看看最近的文章

摘要

腺病毒(AdV)是一种具有双链DNA基因组的非包膜病毒。牛AdV是腺病毒家族的一员，负责腺病毒感染。在本研究中，对BAV304a重组腺病毒进行了修饰，使其携带绿色荧光标记，随后将其添加到新鲜成熟培养基中或微量注射到牛卵母细胞的细胞质中。用荧光显微镜观察腺病毒感染牛卵母细胞和卵丘细胞，并用聚合酶链反应进行验证。进一步分析表明，腺病毒感染对牛卵母细胞成熟过程中第一极体挤压和卵母细胞裂解率无显著影响。我们的数据表明，透明带在牛卵母细胞抵抗BAV304a腺病毒中起着至关重要的作用，也表明卵母细胞可以保护自己免受非自身物质的侵害。

关键字

腺病毒;牛卵母细胞;cumulus-oocyte情结;透明带

简介

腺病毒(AdV)是一种具有线性双链基因组的非包膜病毒。AdV在各种哺乳动物细胞中具有很强的传染性，并能在大多数哺乳动物细胞和组织中表达蛋白。AdV感染几乎所有类型的细胞，包括一些抗AdV感染的淋巴瘤细胞。先前使用基因表达不扩散模型系统的研究表明，adv可以转化细胞和原代细胞。这些实验结果直接进行了比较。

AdV于1953年首次在培养的健康腺组织中被发现。目前，已有100多种AdV被确认具有感染人类、哺乳动物和鸟类的能力。AdV可感染呼吸道、眼结膜、胃肠道、尿道等器官细胞。在这些器官中，呼吸道是AdV的主要攻击目标，其次是呼吸道合胞病毒，AdV引起的婴儿病毒性肺炎的比例非常高。AdV感染引起的腺病毒性肺炎是婴儿肺炎中最严重的类型之一。AdV还可诱发恶性肿瘤，改变细胞功能，可用于研究动物肿瘤发生机制[2-4]。AdV也用于在体外基因转导,在活的有机体内疫苗接种，基因治疗，以及其他领域。

透明带是卵母细胞周围的保护性外层，充当主要由卵母细胞或其他细胞分泌的糖蛋白组成的“外衣”。这一层保护脆弱的卵母细胞和胚胎免受外部损伤，并防止精子细胞[5]进入。

近来，AdV在体细胞中的感染被广泛研究[6-8]。然而，这些研究仅集中在体细胞上，因为AdV感染卵母细胞的报道很少，而AdV感染牛卵母细胞的报道从未见过。在本实验中，牛卵母细胞的第一极体放电和囊胚率表明AdVs能够感染牛卵母细胞。

材料与方法

试剂

Medium 199和胰岛素-转铁蛋白-硒购自Gibco BRL (Gaithersburg, MD, USA)。丙酮酸钠、牛血清白蛋白(BSA)、EGF、β -雌二醇、l -谷氨酰胺、尿嘧啶、碳酸氢钠、HEPES、矿物油、离子霉素、透明质酸酶、细胞松质蛋白B、6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)采购自Sigma-Aldrich(圣路易斯，MO，美国)。裂解培养基和血清蛋白替代品来自Sage Biopharma (Bedminster, NJ, USA)。胎牛血清购自Hyclone公司。细胞直接试剂盒和Super Script III细胞直接cDNA合成系统购自美国Invitrogen公司。

卵丘-卵母细胞复合物(COC)收集

采集牛卵巢，在当地屠宰场屠宰后6-8小时内，用保温瓶与生理盐水(0.9% NaCl, 100 IU/mL青霉素，100 mg/mL链霉素)在20°C至24°C运输到我们的实验室。用同样的盐水溶液洗卵巢三次，并预热至37°C;然后使用10ml注射器和12-ga无菌针从直径为2- 6mm的卵泡中收集积丘-卵母细胞复合物(COCs)。滤泡液在无菌离心管中聚集;用COC洗涤液(含10% NBS的培养基199,2.2 g/L碳酸氢钠，10 mmol/L HEPES;pH 7.2-7.4)预加热至37°C，随后分布在60mm细胞培养皿中。在体视显微镜下选择具有多层积丘细胞的COCs进行体外受精。

