摘要
关于患者遗传对药物药代动力学(药物吸收、分配、代谢和消除)患者如何处理药物)和药效学(药物反应)的影响的知识最近取得的大部分进展都归功于基因检测方法的技术进步以及大型临床数据集和生物库的参与。的确,全基因组关联研究(GWAS)和全表型关联研究(PWAS)以及不断发展的生物医学信息学技术和组学科学的扩展(例如,转录组学、代谢组学、蛋白质组学)给精准医疗带来了前所未有的进步。虽然更简单的候选基因分析技术并不被认为是前沿的,但它对药物基因组学研究的转化和精准医学的发展是可靠和重要的。利用生物合理性的知识(也就是说,基因突变→蛋白质产物功能的改变→药物药代动力学/动力学的改变)来适当地选择纳入的基因,候选基因分析技术不需要大量的患者队列或广泛的多基因遗传分析阵列。它通常是临床医生开始评估基因信息是否可能改善患者的药物治疗策略的理想方法。有了特定的患者群体和他们的医学亚专业的专业知识,内科科学家可以在小队列中实施候选基因分析。即使患者少于100人,结果通常也可以用来确定是否有必要进行进一步调查,并为未来的研究提供信息。在此,我们提出了关于收集、处理和适用于候选基因研究的有效实施的基因型检测的选择当代方法的比较。
简介
候选基因分析方法是理想的初步,探索性遗传关联研究的患者队列的有限规模,涉及有限的多态性在选定的基因数量。依靠已知的(或生物学上似是而非的)机制联系,将候选基因和多态性纳入分析,统计能力较少受到多重假设检验的大量修正(也就是说,增加分析中包含的基因/多态性数量→增加假设检验数量→增加对多个假设检验的修正/惩罚→增加维持统计能力所需的样本量),从而在较小的患者队列中提高分析有意义结果的可能性[1-4]。
候选基因分析的缺点包括:依赖于先前建立的疾病知识,需要生物信息学和数学算法来确定候选基因的状态,遗漏了基因的潜在影响,缺乏与感兴趣的表型的机制联系,只能覆盖有限的基因数量(少于1000个SNPs),假阳性率高,并受到不可重复性的困扰。尽管有这些缺点,候选基因分析可以用来补充GWAS,以检查和建立基因状态和表型表达之间的联系[1,4]。
虽然研究表明唾液的基因分型效率(每个唾液标本获得的总DNA产量)比血液低约3倍,但基因组DNA研究需要非常小的DNA产量来使用聚合酶链反应(PCR)扩增[5]进行候选基因分析。唾液样本是血液衍生DNA的一个很好的替代品,其整个唾液DNA纯度与血液提取的[6]相似。
唾液收集是一种快速、无创、容易收集(亲自或通过邮寄唾液收集包)的方法,也是一种相对廉价的基因样本收集方法,可用于简化研究的参与者需求[5,7-9]。研究参与者将被鼓励提供足够的样本,以获得足够的DNA产量[10]。
一个尚未解决的问题是长期储存高质量DNA的经济方法,这对基于人群的分子流行病学研究很重要。Sigurdson等人从唾液中收集了颊细胞DNA,并将其储存在处理过的过滤卡上,在-20℃、-80℃和室温三种不同的温度下保存了7年。经处理的颊细胞基因组DNA卡在储存7年后进行基因分型评估,并没有始终提供足够数量的基因组DNA[11,12]。
虽然DNA产量是分析唾液收集方法的一个非常重要的方面,但其他因素也必须考虑在内。与收集唾液样本相关的成本包括与购买试剂盒和用品相关的金钱投资,以及与分析遗传物质所需的时间相关的资源成本。无论一种采集方法的DNA产量有多高,都必须考虑其经济可行性。
由于越来越多的人接受唾液作为血液样本的可行替代品,市场上出现了大量商业化的唾液收集包。这些套件包含稳定缓冲液和提取方法,以确保易于收集方法的研究目的。一个很受欢迎的品牌,Oragene,已经被研究过,它的DNA产量约为40.4微克/毫升,在96%的唾液收集[12]中基因分型成功。本研究的目的是检查各种唾液收集试剂盒和实验室合成/提取方法,并在不牺牲质量的情况下比较效率和产量。
结果与讨论
DNA产量高于10 ng/mL被认为足够高,可以用PCR提取进行基因分型。从图2中可以看到,除了三个方法之外,其他方法都满足这个阈值。然而,尽管方法4、7和8检测到的DNA为零或低,但所有样本均使用PCR扩增,基因分型正确。
