美国斯基德莫尔学院健康与运动科学系
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DOI: 10.15761 / IOD.1000152
目前的研究确定了一氧化碳(CO)治疗是否逆转了饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗。因为CO是核受体的潜在配体Rev-erb -α，我们还确定了CO处理是否改变了Rev-erb -α目标。小鼠分别饲喂低脂饲料(LFD)或高脂饲料(HFD) 150天。在110天的膳食干预后，hfd喂养的小鼠被分配到CO吸入组或对照组。HFD-CO组连续40天每天1小时暴露于250 ppm的CO中。与LFD小鼠相比，HFD和HFD- co小鼠的体重和eddidymal白色脂肪组织(EWAT)质量显著升高，但HFD和HFD- co小鼠之间无差异。与LFD小鼠相比，HFD和HFD- co小鼠胰岛素辅助糖耐量曲线下面积显著升高，但HFD和HFD- co小鼠之间无差异。血红素加氧酶-1 (HO-1) mRNA在HFD-CO的EWAT中显著高于HFD小鼠，表明CO有效地输送到脂肪组织。CO处理没有改变Rev-erb -α表达式或Rev-erb -α目标。这些结果表明，一氧化碳吸入不会减弱饮食诱导的肥胖/胰岛素抵抗。
胰岛素，肥胖，反刍动物，一氧化碳，糖尿病
肥胖是一种日益普遍的代谢性疾病，影响着超过三分之一的美国成年人。肥胖与胰岛素抵抗有关，并增加患2型糖尿病的风险。据估计，这种疾病造成的总医疗费用为2,450亿美元。尽管与肥胖相关的患病率和健康风险，但可行和有效的治疗方案很少。因此，开发能够促进减肥和提高胰岛素敏感性的新干预措施对于减少肥胖及其相关疾病的流行是至关重要的。
最近的研究表明增加血红素加氧酶-1 (HO-1)的表达可以减少肥胖，提高胰岛素敏感性[3-6]。虽然HO-1通过卟啉分子诱导或基因操纵可以改善肥胖和胰岛素抵抗，但导致这些变化的细胞机制仍有待研究。一种假设是，HO-1酶活性的产物，CO和胆绿素，发挥代谢有益作用。在培养的细胞和小鼠[7]中，CO已被证明可以减少炎症标志物，当小鼠被置于HFD[8]中时，一种新的CO释放分子可以减轻体重增加并保持胰岛素敏感性。然而，虽然最近的一项研究表明，CO吸入可使肥胖小鼠[9]的体脂短暂减少，但CO单独是否能逆转已经形成的肥胖和胰岛素抵抗尚未确定。此外，CO促进减肥和提高胰岛素敏感性的机制尚不清楚。建立CO吸入对减少肥胖的有效性，并确定CO作用的机制，可能导致新的干预措施，以对抗肥胖和2型糖尿病。
CO可与核受体结合Rev-erb -α[10]。Rev-erb -α是配体调控的转录因子，作为转录抑制因子[11,12]调节昼夜节律和代谢[13,14]。虽然血红素已经被确定为配体Rev-erb -α[15,16]，有证据表明果蝇与Rev-erb -α结合CO并抑制[10]基因表达。是否表达Rev-erb -α虽然Rev-erb激动剂已被证明能促进体重减轻并抑制PGC-1α mRNA的表达，但CO处理后，其在组织中的作用还不清楚Rev-erb -α[14]。
本研究的目的是确定CO治疗是否可以逆转高脂饮食(HFD)导致的肥胖和改善胰岛素抵抗，并通过一种与成熟的mRNA表达变化相关的方式Rev-erb -α目标在白色脂肪组织。我们假设，每日一氧化碳治疗将减少肥胖，并改善已确定的饮食诱导肥胖小鼠的胰岛素作用。我们还假设mRNA的表达Rev-erb -α靶向PGC-1α， PPARγ， Bmal1和Rev-erb -α本身会被CO处理而减少。
野生型C57B6雄性小鼠购自Jackson实验室(Bar Harbor, ME)。在到达Skidmore学院的动物设施后，所有小鼠(约4-6周龄)被单独安置在笼子里，并被随意喂食一周的食物和水。然后将小鼠随机分配到高脂饮食(试验饮食，目录#1810251,60%千卡来自脂肪)或低脂饮食(试验饮食，目录#58145,12%千卡来自脂肪)。在110天的膳食干预后，喂养hfd的小鼠按体重分配到CO治疗组(HFD-CO)或对照组。来自HFD-CO组的小鼠被放置在单独的诱导室中，在那里它们每天吸入CO气体(250 ppm) 60分钟，连续40天[17,18]。这个CO浓度略高于已经显示的增加羧基血红蛋白水平[9]。用一氧化碳监测器测定诱导室的一氧化碳水平。HFD组和LFD组对照组小鼠每日置于诱导室5min，并接受空气。在干预期间，小鼠维持其HFD或LFD。所有的动物护理和手术都是按照国家研究委员会的《实验动物护理和使用指南》进行的(生命科学委员会实验动物资源研究所，1996年)。 All experimental protocols were approved by Skidmore College's Institutional Animal Care and Use Committee.
