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摘要

目的:子宫内膜异位症是一种慢性、雌激素依赖的良性疾病，其特征是子宫外存在子宫内膜组织。营养补充剂对子宫内膜异位症相关症状的益处已被描述。本研究的目的是评估在活的有机体内益生菌对子宫内膜异位症的发展和疼痛的影响。

方法:我们使用子宫内膜异位症小鼠模型，口服1 (P1;酿酒Boulardii)或两种益生菌(P2:酿酒Boulardii+嗜酸乳杆菌)，为期4或12周。通过超声观察病变的生长情况，行为学和qRT-PCR观察小鼠的疼痛程度，FACS和ELISA技术观察小鼠的免疫状况。

结果:治疗4周和12周后，我们观察到病灶的体积和大小明显降低。临床结果显示，在W4时，只有p1处理小鼠的热敏性降低，而p2处理小鼠的触觉敏感性升高。血清中反映蛋白质氧化的AOPP水平在W12时被所有处理显著降低。血清zonulin(肠屏障通透性的标志)、促炎因子IL-6和TNF-α水平均在P1和P2处理后显著降低。

结论:一种或两种益生菌治疗对子宫内膜异位症的临床、免疫和生理指标有不同但都有利的影响。由于它对疼痛的效果更好，而且更容易操作，酿酒boulardii似乎更适合作为子宫内膜异位症的新治疗策略。

关键字

子宫内膜异位症，益生菌，炎症，疼痛，博氏酵母菌，嗜酸乳杆菌

介绍

子宫内膜异位症是一种慢性、雌激素依赖的良性疾病，其特征是子宫外存在子宫内膜组织。异位组织由子宫内膜上皮和间质组成，其生长依赖激素，并响应与异位子宫内膜相同的周期变化。子宫内膜异位症的患病率在育龄妇女的一般人群中从6%到10%不等，在盆腔疼痛和/或不孕的妇女中从35%到50%不等[1]。它的频繁发生使它成为一个真正的公共卫生问题。其发病机制主要涉及慢性炎症、氧化应激和纤维化。最被接受的子宫内膜异位症的病因机制是子宫内膜组织通过逆行月经流从子宫传播到腹腔。由于月经逆行的现象涉及大多数月经周期的女性，这表明个体的易感性是有牵连的。例如，异位和/或异位子宫内膜的内在特异性改变获得了高存活能力、侵袭性和增殖能力[2]，以及异位细胞的免疫清除缺陷。最近有研究表明，子宫内膜异位症中的异位着床可能是由炎症增加和适应性T调节细胞的启动引起的，从而导致细胞毒性受损和免疫抑制增强[3]。子宫内膜异位症的病理生理非常复杂，目前仍知之甚少[4]。 Medical treatments based on hormonal therapies are neither always effective nor free of side effects [5]. The radical surgical treatment of endometriosis lesions has shown its effectiveness but presents a real risk of complications [6]. Patients with endometriosis are at high risk of several chronic diseases, such as autoimmune diseases, cancer, asthma/atopic diseases, cardiovascular diseases [7] and inflammatory bowel diseases [8].A better understanding of the mechanisms of endometriosis would pave the way for new medical treatments.

最近的一项综述[9]描述了额外摄入脂肪酸、抗氧化剂以及维生素和矿物质组合对子宫内膜异位症相关症状的益处。需要更多的研究来证明食品或营养素对缓解子宫内膜异位症的功效，并关注其相对量[9]。动物肠道是一个由宿主细胞、微生物群和可用营养物质组成的复杂生态系统，微生物群通过免疫调节来预防人类和动物的几种退行性疾病。益生菌是一种有益健康的微生物菌株，它们的潜力最近导致了它们用于调节肠道微生物群的研究兴趣的显著增加[10]。肠道菌群参与多种免疫、代谢和营养吸收功能，这些功能对宿主体内平衡至关重要[11,12]。肠道菌群有助于先天免疫和适应性免疫[13,14]。肠道微生物代谢物在炎症信号传导中发挥关键作用，直接或间接与宿主免疫细胞相互作用。它们阻止机会致病菌的定植，并参与维持肠上皮屏障[15]。