图1所示。比较100件和2000件的方法1-6的每件成本.方法7和方法8与方法2和方法3的成本相同,因此不包括在比较中
图2。比较每种方法的平均DNA产量。方法1产率最高,方法4产率最低
在Good中概述了一种收集和提取方法,等。古德[13],等。这篇论文概述了创建缓冲液的方案,声称它可以在市场上可用的试剂盒的一小部分上产生与之相当的DNA水平。古德,等。与四种市面上的唾液收集套件进行比较:Oragene Discover、Norgen Biotek、Accegen Aceseq和Oasis SimplOFy。所有套件都是从制造商那里作为样品寄出的。Oragene和Norgen的试剂盒作为整个过程使用;使用该公司的稳定缓冲液和提取方法提取DNA。Accegene和Oasis基于它们的稳定缓冲进行了研究。
用所有稳定缓冲液检测了第二种DNA提取方法。Zymo Quick-DNA Miniprep Plus Kit声称,它可以利用自旋柱从各种收集方法中提取DNA,包括组织、血液和唾液等不同类型的样本。这种试剂盒相对便宜,每次提取成本不到6美元。该方法用于观察不同的稳定缓冲液是否与为试剂盒开发的提取方法以外的提取方法兼容。
最便宜的方法是方法6,它将从Goode创建的稳定缓冲区配对,等。论文采用Zymo提取工艺。在较低的采购订单约100提取,每单位成本为9.68美元,每提取10美元以下的唯一方法。在较高的采购订单中,规模经济发挥了作用。Zymo提供的批量折扣以及批量购买其他用品(如试管和移液管)的成本降低,每单位成本为3.48美元,低于其他方法的三分之一。
用于时间比较,所有使用Zymo Quick-DNA middipress提取方法的方法都在半小时内完成。Norgen Biotek的过程也在这个长度左右。Oasis和Oragene稳定缓冲液在提取前需要初始孵育,这增加了时间。到目前为止,最长的过程是古德法,花了将近三个小时才完成。该提取方法要求样品离心多次,培养时间长。这导致了等待这些过程发生的大量停机时间。
所有市售和实验室合成的唾液收集试剂盒都能够通过PCR扩增产生基因分型结果。图3为一个样本的扩增图;所有样本都显示出类似的趋势。即使样品的DNA产量太低而不能被量子位荧光仪测量,也能够被扩增和正确的基因分型。
图3。PCR循环后的DNA扩增。所有样品均显示出类似的扩增图谱,且与DNA产量无关
易于使用的商业套件,因为大多数公司提供提取过程,同时提供套件收集。对于一个无法进入实验室的研究项目来说,这是一个有效的选择。然而,由于购买了商业上可用的工具箱,成本增加了,每次提取的成本约为10-20美元,这取决于购买的数量。
古德萃取法虽然比它的竞争对手便宜,但需要漫长而艰苦的提取过程,这可能也是一种有限的资源。Zymo快速dna中压提取试剂盒为Goode方法的长时间提取过程提供了一种廉价的解决方案。然而,这套装备也并非没有招致批评。由于试剂盒使用自旋柱,DNA样品中的任何污染物,如未溶解的蛋白质,都可能堵塞过滤器,降低DNA产量。与其他提取方法相比,该方法的DNA收率较低。这种方法虽然成本较低,但比较不稳定,不适合需要大DNA产量的项目。
也有人对本文中提到的比较唾液收集试剂盒的方法提出了批评。受唾液中DNA含量影响的DNA产量的变化,这可能因个体而异。两个人之间的平均数量不能被认为是每种方法实际DNA产量的精确测量。应该注意的是,即使是方法7,也提取了足够多的DNA,使PCR能够正确地扩增和基因分型。
acengen Aceseq和Oasis SimplOFy稳定缓冲液的DNA提取所需的缓冲液无法用于此比较。因此,没有收集到关于这些工具包的预期用途的结果。每个套件的成本与他们在Oragene和Norgen的竞争对手相当。因此,本文的信息只考察了Accengen和Oasis稳定缓冲液与Zymo快速dna Mediprep提取方法的通用提取方法的关系。
最后,本文没有研究不同方法对DNA提取和储存的长期影响。所有的方法都声称样品可以在4°C保存长达6个月,冷冻保存长达2年。这一点没有经过测试,也无法推断DNA样本的长期稳定性。