评估HFD和CO处理对在活的有机体内对小鼠进行胰岛素辅助葡萄糖耐量(IAGT)试验。在IAGT试验之前，小鼠被禁食一夜。禁食一晚后，小鼠同时腹腔注射葡萄糖(2g /Kg体重)和胰岛素(2u /Kg体重)。在注射葡萄糖/胰岛素后0、20、40和60分钟，通过尾静脉采集血液，用血糖计(ACCU-CHEK Aviva, Roche Diagnostics)测量血糖。我们之前已经证明，IAGT试验检测胰岛素抵抗和胰岛素耐量试验的小鼠喂食HFD，但避免严重的低血糖，通常是在胰岛素耐量试验期间和之后[19]。
在收集组织之前，小鼠禁食一夜，然后用promace、盐酸氯胺酮和xylazine的1:1:1混合物腹腔注射麻醉(0.015 ml/10 g体重)。快速解剖附睾白色脂肪组织(EWAT)，液氮冷冻，-80°C保存，待分析。
使用高脂含量组织(Qiagen)的RNA提取试剂盒从EWAT中提取总RNA。通过使用分光光度计(Beckman Coulter, Brea, CA)测量260 nm处的吸光度来定量RNA。使用Ambion公司(Austin, TX)的RETROscript试剂盒反转录1 ug的总RNA。然后将合成的cDNA (20ng cDNA/样本重复)进行定量聚合酶链反应(qPCR)，使用标准靶特异性TaqMan基因表达测定Rev-erb -α(检测ID: Mm00441730_m1)， HO-1(检测ID: Mm00516005_m1)，过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPARγ)(检测ID: Mm01184322_m1)， PPARγ辅激活剂-1α (PGC-1α)(检测ID: Mm01208835_m1)， Bmal1(检测ID: Mm00500226_m1)和一个实时PCR系统(StepOne Plus实时PCR系统，Applied Biosystems, Foster City, CA)。利用StepOne v2.1软件(Applied Biosystems)通过ΔΔCT方法确定扩增的cDNA靶点的相对定量。
采用单因素方差分析(ANOVA)检测饲粮(低肥力和高肥力)和CO处理对基因表达的影响。采用重复测量单因素方差分析检测IAGTT期间血糖水平的差异。经过显著的F比和相互作用检验，Fisher的LSD事后检验用于定位组间统计显著差异。数据以均数±SEM表示，p < 0.05为统计学显著性水平。mRNA表达，均值±SEM相对于LFD组均值(% LFD)表达。使用StatView统计软件(SAS Institute Inc.， Version 5.0, Cary, NC)分析数据。
为了评估HFD和CO治疗对肥胖的影响，我们测量了体重和EWAT质量。正如预期的那样，与喂食LFD的小鼠相比，喂食HFD的小鼠的体重和EWAT质量显著增加(图1A和1B)。在110天的饮食干预后，HFD小鼠按体重匹配分配到CO治疗组或对照组(室内空气)，并保持HFD。在HFD小鼠中。用CO(1小时/天)治疗没有显著改变体重或EWAT质量(图1A和1B)，表明CO不能逆转已存在的饮食诱导肥胖。
图1。一氧化碳治疗不能减少小鼠饮食诱导的肥胖。在CO治疗期间的各个时间点评估体重(A)。在治疗期结束时评估EWAT质量(B)。*表示与LFD组的差异有统计学意义。N=6-7只/组。
在活的有机体内通过进行IAGT试验来确定胰岛素的作用，该试验在与胰岛素耐量试验更相关的血糖水平上检测饮食诱导的胰岛素抵抗。在IAGT试验中，喂食高脂食物的小鼠血糖值高于喂食低脂食物的小鼠，表明存在饮食诱导的胰岛素抵抗(图2A和2B)。在用CO治疗的HFD小鼠中，与用室内空气治疗的HFD小鼠相比，IAGT试验期间的血糖水平相似(图2A和2B)，这表明在已有饮食诱导肥胖的小鼠中，CO治疗并不能改善胰岛素抵抗。
图2。在喂食HFD的小鼠中，CO治疗不能改善胰岛素辅助葡萄糖耐量(IAGT)。小鼠同时注射2.0 U/Kg胰岛素和2.0 g/Kg葡萄糖，并在基线和注射后20、40、60分钟评估血糖值(A)，计算IAGT曲线下面积(B)。*表示与LFD组差异有统计学意义。N=6-7只/组。