肠道和阴道微环境之间的双向相互作用已得到证实，但尚未得到充分研究。一些微生物在胃肠道和生殖道都有定植，证明了这些微生物群之间的相互作用。摄入乳酸杆菌和益生菌已被证明会引起阴道细菌群落的变化，以及炎症反应[16]。这为阴道和胃肠道微生物组之间的相互作用提供了证据，并支持了口服益生菌可能减少一些阴道感染和细菌性阴道病的主张[17,18]。口服益生菌可以调节阴道内促炎细胞因子的表达，进而通过作用于细菌和免疫介质(包括巨噬细胞、淋巴细胞和树突状细胞)改变肠道内的炎症状态。肠道和女性生殖道微生物群都会产生发酵副产物，影响局部免疫反应，具有全身性。

本研究的目的是评估在活的有机体内口服益生菌对子宫内膜异位症发展的影响，还有对病变引起的疼痛的影响。在子宫内膜异位症病理过程中发生的疼痛可能是伤害性的、炎症性的、神经性的或这些的混合[19]。疼痛的体验是复杂的，涉及周围神经系统和中枢神经系统之间的许多机制和相互作用[20]。最近的研究表明，患有子宫内膜异位症相关疼痛的女性外周血管和中枢神经系统都发生了改变[20,21]。口服特定的乳酸菌菌株可以介导肠道的镇痛功能，类似于吗啡的作用[22]。肠道微生物可影响内脏知觉，可用于治疗子宫内膜异位症引起的腹痛。

因此，我们采用小鼠子宫内膜异位症模型(同种子宫角腹膜移植模型)。我们评估的影响酿酒Boulardii和博氏酵母菌/嗜酸乳杆菌每个操作系统小鼠子宫内膜异位症的进化。研究人员已经对这两种益生菌进行了研究，以确定它们对子宫内膜细胞的影响在体外．然而，它们对腹膜内子宫内膜异位症病变的影响需要在整个生物体中进行研究，以评估其效果在活的有机体内益生菌摄入对腹腔病变生长、疼痛及免疫反应的影响。最终，该项目的目标是能够提出使用益生菌治疗子宫内膜异位症的新策略。

材料与方法

子宫内膜异位症小鼠模型

本研究采用的子宫内膜异位症模型在其他文献中已有描述[23,24]。该模型是在免疫功能正常的小鼠体内同种移植子宫角，产生子宫内膜异位症样病变。6周龄Balb/C Jrj雌性小鼠购自供应商Janvier Labs (Route du Genest, 53940 Le Genest- saint - isle)。这些小鼠被安置在一个传统的动物设施(N°C75-14-05 / DTPP 2014-208)中，有12小时的自动昼夜循环，随意饮用(自来水)和食物(法国甘纳特的Teklad, Envigo, Gannat， # T.2016MI.12)。该项目严格遵守欧洲动物实验准则。同种腹腔角植入(缝合)子宫内膜异位症小鼠模型是我们实验室验证并发表的一种模型。子宫角在异氟醚(3.5%，氧气2.5 l / min)麻醉下腹腔内植入，术后镇痛(Buprecare, 10µg / kg, sc)。开腹手术后，用5/0可吸收的手术线缝合两针，将碎片固定在开口两侧的腹膜内壁上。

益生菌治疗

用于治疗的分子和产品有:锌-双甘氨酸螯合物(ALBION Laboratories, Clearfield, USA， # 03506)、Gomme Acacia Seygal (Nexira Food, France Rouen， #FibregumB)、反式白藜芦醇(Active Inside, Beychac and Caillau, France， # PR-0018)、姜黄素(Wacker, Eddyville, IA, USA， # 60072151)、Saccharomyces Boulardii (LHC Lesaffre Bio Springer, Maison Alfort, France， # VI1700368)、Lactobacillus ophilus (Danisco US, Madison, WI, USA， #MSAMPHRUDOPH)。确切的成分是Gynov协会(波尔多，法国)的专利配方。

不含益生菌P0(31.89%双甘氨酸锌，32.52%金合子胶，14.24%反式白藜芦醇，21.35%姜黄素)和益生菌P1或P2每个操作系统每周5天，200µl, 4周(4W)或12周(12W)。对照组和处理组分别为:未植入物不处理的小鼠(Sham)、植入物和载药组(P0组)或载药+ 1种益生菌(P1组:18mg / kg博拉迪酵母菌)、载药+ 2种益生菌(P2组:18mg / kg博拉迪酵母菌+ 9mg / kg嗜酸乳杆菌)。

植入后4周或12周，采用颈椎脱位法处死。取血、子宫内膜异位症病变及脾脏作进一步分析。

实验开始时，每组小鼠数量分别为:Sham, n = 8 - P0, n = 11 - P1, n = 15 - P2, n = 15。对于W4的第一个牺牲，我们使用:Sham, n = 5 - P0, n = 5 - P1, n = 10 - P2, n = 10。对于W12的第二次牺牲，我们使用:Sham, n = 3 - P0, n = 6 - P1, n = 5 - P2, n = 5。

