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摘要

糖尿病(DM)是世界范围内日益严重的健康负担，同时伴有代谢综合征的患者数量也在增加。因此，迫切需要糖尿病和代谢综合征的治疗策略，以及疾病进展的预防。胰岛素抵抗是糖尿病和代谢综合征的主要病理。我们之前的研究表明，轻度电刺激(MES)与热休克(HS)联合治疗可增强胰岛素敏感性在体外在糖尿病小鼠模型中。此外，MES+HS在临床试验中改善了糖尿病或代谢综合征患者的病理生理。尽管越来越多的证据表明MES+HS可能是一种新的治疗方法，但尚不清楚从疾病早期开始长期MES+HS治疗是否具有预防DM的作用。因此，我们利用糖尿病KKAy小鼠评估了MES+HS对成熟型肥胖病理生理的影响。本研究表明，MES+HS长期治疗可减轻KKAy小鼠的糖尿病病情。MES+HS治疗可改善高血糖和胰岛素抵抗。MES+HS也倾向于抑制肾肥大，增加肾脏足细胞特异性基因的表达。总的来说，我们的研究表明，长期治疗MES+HS是一种有效且耐受性良好的治疗策略，至少部分原因是胰岛素敏感性和足细胞功能的增强。

关键字

2型糖尿病，胰岛素抵抗，糖尿病肾病，电刺激，热休克，KKAy小鼠

缩写

DM:糖尿病，MES:轻度电刺激，HS:热休克

介绍

2型糖尿病(T2DM)是全球范围内严重的健康问题，T2DM患者数量正在迅速增加[1]。约80-90%的T2DM患者被诊断为肥胖。由内脏脂肪堆积引起的肥胖是代谢综合征发生的根本原因[2]。慢性代谢综合征表现为高血压、高血糖和胰岛素抵抗，可导致2型糖尿病、动脉硬化和心血管缺陷[3]。特别是，T2DM的进展可导致并发糖尿病视网膜病变和糖尿病肾病[4,5]。因此，在代谢综合征和T2DM的初级阶段，需要能够控制其进展的治疗。此前，我们优化了轻度电刺激(MES)诱导胰岛素受体(IR)-Akt通路、MKK3b/6b-p38MAPK、JNK、p53、AMPK、HSP72等多种生理反应信号和分子的条件[6-9]。MES和42°C热休克(HS) (MES+HS)联合治疗可改善高脂饮食诱导和瘦素受体突变(db/db)小鼠的内脏肥胖和糖尿病病理生理[6]。此外，在临床试验中，MES+HS治疗可减少代谢综合征或T2DM患者的代谢异常和炎症[10,11]。研究认为，MES+HS在质膜脂筏中积累IR，进而增强胰岛素敏感性，有助于改善T2DM患者的胰岛素抵抗[12]。 Hence, MES+HS can be a useful treatment for metabolic syndrome and T2DM. However, it is unclear whether long-term treatment with MES+HS from the early stage of disease is tolerable and effective in preventing the development of maturity-onset obesity and T2DM.

在这里，我们对糖尿病KKAy小鼠进行了长期(28周)MES+HS治疗。KKAy是一种成熟型肥胖代谢综合征小鼠模型，可自发发生高血糖、高血压和胰岛素抵抗，与人类T2DM非常相似[13,14]。本研究显示，与假药组相比，MES+HS长期治疗可降低疾病晚期的血糖水平，并改善胰岛素抵抗。此外，长期MES+HS治疗改善了肾脏肥大(原发性糖尿病肾病的标志)，并增加了肾小球内脏上皮细胞和足细胞标记基因的表达。本研究揭示了长期MES+HS治疗对代谢综合征和T2DM进展的有益作用和耐受性。

材料与方法

老鼠和在活的有机体内MES +海关处理

7周龄雄性KK-Ay/taJcl (KKAy)小鼠(Charles River Laboratories, Inc.，神奈川县，日本)单独饲养。如前所述，KKAy小鼠接受MES+HS治疗，每次10分钟，每周2次[6]。简单地说，将小鼠置于通风良好的腔室中，通过一对直径10厘米的导电生热橡胶电极将MES应用于未麻醉的小鼠，电极内填充湿润柔软的棉布。电极连接到Biometronome^TM(土屋树木株式会社)，输出5V和55脉冲/秒的直流电，单个脉冲持续时间为0.1毫秒。电极温度调至42°C同时热休克处理。所有动物实验均获得熊本大学动物护理与使用委员会(#25-230E)批准。