因为CO治疗，无论是通过吸入气体还是通过CO释放分子，都会增加HO-1的表达和活性[8,17,20]，我们以EWAT中的HO-1 mRNA表达作为阳性对照，以证明我们的CO气体治疗方案在脂肪组织中是有效的。正如预期的那样，用CO气体(250 ppm, 1小时/天)处理小鼠6周后，喂食HFD的小鼠的EWAT中HO-1 mRNA表达显著增加(图3)。
图3。CO处理增加了喂养HFD小鼠脂肪组织中的HO-1 mRNA水平。采用real - time PCR方法检测LFD、HFD和HFD- co小鼠EWAT中HO-1 mRNA水平。*与LFD组差异有统计学意义。+表示与HFD组差异有统计学意义。N=4-5只/组。
Rev-erb -α是一种气体响应性转录抑制因子，已被证明可调节昼夜节律、代谢和肥胖[10,13,14]。因为CO被认为可以结合Rev-erb并促进[10]的转录抑制，我们检测了的mRNA表达Rev-erb -α在EWAT中的靶点，来自已经有饮食诱导肥胖的小鼠，这些小鼠接受了6周的一氧化碳治疗。CO处理未改变其表达Rev-erb -α靶标Bmal1, Pparγ和Pgc-1α(图4A-4C)。自Rev-erb -α抑制其自身表达，我们评估了其mRNA表达对CO处理的响应，并没有观察到显著变化(图4A)。这些发现表明在活的有机体内CO处理不改变建立的表达Rev-erb -α目标小鼠已确定的饮食诱导肥胖。
图4。CO处理不改变小鼠脂肪组织中Rev-erb-α和Rev-erb-α靶点的表达。mRNA的水平Rev-erb -α(A)、Pparγ (B)、Pgc-1α (C)和Bmal1 (D)分别从LFD、HFD和HFD- co小鼠的EWAT中定量，方法详见real - time PCR。*与LFD组差异有统计学意义。N=5-7只/组。
目前的研究检查了慢性一氧化碳治疗对肥胖、胰岛素作用和表达的影响Rev-erb -α目标小鼠已确定的饮食诱导肥胖。我们观察到，与用空气处理的hfd喂养的小鼠相比，用CO处理的hfd喂养的小鼠的体重和EWAT质量评估的脂肪没有显著变化。此外，慢性CO治疗并没有改善hfd诱导的胰岛素抵抗，因为在IAGT测试中，HFD-CO和对照组小鼠的血糖值几乎相同。最后，表达Rev-erb -α每日接受CO治疗的小鼠的EWAT靶点没有改变。然而，CO处理增加了脂肪组织中HO-1 mRNA的水平，从而解除了HO-1、胰岛素敏感性和体重减轻[3]之间的关系。
CO是HO-1酶活性的产物，被认为可以介导HO-1基因过表达时胰岛素作用的改善和体重减轻[3-6]。在此背景下，本研究最有趣的发现是观察到CO治疗增加了HO-1 mRNA的表达，而不改变胰岛素作用或肥胖。我们目前的观察是独特的，不同于通过给药金属卟啉增加HO-1表达导致体重减轻的研究[3,21,22]。重要的是，金属卟啉降低肥胖和提高胰岛素敏感性的能力似乎依赖于HO-1的诱导，因为HO-1抑制剂亚锡介卟啉消除了金属卟啉介导的体重下降[3]。然而，其他研究支持我们缺乏CO介导的HO-1 mRNA表达增加对胰岛素作用和肥胖的影响。例如，脂肪组织中HO-1的过表达不会改变hfd诱导的肥胖或小鼠的胰岛素抵抗[23]，而HO-1的表达是人类代谢疾病[24]的一个强有力的预测因子。目前的研究提供了更多的证据，至少通过CO吸入诱导HO-1表达不足以改善胰岛素作用或减少肥胖。
我们的研究结果表明，慢性CO吸入不能改善hfd诱导的肥胖和胰岛素抵抗，这可能与CO的给药方式有关。Hosicket al。证实了一氧化碳释放分子促进减肥和改善胰岛素作用[8]。尽管吸入CO 10周可减轻体重，但这种效果是短暂的，在35周时完全消失。有趣的是，目前的结果显示，每天吸入CO约6周(每天1小时，持续40天)对肥胖小鼠的体重或胰岛素作用没有影响。很难调和我们的发现与Hosick的发现之间的差异et al。(8、9)。由于CO的一些有益作用是由活性氧[25]的增加介导的，这种反应可能在体重稳定肥胖的小鼠中被取消，因为活性氧[26]的水平已经很高。最后，本研究和Hosick的研究缺少CO效应et al。[9]可能与通过吸入而不是通过CO释放分子[8]输送气体有关，特别是因为CO气体主要与血红蛋白结合运输，而CO释放分子到达不依赖血红蛋白的组织。然而，我们观察到，在CO吸入处理后，脂肪组织中HO-1的表达显著增加，这表明CO有效地向细胞传递[8 17,20]，尽管我们没有直接测量组织CO含量或评估其他组织中CO作用的标记物。未来的工作需要确定吸入一氧化碳与一氧化碳释放分子之间不同反应的机制。