表1。方法、稳定缓冲区和所使用的提取协议
方法 |
稳定的缓冲 |
提取协议 |
1 |
古德等。 |
古德等。 |
2 |
Oragene发现 |
Oragene发现 |
3. |
一起Biotek |
一起Biotek |
4 |
Acceqen Aceseq |
Zymo快速dna |
5 |
绿洲SimplOFy |
Zymo快速dna |
6 |
古德等。 |
Zymo快速dna |
7 |
Oragene发现 |
Zymo快速dna |
8 |
一起Biotek |
Zymo快速dna |
表2。八种方法的收率、成本和时间数据的比较
方法 |
稳定的缓冲 |
提取方法 |
收益率(ng /μL) |
成本:100台 |
成本/单位 |
成本:2000台 |
成本/单位 |
时间(分钟) |
1 |
古德,et al。 |
古德,等. |
78.45 |
2274 .67元 |
22.75美元 |
22016 .99美元 |
11.01美元 |
150 |
2 |
Oragene发现 |
Oragene |
15.65 |
2141 .91点 |
21.42美元 |
31507 .91点 |
15.75美元 |
90 |
3. |
一起Biotek |
一起 |
26.80 |
1650 .56点美元 |
16.51美元 |
21065 .56点美元 |
10.53美元 |
20. |
4 |
Accegen Aceseq |
Zymo快速dna |
3.21 |
1615美元 |
16.15美元 |
21800美元 |
10.90美元 |
20. |
5 |
绿洲SimplOFy |
Zymo快速dna |
10.71 |
1488美元 |
14.88美元 |
26324美元 |
13.16美元 |
60 |
6 |
古德,et al。 |
Zymo快速dna |
21.15 |
967.61美元 |
9.68美元 |
6966美元。31 |
3.48美元 |
30. |
7 |
Oragene发现 |
Zymo快速dna |
- |
2468 .91点 |
24.69美元 |
36901 .91点 |
18.45美元 |
30. |
8 |
一起Biotek |
Zymo快速dna |
1.40 |
1877 .56点美元 |
19.78美元 |
26459 .59点 |
13.23美元 |
30. |
材料和方法
对五种采集方法和两种唾液提取方法进行了分析,共进行了8次比较,以确定效率的各种指标。这八项比较分别从四个类别进行了检验:(1)从每种方法提取的DNA产量,(2)小型采购订单的每单位成本(100个),(3)大型采购订单的每单位成本(2000个),以及(4)完成该协议所需的总时间。这八种不同的方法是结合了不同的DNA稳定缓冲液,自制的和商用的,以及提取方法。
DNA产量
DNA的比较在小范围内进行。两名志愿者为每种采集方法提供唾液样本,并取两种方法的DNA产量的平均值。每种采集和提取方法的使用说明均无偏差。
使用Invitrogen量子位荧光计按照公司标准的分析制备说明测定DNA产量。在测量任何一种方法的读数之前,量子比特都用空白重新校准。平均DNA产量记录为每微升毫微克。所有样本提取DNA后,用PCR法进行基因分型。
成本
通过检查与每种提取方法相关的材料来计算成本。从各公司获得的报价为小订单(100套件)或大订单(2000套件)。与额外供应(即试管,tris-EDTA存储缓冲)相关的成本是根据商业科学研究公司的目录计算的。然后将成本除以提取次数,得到单位价值的成本。
时间
时间的数量是完成一次提取所需时间的累积。这是从提取开始测量的,包括孵育和离心样品所需的所有时间。
鸣谢
作者感谢俄亥俄州立大学药物基因组学中心的领导和工作人员。这项工作得到了NIH拨款R01 MD的支持。
作者的贡献
JS、DW和JPK构思和设计了实验。JS进行了实验和数据分析。JS、DW、SRT、JPK对分析结果进行解读并撰写文章。
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