血糖测量

空腹15小时的KKAy小鼠尾静脉采血，测定空腹血糖。随机喂养的血糖是用自由喂养小鼠的血液来测量的。每周交替测量空腹和随机喂养的血糖水平。

实时定量RT-PCR分析

按照制造商的说明，用RNAiso Plus®(Takara Bio Inc.)从KKAy小鼠的肾组织中分离总RNA。使用PrimeScript®RT试剂盒和SYBR Premix Ex Taq™(Takara Bio Inc.)进行反转录实验和PCR扩增。小鼠Podocin、Nephrin和Gapdh的Q-PCR引物已有报道[15]。采用以下引物对小鼠Synaptopodin进行Q-PCR: FW, 5′-GCCAGGGACCAGCCAGATA-3′，RV, 5′-AGGAGCCCAGGCCTTCTCT-3′。

胰岛素耐量试验(ITT)

对禁食6小时的KKAy小鼠进行胰岛素耐量试验。小鼠腹腔注射人常规胰岛素(1单位/kg体重);诺和诺德，哥本哈根，丹麦)，并在注射前和注射后的指定时间点立即评估血糖水平。

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小鼠身体和器官重量的测量

治疗28周后，小鼠麻醉并处死。在最终治疗和牺牲前测量体重。手术后立即收集内脏脂肪和肾脏并用PBS洗涤。在器官中除去水分后测量器官重量。

统计分析

数据以mean±SE或SD表示。采用Student’s unpaired双尾t检验评估两组间差异的显著性。一个P值小于0.05被认为具有统计学意义。

结果

MES+HS治疗可改善KKAy小鼠的糖尿病表型

为了研究MES+HS处理对KKAy小鼠病理表型的影响，将7周龄KKAy小鼠进行假处理(对照组;对照组)或给予MES+HS治疗，每周2次，每次10分钟，共28周。MES条件为5V, 0.1 ms脉宽，55 pps, HS为42^oC.小鼠在治疗过程中没有表现出任何疼痛或烦恼的行为，因为它们倾向于保持静止。MES+HS处理实验设备示意图如图1A所示。治疗开始后每2周测定空腹和随机喂养血糖水平。MES+HS在治疗20周内对空腹和随机喂养血糖水平的影响最小(图1B和1C)。然而，22周后，MES+ hs处理的KKAy小鼠随机喂养血糖水平显著降低(图1D)。由于MES+HS之前被证明可以改善高脂肪喂养和db/db小鼠的脂肪代谢[6]，我们接下来确定MES+HS是否会影响KKAy小鼠的脂肪积累。虽然与MES+HS相比，内脏脂肪(附睾、肠系膜和腹膜后)重量略有抑制与对照组相比，差异无统计学意义(图1E)。已知KKAy小鼠除了高血糖外还存在严重的胰岛素抵抗[16,17]。因此，我们通过胰岛素耐量试验(ITT)来检验MES+HS对胰岛素敏感性的影响。治疗26周后进行ITT。ITT结果显示，MES+HS可改善KKAy小鼠的胰岛素敏感性(图1F)。综上所述，这些数据表明MES+HS治疗改善了这些小鼠的胰岛素抵抗。

图1所示。MES+HS对糖尿病KKAy小鼠的影响

(a) MES+HS处理设置示意图在活的有机体内。7周龄KKAy小鼠进行假治疗(CON)或MES+HS治疗，每周2次，每次10分钟，共28周。(b)禁食15小时和(c)随机喂养的KKAy小鼠在治疗期间每2周测量一次血糖水平。(d)治疗22周后，测量假药治疗(CON)和MES+HS治疗的KKAy小鼠随机喂养血糖水平。(e)治疗28周后测定CON组和MES+HS组的内脏脂肪重量。(f)给药26周后小鼠在6小时禁食状态下进行胰岛素耐量试验。在胰岛素治疗后的指定时间测量血糖水平。数据以平均值(b-e)±S.E.表示或(f)±sd(假药组n=8, MES+HS组n=5)。 †P<0.1, *P<0.05 vs. control group, assessed by unpaired t-test.

MES+HS治疗可改善肾肥大，增加足细胞特异性基因mRNA表达

肾病是糖尿病最常见的并发症之一，糖尿病肾病是终末期肾脏疾病的主要原因。在1型糖尿病患者中，即使在疾病早期，肾脏也经常增大[18]。肾肥大是由肾小球和肾小管肥大、系膜细胞扩张、细胞增殖、细胞外基质积累、肾小球高血压、炎症细胞浸润等多种因素引起的[19,20]。有趣的是，MES+HS治疗倾向于抑制KKAy小鼠的肾脏重量，而不是由于体重的减少(图2A, B)。除了肥大信号外，糖尿病应激因子的肾小球内脏上皮细胞或足细胞中的细胞死亡信号也被激活[21]。足细胞是高度分化的细胞，负责肾小球滤过系统[22]。在糖尿病肾病中，经常观察到足突消退或脱离和足细胞凋亡[20,23,24]。因此，我们研究了MES+HS处理对足细胞的影响。测定足细胞特异性基因Synaptopodin、Podocin的mRNA表达和Nephrin，这是已知的足细胞标记物，在KKAy小鼠的整个肾脏中。MES+ hs处理组Synaptopodin mRNA表达明显上调(图2C)。MES+HS也显示KKAy小鼠肾脏Podocin和Nephrin mRNA水平有升高的趋势(图2D, 2E)。这些结果表明，MES+HS抑制KKAy小鼠肾足细胞损失。综上所述，MES+HS抑制肾肥大，积极调节足细胞特异性基因表达。

