausagglutinin I (FITC- uea -I, Vector Laboratories Inc.， Burlingame, CA)通过倒置荧光显微镜进行检测。FITC-UEA I和DiI-Ac-LDL均呈阳性的贴壁细胞提示为分化型内皮细胞。通过免疫细胞化学鉴定EPCs的表型，包括CD31、CD34、vwF和VEGFR-2(flk-1，胎儿肝激酶-1)(TBD公司)。免疫细胞化学，第一次传代细胞被镀在24孔室载玻片上，用4%多聚甲醛固定30分钟。用3% BSA在PBS-T中阻断1小时，在4℃下1:100稀释山羊多克隆抗vonwillbrand因子(DiaSorin)、FLK-1、CD31、CD34 (SantaCruz Biotechnology)孵育过夜。用DAB可视化辣根过氧化物酶活性。

统计分析

连续变量用mean±SD表示。描述性分析采用SPSS 20.0(Windows Version, SPSS, Inc.， Chicago, IL, USA)

结果

第1天P0期epcs呈圆形或多角形。假定的EPCs是在培养24小时后附着在T-25烧瓶壁上的细胞。12日^th白天，EPCs呈鹅卵石状或纺锤状，并形成簇状。第一次传代后，收集EPCs，细胞计数，免疫细胞化学技术鉴定。(2.0±0.5)× 10⁶T25玻璃烧瓶中的细胞，(5.5±1.2)×10⁶细胞在一个50毫升的培养瓶中。在7-9天的EPCs中，大多数(≥95%)祖细胞内皮细胞表型包括cd34、VEGFR-2和vwF阳性。

倒置荧光显微镜显示EPCs被内吞DiI-Ac-LDL发出红色荧光，与FITC-UEA-1结合时发出绿色荧光，覆盖图显示棕色。

讨论

在Bhattacharya V等多种血管支架模型中，有许多促进内皮化的动物和临床研究et al。和Griese DPet al。(4、5)。显然，这种技术只是一种促进内皮化的方法，在临床上并不适用。干细胞如EPCs具有许多优势，因为EPCs可以方便地从外周血中获得并分化为内皮细胞在活的有机体内．

Shirota T报道了内皮祖细胞(EPC)种子血管内支架装置的成功制造在体外[6]。我们在研究中采用了类似的技术[7]。我们的在体外结果表明，构建EPC植入式金属支架是可行的。

目前有m2021版权OAT。EPCs，包括免疫磁珠选择和密度梯度离心方法。后一种方法比前一种依靠荧光活化细胞分选(FACS)分析的方法便宜。在这项研究中，我们采用了后一种技术。

为了加速血管支架置入后的内皮化，将足够数量的内皮细胞(ECs)腔内输送到病变血管部位已显示出良好的结果[8]。然而，由于采收难度的限制，成熟的内皮细胞用于细胞移植并不现实[8]。然而，无论采用支架内或导管输注给药系统，从患者身上获取EC的困难阻碍了这些方法的临床应用[9]。

Asaharaet al。发现成人外周血中的循环EPCs能够向缺血部位运输并分化为成熟的内皮细胞[1]。最近，循环内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)的存在被认为是再内皮化的关键因素[10]。收集循环EPCs只需要采集外周血。这种微创的收获过程表明，EPC是内皮化细胞的新来源。血管损伤后早期建立功能性内皮层已被证明有助于预防内膜增殖和血栓形成[11,12]。

结论

猪内皮祖细胞可以从外周血中分离、培养和鉴定。

确认

江苏省自然科学基金项目(BK2012589)资助。

参考文献

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5. 葛丽娟，张丽娟，张丽娟。(2003)自体循环内皮细胞的分离与移植及其在体外血管移植中的应用。循环108: 2710 - 2715
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