体外COC培养

COCs在38.5°C的成熟介质中，在5% CO的潮湿气氛中洗涤三次₂在500 mL成熟培养基(含10% BSA、0.1 IU/mL人绝经期促性腺激素、1.0 mg/mL β -雌二醇、50 ng/mL EGF、50 mg/mL尿嘧啶、10 mL/mL胰岛素-转铁蛋白-硒的培养基199)中培养2小时。随后，将COCs在新鲜成熟培养基中培养，重组BAV304a AdV经过修饰，在MOI为0.1时携带绿色荧光标记。在同样的溶液中培养无带蛋白COCs作为对照。成熟介质在CO中平衡₂孵育至少2小时后进行成熟培养。

微量注射BAV304a AdV溶液

从卵巢中采集卵母细胞，在成熟培养基中培养2小时，轻轻剥离周围过多的卵丘细胞。仅使用具有完整卵丘的卵母细胞。将BAV304a重组AdV溶液微量注射到卵母细胞的卵浆中，对照卵母细胞注射等量水。然后将卵母细胞转移到新鲜成熟培养基中20分钟并清洗三次。只有存活的卵母细胞在新鲜的成熟培养基中培养10小时。

卵母细胞成像

活细胞用蔡司显微镜观察。活卵母细胞在含BAV304a AdV的成熟培养基中孵育，MOI为0.1。用电荷耦合器件(CCD)摄像机(Axiocam MRm;卡尔蔡司，上海，中国)连接到蔡司显微镜。

PCR验证

将卵母细胞直接加入10 μL重悬浮缓冲液中提取总RNA，再用1 μL RNaseout在75℃下处理10 min。通过反转录获得cDNA模板。采用双PCR法检测提取液中的AdV, PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

统计分析

每个试验至少3个重复的数据采用卡方检验进行分析。不同的P< 0.05(*)和P< 0.01(**)分别为显著性和极显著性。

结果

通过共同孵育，BAV304a AdV感染卵丘细胞，但不感染卵母细胞

首先，将COCs与BAV304a AdV溶液在新鲜成熟培养基中共孵育。培养7小时后，积丘细胞可见绿色荧光在体外，但在卵母细胞中未检测到荧光(补充材料)。20h后，COCs完成减数分裂I期，挤压出第一极体。此时在积丘细胞中观察到的荧光信号较强(图1A，图1B)。当使用0.3%透明质酸酶将卵母细胞与周围的卵丘细胞分离时，荧光消失(图1C，图1D)。对实验组和对照组的第一极体挤压率(PB1E)进行了研究和比较。从卵裂培养基中取出卵母细胞进行孤雌生殖发育后，仍未发现绿色荧光(图1E，图1F)。此外，实验组的解理率较低，但这一发现与对照组无显著差异(表1)。

表1。各组卵母细胞成熟情况。

集团	PB1E率(%)	4至8个细胞期胚胎率(%)
正常对照组	82	40
腺病毒培养组	77	38
腺病毒注射组	52	11
注水组	56	13

OAT版权所有。版权所有

图1所示。通过共孵育，BAV304a AdV感染卵丘细胞，但不感染卵母细胞。

(A)亮场COCs，比例尺= 400 μM。(B)荧光COCs，比例尺bar = 400 μM。(C)在亮场，去除周围的积丘细胞的COCs，比例尺= 400 μM。(D)荧光法，去除周围有积云细胞的COCs，比例尺bar = 400 μM。(E)多细胞期卵母细胞的Brightfield，标尺bar = 200 μM。(F)多细胞期卵母细胞荧光，标尺bar = 200 μM。每个样本共收集100个卵母细胞，实验重复3次。