超声监测

如前所述，在全身麻醉下通过超声监测病变体积的演变，以确认植入物的生存能力并测量其大小[25]。高分辨率超声(40mHz)允许以精确、无创的方式跟踪子宫角植入物大小的演变，并快速评估子宫内膜异位症的进展。该手术在植入角碎片后的W1, W3, W8, W11在PIV(法国巴黎科钦研究所小动物成像)进行。

免疫组织学

子宫内膜异位症模型的有效性通过子宫内膜异位症病变的组织学评估得到证实。腺细胞和基质细胞的存在证实了子宫内膜异位症模型。子宫内膜异位症植入物在牺牲后通过手术取出并称重，然后用10%的甲醛固定一半并放入石蜡中。将样品切成5µm厚的切片，用H&E染色。该方法在Histim(法国巴黎科钦研究所免疫组织学平台)进行。

体内热感觉亢进

在4周或12周益生菌治疗期间，每周评估子宫内膜异位症小鼠模型的热感觉亢进，平均超过2周。将每只小鼠置于恒温的金属表面[26](BIOSEB公司的冷/热板)上，温度为+ 50°C±0.2°C。在子宫内膜异位症诱导手术前一周，实验人员对小鼠进行操作。每次实验前，将小鼠置于实验结构环境中适应10分钟，然后将其单独置于有机玻璃围护板内的热金属表面。为了不降低小鼠的神经敏感性，决定将小鼠暴露在热板上最多1分钟。反应潜伏期，这是时间，直到研究者观察到一个积极的恶意行为，被记录。攻击性行为包括前爪退缩或舔舐，后爪退缩或舔舐，跺脚，倾斜姿势和跳跃。这种反应被认为是积极的，当老鼠延迟抬起它的脚或疯狂地舔它的爪子来冷却它是明显不同的。

体内触觉感觉减退

子宫内膜异位症小鼠每两周通过手工Von Frey试验评估腹部触觉敏感性。点状机械异常性痛和痛觉过敏可以通过应用不同力的von Frey纤维来评估。将合成单丝垂直于被测表面，施加恒定的预定力(小鼠通常为0.2-13.7 mN) 2-5秒。如果动物表现出任何有害的行为，包括在刺激过程中或在灯丝被移除后立即迅速收回爪子、舔爪子或摇晃爪子，则反应被认为是积极的。虽然后爪足底表面是最常用的测试区域，但也可以使用身体的其他区域，包括腹部[27]。我们采用“上升刺激”法测定手动Von Frey的机械灵敏度。

将引起一组小鼠有害反应的单丝大小的平均值与假手术组小鼠的平均值进行比较，当存在显著差异时视为阳性。

中存在

手术切除后，一半的病变立即冷冻在液氮中。根据制造商的说明，使用Trizol试剂(Invitrogen, Carlsbad, USA)从小鼠组织(子宫内膜异位症样病变)中提取总RNA。

扩增的基因有:col1(胶原蛋白1)[28]、Ptgs2/cox2(环氧化酶2)、nrf(神经生长因子)、igf1(胰岛素生长因子1)、Pecam1/cd31。利用Maxima H Minus cDNA Synthesis Master Mix试剂盒(Thermo Fisher Scientific)合成cDNA。使用SensiFAST SYBR No-ROX试剂盒(Bioline)进行qPCR。通过校准样品(串行稀释)，在所选基因的转录水平在LightCycler480®(Roche, San Francisco, CA)中进行量化，并在LightCycler480软件中归一化为两个参考基因(actib和Tbp)。qPCR引物序列为Ptgs2 = Cox2, Pecam1 = Cd31:

mm-Col1a1_F	CCGAACCCCAAGGAAAAGA
mm-Col1a1_R	CTGTTGCCTTCGCCTCTGA
mPtgs2-F	TGAGCAACTATTCCAAACCAGC
mPtgs2-R	GCACGTAGTCTTCGATCACTATC
mPecam1-F	CTGCCAGTCCGAAAATGGAAC
mPecam1-R	CTTCATCCACCGGGGCTATC
mTbp-F	AGAACAATCCAGACTAGCAGCA
mTbp-R	GGGAACTTCACATCACAGCTC
m-bActin-F	ACCACCATGTACCCAGGCATT
m-bActin-R	CCACACAGAGTACTTGCGCTCA
m-Ngf-F	CCAGTGAAATTAGGCTCCCTG
m-Ngf-R	CCTTGGCAAAACCTTTATTGGG
m-Igf1-F	CTGGACCAGAGACCCTTTGC
m-Igf1-R	GGACGGGGACTTCTGAGTCTT