本研究还验证了CO会发生变化的新假设Rev-erb -α依赖基因表达。Rev-erb -α是一种核受体，被认为是一种气体响应转录因子，调节昼夜节律和代谢[10,13,14,27]。最近，一种Rev-erb激动剂被证明可以促进减肥并抑制PGC-1α mRNA的表达Rev-erb -α[14]。先前的研究表明，E75是一种与人类同源的果蝇Rev-erb -α，结合CO和NO[10]。随后在培养的HEK 293T和HepG2细胞中进行的研究证实了CO和NO结合Rev-erb -α而CO对表达的影响不大Rev-erb -α目标相比没有[27]。目前的研究清楚地表明，一氧化碳吸入不会改变的表达Rev-erb -α肥胖小鼠脂肪组织中的靶点。气体输送方法不可能解释CO处理对表达的无效Rev-erb -α因为CO吸入可刺激骨骼肌中PGC-1α依赖基因的表达和肝脏中的抗炎信号[17,28]。此外，我们观察到经CO处理的hfd喂养的小鼠脂肪组织中HO-1 mRNA的表达增加。然而，肥胖小鼠可能对CO作用有抵抗能力，因为我们观察到经CO处理7天的瘦小鼠脂肪组织中胰岛素作用和PGC-1α显著下降(未发表数据)。
我们已经证明，尽管HO-1 mRNA水平增加，但CO治疗并不能逆转饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗。此外，CO处理不改变表达Rev-erb -α目标或Rev-erb -α本身。未来的研究将检查CO释放分子对体重稳定型肥胖的影响Rev-erb -α是必要的。因为NO结合Rev-erb -α的亲和力，未来的研究询问硝酸盐供体对肥胖和表达的影响Rev-erb -α目标是需要的。
THR是设计和指导研究各个方面的主要研究者。TB、RM和BS都通过进行实验、分析数据和创建数字对手稿做出了贡献。TB和RM协助准备提交的手稿。
这项工作得到了美国国立卫生研究院1 R15 DK090722-01的支持，Skidmore学院机会基金赠款和Skidmore学院夏季研究赠款。
版权所有OAT。版权所有作者声明他们没有经济或非经济上的竞争利益。
Sharma S Prabhakar
德克萨斯理工大学健康科学中心
研究文章
收稿日期:2016年4月17日
录用日期:2016年5月28日
发布日期:2016年5月31日
©2016 Brodsky T.这是一篇基于创作共用署名许可条款发布的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
Brodsky T, McLoughlin R, Sell B, Reynolds IV TH(2016)慢性一氧化碳治疗对饮食诱导肥胖和脂肪组织中rev - erbb - α靶基因表达的影响。综合肥胖糖尿病2:doi: 10.15761/碘.1000152
斯基德莫尔学院健康与运动科学系，萨拉托加斯普林斯北百老汇815号，纽约州12866，电话:(518)580-8349，传真:(518)580-8356
图1。一氧化碳治疗不能减少小鼠饮食诱导的肥胖。在CO治疗期间的各个时间点评估体重(A)。在治疗期结束时评估EWAT质量(B)。*表示与LFD组的差异有统计学意义。N=6-7只/组。
图2。在喂食HFD的小鼠中，CO治疗不能改善胰岛素辅助葡萄糖耐量(IAGT)。小鼠同时注射2.0 U/Kg胰岛素和2.0 g/Kg葡萄糖，并在基线和注射后20、40、60分钟评估血糖值(A)，计算IAGT曲线下面积(B)。*表示与LFD组差异有统计学意义。N=6-7只/组。
图3。CO处理增加了喂养HFD小鼠脂肪组织中的HO-1 mRNA水平。采用real - time PCR方法检测LFD、HFD和HFD- co小鼠EWAT中HO-1 mRNA水平。*与LFD组差异有统计学意义。+表示与HFD组差异有统计学意义。N=4-5只/组。
图4。CO处理不改变小鼠脂肪组织中Rev-erb-α和Rev-erb-α靶点的表达。mRNA的水平Rev-erb -α(A)、Pparγ (B)、Pgc-1α (C)和Bmal1 (D)分别从LFD、HFD和HFD- co小鼠的EWAT中定量，方法详见real - time PCR。*与LFD组差异有统计学意义。N=5-7只/组。