通过联合孵育，腺病毒感染无带卵母细胞

考虑到透明带阻滞BAV304a腺病毒在一定程度上，我们接下来研究了透明带是否在adv感染的卵母细胞中起重要作用。为了解决这个问题，我们首先去除积丘细胞。然后，COCs培养2小时后，在pronase溶液中进行无带程序。裸卵母细胞在新鲜成熟培养基中以BAV304a AdV溶液孵育。20小时后，少数卵母细胞检测到绿色荧光(图2A，图2B)。

图2。AdV联合孵育无带卵母细胞(A)亮场无带卵母细胞，比例尺= 400 μM。(B)荧光无带卵母细胞，标尺bar = 400 μM。

通过微量注射，BAV304a AdV感染卵母细胞和卵丘细胞

微量注射BAV304a AdV溶液后，将COCs移至新鲜成熟培养基中培养。10h后卵母细胞及周围卵丘细胞出现绿色荧光。但与周围的卵丘细胞相比，卵母细胞内的荧光强度要弱得多(图3A，图3B)。在去除周围卵丘细胞后的卵母细胞(图3C，图3D)和多细胞期的卵母细胞(图3E，图3F)中也可见荧光。注射AdV溶液的卵母细胞与注射水的对照组卵母细胞的PB1E率相似。实验组和对照组成熟卵母细胞经刺激进行孤雌分裂后置于卵裂培养基中数小时，两组绿色荧光消失。两组卵裂率无显著差异(表1)。

图3。通过微量注射，BAV304a AdV同时感染卵丘细胞和卵母细胞

(A)亮场COCs，比例尺= 400 μM。(B)荧光COCs，比例尺bar = 400 μM。(C)在brightfield，去除卵母细胞及其周围的卵丘细胞，标尺bar = 100 μM。(D)荧光法，去除卵母细胞及其周围的卵丘细胞，标尺bar = 100 μM。(E)亮场多细胞期卵母细胞，标尺bar = 400 μM。(F)荧光多细胞期卵母细胞，标尺bar = 400 μM。每个样本共收集100个卵母细胞，实验重复3次。

PCR验证

收集微注射共培养的无带卵母细胞和卵丘细胞进行cDNA提取。荧光标记基因在微注射卵丘细胞、共培养卵丘细胞、微注射卵母细胞和无带卵母细胞中被发现(图4)。下面的步骤详细描述了cDNA的PCR验证。第一次PCR反应为cDNA模板0.5 μL，上下游引物各0.3 μL, 2×TaqMis, 3.9 μL无菌H₂O.初始变性发生在94°C 5 min，随后进行35个循环，94°C 40 s, 52°C 30 s, 72°C 45 s进行扩增。72℃扩增5min, 12℃孵育10min。第二次PCR反应包括PCR产物0.5 μL，上下行引物各0.4 μL, 2×TaqMis, 3.7 μL无菌H .₂O.初始变性发生在94°C 5 min，随后进行35个周期，94°C 30 s, 51°C 30 s, 72°C 30 s。72℃延伸5 min, 12℃孵育10 min。反应结束后，用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析。

图4。卵母细胞PCR验证。以D2000作为标记。1.微注射积丘细胞。2.共培养的积丘细胞。3.microinjected卵母细胞。4.培养卵母细胞。 5. zona-free oocytes. 6. water.

讨论

牛卵母细胞对AdV表现出一定程度的抗性，可能是因为卵母细胞能够保护自己免受非自身物质的侵害。卵母细胞耐药也与AdV的致病性和透明带提供的保护有关。透明带是卵母细胞周围由糖蛋白组成的非细胞层，它保护卵母细胞，防止异质精子进入，从而保护卵母细胞和胚胎免受外部损伤。