流式细胞术

每只小鼠的脾细胞悬液用10µg/mL抗cd16 /CD32抗体(克隆93,eBiosciences)孵育20分钟，使Fc受体饱和，然后用相应标记的抗体在含2% FBS的PBS中4°C黑暗中染色30分钟。采用FACS Fortessa II型流式细胞仪(BD Biosciences)按标准技术进行流式细胞术。对于免疫细胞的脾脏表征，使用两种单克隆抗体鸡尾酒:用于T细胞和B细胞表征的A组:B220-APC, CD69-PE, CD8-BV605, CD40-PerCP/Cy5.5, MHCII-FITC, CD4-BV510。B组巨噬细胞表型和M1/M2表征:CD206-AF647, CD86-BV510, Ly6C PE-Cy770, CD11b-APC-Cy7, F4/80-BV711，购自biolgend, Ozyme (Montigny-le-Bretonneux，法国)。M1巨噬细胞定义为B220⁻F4/80⁺CD11b⁺Ly6C^高CD206^-M2巨噬细胞为B220⁻F4/80⁺CD11b⁺Ly6c^低CD206⁺．使用FlowJo软件(Tree Star, Ashland, OR)分析数据。

统计研究的不同结果

各组小鼠的比较统计分析，若测量值符合正态分布，采用双因素方差分析，否则采用Kruskal-Wallis检验。分别对Bonferroni和Dunn的测试进行了多次比较。

结果

益生菌治疗小鼠子宫内膜异位症样病变演变及相关症状

不含益生菌P0(31.89%双甘氨酸锌，32.52%金合子胶，14.24%反式白藜芦醇，21.35%姜黄素)和益生菌P1或P2每个操作系统每周5天，200µl, 4 (4W)或12周(12W)。各组:未植入物未处理的小鼠(Sham)，植入物并给药的小鼠(P0组)或给药+ 1益生菌(P1组)。酿酒Boulardii)，或整车+ 2种益生菌(P2组:酿酒Boulardii+嗜酸乳杆菌）.

在手术前(W0)和献祭时(W4和W12)对植入的角片进行称重。植入时病变的重量和体积均匀(P0, n = 10 - P1, n = 20 - P2, n = 20)。在W4和W12时，P0、P1和P2治疗组间的病变重量无显著差异。然而，超声成像分析显示，两种治疗方法在W3时病变大小明显减小，在W11时更明显(p<0.0001, W3为42.03±1.28,P1为31.57±1.46,P2为33.55±0.94,W12为49.36±2.86,P1为31.82±2.51,P2为17.41±1.90)。对于病变体积的演变，P2治疗比P1治疗更有效。

此外，接受益生菌治疗的动物植入物更小，活性更低(没有新鲜血液，没有血管生成，很少有腺体)，而对照组P0通过宏观评估显示病变持续，更大，更活跃(图1C)。

小鼠子宫内膜异位症病变引起的疼痛和敏感性试验

von Frey触觉灵敏度试验是一种快速、灵敏的方法，可与其他已建立的方法一起用于评估小鼠疼痛的结果。大多数病理性疼痛患者和啮齿动物疼痛模型导致机械感觉的显著改变，测量这一点的黄金标准方法是使用von Frey纤维。这些分级单丝被用来测量存在于受影响皮肤区域的刺激诱发敏感性水平。灯丝的尺寸越高，灵敏度越低。

在W7，直至实验结束，P2作用下子宫内膜异位症小鼠的腹部触觉灵敏度开始明显下降(图2A) (W7: P0 vs P2, p=0.0080;W12: P0 vs P2;p=0.0039)，但与P0相比，P1组无明显差异。在W3和W7时，与单独使用P0相比，P1处理的小鼠对热的敏感性显著降低(图2B) (W3: P0 vs P, P =0.05;W7: P0 vs P1;p=0.0066)，但在W11处不再观察到差异。

图1所示。益生菌P1和P2处理对小鼠子宫内膜异位症病变发展的影响(A)子宫内膜异位症病变在W4和W12上的重量(B)子宫内膜异位症病变在W3和W11上的体积(C)病变在W4和W12上的H&E着色。数据以平均值±SEM表示。刻度代表200µm。采用单因素方差分析和Bonferroni检验对各组小鼠进行统计分析。W3-W12比较采用方差分析和Bonferroni检验。NS,非重要;* p≤0.05;* * p≤0.01;* * * p≤0.001。标尺，200 μm