图2。MES+HS降低了KKAy小鼠的肾脏重量，上调了足细胞特异性基因

(a)给药28周末次给药后处死小鼠，测定肾脏重量。(b)最终治疗前测量体重。(c-e)最终处理后，从28周mes + hs处理和假处理(CON) KKAy小鼠的肾脏中分离总RNA。采用Q-PCR分析评估足细胞特异性基因的表达。采用Gapdh作为内部控制。数值为平均值±S.E.(假药组n=3, MES+HS组n=5)。†P<0.1， *P<0.05，与对照组比较，采用非配对t检验。

讨论

代谢综合征是由高血糖、胰岛素抵抗、高血压、葡萄糖耐受不良和血脂异常等全身性衰竭的串扰引起的[3]。长期暴露于这些危险因素会导致2型糖尿病和其他相关疾病。特别是，胰岛素抵抗被认为是T2DM发展的关键驱动因素。我们前期研究表明，MES+HS可增加T2DM小鼠模型的胰岛素敏感性[6]。与该报告一致，本研究发现MES+HS治疗可改善代谢综合征合并成熟型肥胖和T2DM小鼠模型KKAy小鼠的胰岛素抵抗(图1E)。我们进一步发现，在KKAy小鼠中长期治疗MES+HS未引起任何不良反应，如体重减轻、低血糖和炎症(数据未显示)。这些结果也与有报道称MES+HS在正常小鼠和健康人中不会引起低血糖或对食物摄入产生不良影响相一致[6,25]，从而确立了MES+HS长期治疗的安全性和耐受性。

有趣的是，MES+HS抑制了KKAy小鼠的肾肥大(图2A)。糖尿病肾病的初级阶段存在肾脏肥大，肾脏肥大的发生频率与终末期肾病的发生风险相对应[18]。因此，该结果提示MES+HS对继发于2型糖尿病的糖尿病肾病具有预防作用。此外，我们发现MES+HS处理增加了KKAy小鼠肾脏足细胞相关基因的mRNA表达(图2C-E)。足细胞参与糖尿病引起的肾损伤的发生和发展[26]。糖尿病疾病如高血糖、肾小球高血压、胰岛素抵抗和氧化应激主要诱导足细胞足突消退、脱离肾小球基底膜和细胞凋亡[20]。最近，有报道称足细胞特异性胰岛素信号的缺失概括了糖尿病肾病的特征，并且胰岛素信号对于足细胞足突的肌动蛋白细胞骨架组织维持肾小球滤过屏障系统至关重要[27]。因此，通过激活足细胞胰岛素敏感性来抑制足细胞疾病是糖尿病肾病治疗中一个日益增长的概念。在本研究中，MES+HS可改善KKAy小鼠全身胰岛素抵抗。此外，我们之前发现MES+HS直接激活足细胞中的Akt在活的有机体内和在体外[28]。Akt是胰岛素信号传导的关键下游分子，MES+HS也有报道通过增强胰岛素受体酪氨酸磷酸化激活PI3K/Akt信号通路[12]。基于这些发现，我们假设MES+HS通过增强富肌动蛋白足突的结构以及增强足细胞的胰岛素敏感性来抑制足细胞脱离和顺序足细胞丢失。与这一概念相一致的是，MES+HS处理显著增加了足细胞足突功能标志物Synaptopodin的表达。此外，通过MES+HS增加足细胞相关基因表达可能是改善某些糖尿病表型的次要有益效应。

在本研究中，我们使用的MES电压条件为5V，不到之前条件12V强度的一半[6]。对于MES+ hs处理的KKAy小鼠，5V平均为2V/cm，以电极距离计算。Kondo等人报道，电刺激1.4±0.1 V/cm时，MES+HS可改善T2DM患者的代谢异常[10]。因此，我们发现了MES+HS在糖尿病病理上的有益效果和使用更接近临床治疗的条件长期治疗的安全性。综上所述，本研究表明，长期MES+HS可改善KKAy小鼠的高血糖、胰岛素抵抗和肾肥大。这些研究结果表明，MES+HS有可能成为一种新的治疗和预防T2DM和糖尿病肾病的方法。

资金信息

这项工作得到了日本文部科学省(MEXT)对香港的资助(#19390045)和日本文部科学省领先研究生院计划“HIGO(健康生命科学:跨学科和全球导向)”的支持。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

作者的贡献

YK, YT, RF, KO, MP, YO, KM进行实验并获得数据。YK, MS和TS撰写了手稿。TK, EA和HK设计并监督研究。所有作者都认可了手稿的最终版本。