在本研究中，对BAV304a AdV进行了修饰，使其携带绿色荧光标记。在新鲜成熟培养基中加入BAV304a AdV，将该溶液微量注射到牛卵母细胞的细胞质中。共培养后，卵丘细胞呈绿色，卵母细胞不变。而在无带细胞中，腺病毒感染卵母细胞，部分卵母细胞呈绿色。这表明牛透明带阻断了BAV304a腺病毒的感染。微量注射后，卵母细胞和卵丘细胞均可见绿色荧光。这一发现表明，部分腺病毒从牛卵母细胞逃逸，随后感染卵丘细胞。这种现象可能是由于透明带损伤引起的。微量注射是一种物理方法，可能会影响透明带的功能，削弱其对adv的抵抗力。此外，这些结果通过PCR验证得到了证实。总的来说，这些结果表明透明带在牛卵母细胞抗BAV304a AdV中起着至关重要的作用。

在另一项研究中，小鼠卵母细胞与Pbr322HBV BAV304a质粒共培养，并通过PCR、FISH和Southern blot进行评估。结果显示，只有36只鸡蛋检测出HBV DNA[9]阳性。张庆健的研究也表明卵母细胞对非自身物质具有一定的抗性。在我们的实验中，当AdV注射到卵母细胞细胞质中时，卵母细胞中的荧光强度比周围的卵丘细胞弱得多。此外，通过共孵育，AdV感染了一小部分无带卵母细胞。这说明卵母细胞在一定程度上对AdV具有抗性，可能是因为卵母细胞对非自身物质有保护作用[视频]。

牛卵母细胞从GV期到8细胞期转录静止。而BAV304a AdV感染后卵母细胞中有绿色荧光蛋白表达。这一发现表明BAV304a AdV利用卵母细胞中的转录因子产生AdV mRNA。这一结果也表明转录因子是可用的，牛卵母细胞的转录静止是由于DNA在减数分裂期间以染色质的形式储存。

在我们的实验中，与牛卵母细胞成熟培养基和牛AdV共孵育的卵母细胞复合物与正常卵母细胞相比，第一极体放电率和囊胚率无明显差异。此外，微量注射牛AdV的卵母细胞与用水注射的对照组卵母细胞之间没有显著差异。因此，牛AdV感染不影响卵母细胞的正常成熟和囊胚的形成。牛AdV的毒力也可能与此有关。

我们的实验结果表明，牛AdV可作为进一步研究透明带的基础。此外，这些结果有助于描述卵母细胞中的病毒感染。

参考文献

1. Rowe WP, Huebner RJ, Gilmore LK, Parrott RH, Ward TG(1953)从组织培养中发生自发变性的人腺样体中分离出细胞致病因子。Proc Soc Exp Biol地中海84: 570 - 573。［Crossref］
2. 王晓燕，王晓燕，王晓燕，等(1999)牛疱疹病毒-1糖蛋白D在牛腺病毒-3早期4区转录图谱的表达。病毒学261: 143 - 152。［Crossref］
3. 马红，刘勇，刘松，徐瑞，郑东(2005)口服腺相关病毒- strail基因治疗抑制小鼠人肝细胞癌生长。肝脏病学42: 1355 - 1363。［Crossref］
4. 李志强，李志强(1954)急性呼吸道疾病患者新制剂的回收。实验生物医学85: 183 - 188。［Crossref］
5. blil JD, Wassarman PM(1980)透明带的结构和功能:小鼠卵母细胞透明带蛋白的鉴定和特征。开发生物76: 185 - 202。［Crossref］
6. Dicks MD, Guzman E, Spencer AJ, Gilbert SC, Charleston B，等。(2015)人类和黑猩猩腺病毒载体诱导的转基因特异性适应性免疫反应在实验动物和目标物种之间的相对大小不同。疫苗33: 1121 - 1128。［Crossref］
7. 李玉凯，付长忠，张玉玲，昝丽林(2015)秦川牛LYRM1基因重组腺病毒表达载体的高效构建。Genet Mol Res14: 9469 - 9477。［Crossref］
8. 张晓燕，张晓燕，张晓燕，等。(2016)腺病毒载体的口蹄疫病毒A24亚单位疫苗在牛体内的多效性研究。疫苗34: 3214 - 3220。［Crossref］
9. 张启军，黄廷生，谢启东(2004)重组质粒pbr322-hbv转染小鼠卵母细胞的研究。致癌、致畸、诱变16: 324 - 327。