图2。通过小鼠腹部敏感性和热痛觉评价P0、P1和P2处理对小鼠敏感性和疼痛的体内影响。小鼠分别给予P0、P1或P2每个操作系统每周5天，每次200µl。(A)使用迭代von Frey试验评估伤害感受。在4周或12周的益生菌治疗期间，每周进行一次测量，平均为2周。(Sham, n = 3 - M, n = 6 - P1, n = 5 - P2, n = 5) (B)采用+ 50°C±0.2°C的热板评估热痛觉过敏。(Sham, n = 3 - M, n = 6 - P1, n = 5 - P2, n = 5)。数据以均数±SEM表示。采用单因素方差分析和Bonferroni检验对各组小鼠进行统计分析。W3-W12比较采用方差分析和Bonferroni检验。NS,非重要;* p≤0.05;* * p≤0.01; ∗∗∗P ≤ 0.001

益生菌治疗子宫内膜异位症样病变的基因表达变化

为了评估子宫内膜异位症样病变的特征，与生长相关的标志物的基因表达(Igf1)，到痛苦(神经生长因子)(29)，到血管生成(Pecam1 / Cd31)，到炎症(Ptgs2 / Cox2)和纤维化(杆菌)在第4周和第12周进行RT-qPCR评估。在第4周时(图3A)， P0与P1或P2在这些标记物上没有显著差异。大肠杆菌mRNA水平在P1组低于P2组(p=0.0187)。在12周时(图3B)，无显著差异Igf1，Ptgs2 / Cox2和杆菌两组之间。有显著的减少神经生长因子P2和P1比较。为Pecam1 / Cd31结果表明，与P0相比，三组间存在显著效果，P1 (p=0.11)和P2 (p=0.06)水平有降低的趋势，表明益生菌治疗对限制子宫内膜异位症样病变内血管生成具有潜在的有益作用。

图3。(A)每只子宫内膜异位症小鼠在W4和W12切除的子宫内膜异位症样病变中，RT-qPCR检测的Igf1、Ngf、Pecam1、Ptgs2和ColI的相对mRNA水平(B) (W4, P0为n=5, P1和P2为n=10;W12, P0 n=6, P1和P2 n=5)。数据表示为每个样本相对mRNA水平归一化为2个内参基因的平均值±SEM。三组比较采用Kruskal Wallis检验，显著时采用Dunn多重比较检验。NS,非重要;* p≤0.05;* * p≤0.01

益生菌治疗对子宫内膜异位症小鼠脾免疫细胞表型和活化的影响

由于子宫内膜异位症的特点是全身免疫反应的改变[2]，我们研究了益生菌治疗对脾免疫细胞频率和激活的影响。在W4和W12时，各组CD4+和CD8+ t细胞的频率保持不变(图4)。有趣的是，在W4时，与假手术组相比，接受P0和P2治疗的小鼠CD8+ T细胞活性显著降低，并且这种差异在W12时扩展到益生菌治疗P1。

图4。益生菌治疗对T淋巴细胞的影响。脾CD4+ T和CD8+ T细胞在第4周或第12周激活或未激活的流式细胞术特征。数据表示来自独立样本的T CD4+/ T CD8+的绝对计数和活化细胞(CD69表达)的百分比。采用Bonferroni校正的ANOVA检验来检测组间的显著差异。NS:非标准;*p≤0.05;**p≤0.01;***p≤0.001

处理和载体都没有影响B细胞的频率(图4)。在W4和W12时，P2益生菌显著降低了B细胞的活化。在W4时，与假手术组相比，接受益生菌治疗的小鼠脾脏NK细胞的频率显著降低，而其激活度则增加。在W12时，观察到益生菌处理增加NK细胞活化的趋势，尽管不显著。

我们分析了不同治疗对巨噬细胞分化为促炎M1或抗炎/促纤维化M2谱的影响。脾脏巨噬细胞的频率在整体上保持不变。在W4时，益生菌处理P2显著提高了M1/M2比率，这一趋势在W12时保持并扩展到P1处理。(图5)。

图5。益生菌处理对B细胞、NK细胞和巨噬细胞的影响。流式细胞术检测第4周或第12周脾脏B细胞活化、巨噬细胞频率和极化以及NK细胞频率和活化。数据代表活化细胞上CD69表达的绝对计数、平均荧光强度或巨噬细胞M1/M2频率之比。M1巨噬细胞定义为B220⁻F4/80⁺CD11b⁺Ly6C^高CD206^-M2巨噬细胞为B220⁻F4/80⁺CD11b⁺Ly6c^低CD206⁺．采用Bonferroni校正的ANOVA检验来检测组间的显著差异。NS:非标准;*p≤0.05;**p≤0.01;***p≤0.001

益生菌治疗对子宫内膜异位症小鼠血清炎症、肠通透性和蛋白质氧化指标的影响

据报道，益生菌治疗与肠道通透性以及炎症和氧化应激的全身标志物的改变有关[30,31]。

在W4时，肠道屏障通透性标志物zonulin的血清水平在P0处理下保持不变，而在P1和P2益生菌处理下则显著降低(p<0.001，图6A)。W12时，P0、P1和P2处理小鼠血清中zonulin浓度下降(p<0.0001)。

图6。益生菌治疗对子宫内膜异位症小鼠血清炎症、肠通透性和蛋白质氧化指标的影响。ELISA测定小鼠治疗4周或12周后血清中(A) Zonulin (B) IL6 (C) TNFα的水平。(D)治疗4周或12周小鼠血清中AOPP水平。数据以平均值±SEM表示。采用单因素方差分析和Bonferroni检验对各组小鼠进行统计分析。W3-W12的比较采用双因素方差分析，然后进行多重比较检验。NS,非重要;* p≤0.05;* * p≤0.01;* * * p≤0.001

促炎因子IL-6和TNF-α也有类似的趋势，仅P1和P2处理在W4时分别显著降低或未检测到。在W12时，所有测试条件下IL-6细胞因子水平均显著降低，TNF-α仅在Sham小鼠中检测到(图6B和6C)。

血清中的AOPP水平(图6D)反映了血清蛋白的氧化，在W4和W12的所有处理中，AOPP水平都显著降低(图6D)。

讨论

子宫内膜异位症是一种激素依赖性炎症性疾病，局部和全身免疫反应改变参与了受影响女性子宫内膜组织移位的生存和生长[32]。微生物群在子宫内膜异位症发病中的作用最近得到了重视[33]。微生物群代表了存在于特定环境中的所有微生物，包括细菌、病毒、真菌和原生动物，它们生活在宿主体内并调节多种生理功能[34]。事实上，在微生物群和免疫系统之间存在着一种串扰。微生物组对免疫调节和几种炎症性疾病发展的影响已得到证实[35]。它的作用是维持胃肠道上皮的完整性，调节免疫稳态，防止细菌易位，从而产生全身性的低声调炎症[14,36]。免疫系统的激活和功能在很大程度上受到微生物群的影响[14]，反过来，免疫反应的改变会导致共生菌的组成和多样性的改变。相反，人们对女性生殖道中微生物群的存在和组成及其在子宫内膜异位症或其他妇科疾病发展中的作用知之甚少。子宫内膜异位症是在炎症基础上发展起来的。此外，微生物组影响雌激素代谢，雌激素影响肠道微生物群[37]。 Postulating that the microbiome could influence endometriosis development is logical. The benefit of probiotics in prevention and treatment of gastrointestinal as well as extraintestinal disorders [38-40] is now established.

在这里，我们表明益生菌治疗可以有效地减轻子宫内膜异位症小鼠手术诱导的临床严重程度。酿酒boulardii是一种常用于治疗胃肠道疾病如腹泻症状的益生菌酵母菌。它表现出的表型特征和生理特性是其作为益生菌成功的基础，如最佳生长温度、对胃环境的抵抗力和低pH值的生存能力。酿酒boulardii益生菌的活性已被阐明为多种途径的结合，包括改善肠道屏障功能、病原体竞争排斥、抗菌肽的产生、免疫调节和营养效应[41]。嗜酸乳杆菌是一种能够发挥神经保护作用的乳酸菌，可能与创伤性脑损伤小鼠肠道微生物群重塑有关[42]。乳酸菌长期以来，它被安全添加到乳制品中，尤其被认为具有增强肠道屏障功能和调节肠道微生物群的作用[43,44]。肠道微生物群的破坏会导致肠道屏障受损，诱发细菌易位、全身炎症反应和败血症[45,46]。

在我们的子宫内膜异位症小鼠模型中，经过4周和12周的益生菌治疗P1 (18 mg/kg)酿酒Boulardii)或P2 (18 mg/kg)酿酒Boulardii+ 9mg /kg嗜酸乳杆菌)，我们观察到病变的体积和大小明显低于未治疗的P0小鼠。临床上，p1处理小鼠W4的热敏性明显降低，P2处理小鼠W4的触觉敏感性明显降低。尽管如此，神经生长因子(NGF)的表达在W12时通过P1处理显著增加，NGF是一种有效的调节某些目标神经元生长、维持、增殖和存活的因子[47,48]。在患有子宫绝囊/子宫骶骨子宫内膜异位症的女性中，NGF与深度性交困难和性疼痛有关。COX-2/PGE2轴被认为介导了这种关联，可能通过增加神经束密度和通过NGF/Trk受体刺激COX-2/PGE2介导[49]。

在组织学水平上，腺方面(活动性子宫内膜异位症病变的标志)在接受P1或P2治疗的小鼠中明显减弱。在子宫内膜异位症中，组织中观察到的腺体对激素敏感，对与异位子宫内膜相同的周期变化做出反应，并负责疼痛[20]。益生菌已被成功地用于减轻胃幽门螺杆菌感染引起的腺体结构增生和降低COX-2的过度表达，COX-2也参与了子宫内膜异位症的发病[50,51]。

在免疫学上，我们观察到在益生菌治疗的子宫内膜异位症小鼠中CD4+和CD8+ t细胞亚群和b淋巴细胞的激活显著降低。先前有报道称，子宫内膜异位症女性异位子宫内膜中活化t细胞的频率更高[52]。在子宫内膜异位症患者的外周血中，这一观察结果不太清楚，一些研究显示t细胞增加，而另一些研究则显示t细胞的频率和激活减少[53]。B细胞是免疫系统的重要参与者，在子宫内膜异位症患者的血液和腹腔中增加[54]。B细胞的多克隆活化和抗子宫内膜自身抗体的存在[55,56]已被描述。在这里，益生菌治疗降低了子宫内膜异位症小鼠B细胞的活化。有趣的是，据报道，Ibrutinib(一种布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂)使B细胞失活，可阻止小鼠子宫内膜异位症的进展[57]。

据报道，子宫内膜异位症女性中NK细胞表型和功能的局部和全身改变(Wilson TJ等:子宫内膜异位症患者自然杀伤细胞活性降低:与疾病发病机制的关系)。Fertil Steril 1994;62:1086 - 1088)。事实上，一些研究已经报道了NK细胞表型和功能的改变，激活标记CD69和CD107a的表达减少，而抑制受体上调。有趣的是，已有研究证实益生菌可增加NK细胞的活化并增强其细胞毒性[58]。在我们的小鼠模型中，益生菌处理诱导NK细胞在W4激活增加。在手术早期，NK细胞检测和清除异常细胞的能力的提高可能有助于我们模型中子宫内膜异位症碎片的免疫控制。

益生菌治疗伴有M1和M2巨噬细胞表型失衡，并显著增加了子宫内膜异位症小鼠的M1/M2比值。人类和小鼠的研究证实了M2巨噬细胞在子宫内膜异位症病变建立和生长的发病机制中的关键作用。事实上，研究显示，与对照组相比，子宫内膜异位症女性腹膜液中M2巨噬细胞的比例升高[59]。此外，M2巨噬细胞过继性腹腔内转移可促进小鼠病变生长和新生血管形成[60]。益生菌对巨噬细胞极化具有免疫调节作用[61]。嗜酸乳杆菌我们的P2益生菌处理中所包含的IL-12已被证明可以促进IL-12细胞因子的产生，该细胞因子通过向Th1 T细胞反应的转变而有利于M1极化[62,63]。此外，已经证明嗜酸乳杆菌抑制一氧化氮和TNF-α的产生，同时刺激巨噬细胞系RAW264.7细胞中IL-10的产生[64]。TNF-α是一种强效的促炎细胞因子，主要由巨噬细胞、单核细胞和活化的T细胞产生。它参与了子宫内膜异位症的病理生理过程[65]。其水平在子宫内膜异位症患者的腹膜液中升高[66]，且与疾病严重程度相关[67,68]。血清TNF-α水平升高，子宫内膜异位症患者的单核细胞释放更多的TNF-α在体外与对照女性的单核细胞比较[69]。单克隆抗体(如英夫利昔单抗)或可溶性TNF-α受体(如依那西普)阻断TNF-α的抗炎作用已被证明在活的有机体内在动物模型和女性身上。在腹腔镜确认子宫内膜异位症的狒狒中，p55可溶性TNF-α受体阻断TNF-α可抑制子宫内膜异位症植入物的发育和生长[70]。与对照组相比，腹膜红色病变的大小减小[71]。在异位子宫内膜组织移植的大鼠中，与对照组相比，给药重组人TNF-α结合蛋白-1导致植入物发育缺陷[72]。我们的益生菌治疗降低血清TNF-α水平是主要的兴趣。事实上，据报道，益生菌以菌株依赖的方式调节TNF-α的表达，因为它们可以抑制正常和炎症粘膜的TNF-α的产生[73]。

由于子宫内膜异位症的特点是免疫功能紊乱，我们认为益生菌治疗可能发挥强大的免疫调节作用，通过降低血清TNF-α和IL-6水平来抑制过度炎症，改变M1/M2巨噬细胞亚群比例，降低b细胞活化

Zonulin是肠屏障通透性的标志。越来越多的出版物关注人类遗传学、肠道微生物组和蛋白质组学，表明粘膜屏障功能的丧失，特别是胃肠道粘膜屏障功能的丧失，可能会严重影响抗原运输，最终导致遗传易感个体的慢性炎症，包括自身免疫[74]。肠道黏膜是一种半透性屏障，它允许营养吸收和调节免疫监视，同时在肠腔内保留潜在的有害微生物和环境抗原。肠道感染通过增加肠屏障的细胞旁通透性，涉及多种病理状况的发病机制，包括过敏性、自身免疫性和炎症性疾病[75]。在我们的研究中，血清中的Zonuline在W4时被P1和P2显著降低，在W12时被M、P1和P2显著降低，这表明肠道屏障得到了保护。

研究表明，肠粘膜屏障的改变与直肠乙状结肠组织中神经内分泌功能障碍和NGF蛋白表达增加有关[21-23]。在我们的实验中，通过益生菌治疗的子宫内膜异位症小鼠血清中zonulin水平的增加所反映的肠通透性的改变可能解释了我们在子宫内膜异位症中观察到的变化Nfg信使rna表达。

因此，P0在妊娠4期和P0、P1和P2在妊娠12期氧化血清蛋白(AOPP)的降低率并不奇怪。先前的研究表明活性氧(ROS)和细胞因子参与了通透性的调节。血管内皮调节液体、溶质和细胞从血液进入组织的通道。血管通透性的破坏有助于多种疾病的发病机制，包括动脉粥样硬化、炎症性组织损伤和急性呼吸窘迫综合征。有三种细胞因子参与炎症状态下屏障功能的调节。组织损伤后血液中肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素(IL)-1、IL-6升高[76,77]。促炎细胞因子可能有助于在长时间缺氧期间观察到的内皮通透性的可逆变化。研究已经开始将活性氧(ROS)与细胞对炎症因子的反应联系起来[78,79]，而其他研究表明，ROS直接参与生理缺氧时启动的细胞内信号传导[80,81]。ROS的参与提示细胞因子和缺氧可能在炎症过程中相互作用调节内皮屏障功能。缺氧时ROS产生的一个主要功能后果是IL-6分泌增加，这有助于内皮通透性的改变[82]。

在我们的研究中，尽管炎症、纤维化和血管生成标志物的表达没有显著差异(cox 2，col1和cd31在W12上，它们随P2处理呈下降趋势。W12处理后，P1显著降低Igf1。COX-2是一种诱导酶，它催化前列腺素E2的产生，作为细胞对炎症的反应。COX-2过表达在炎症和癌变中具有多效性和多方面的作用。它塑造了原发性和转移性乳腺肿瘤细胞外基质的结构和功能[83]。现在认识到，与正常子宫内膜相比，子宫内膜异位症病变具有较高的COX-2和COX-2来源的前列腺素E生物合成。三阴性乳腺癌细胞中COX-2下调可导致Col1纤维密度降低[83]。

总之，这些结果证明益生菌是有益的非致病性细菌，已被用作预防或治疗某些疾病的营养方法[84,85]。使用一种(P1)或两种(P2)益生菌治疗，对子宫内膜异位症的临床、免疫和生理参数都有良好的影响。因为它更容易操作，而且对疼痛有明显的效果，酿酒boulardii(P1)似乎更适合作为子宫内膜异位症的新治疗策略。然而，P2治疗仍然是一个有趣的选择，因为其潜在的影响嗜酸乳杆菌对外周神经元的功能，从而对疼痛，在病人描述。

资金

这项工作得到了GYNOV和Iprad协会的支持

致谢

作者感谢巴黎科钦研究所PIV和Histim设备提供的超声监测和组织学技术。

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