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摘要

特发性肺纤维化(IPF)是最严重的肺纤维化形式，目前很少有药物治疗。发病的关键事件是成纤维细胞向肌成纤维细胞的激活以及细胞外基质(ECM)和分子因子的产生和释放。

分离小鼠原代肺成纤维细胞，用博莱霉素(BLM)诱导其激活。分离细胞外囊泡(EV)，提取蛋白质。释放的可溶性蛋白(分泌组)和ev衍生蛋白被还原、烷基化和胰蛋白酶被消化。nano-LC-MS /片女士^TM采用蛋白质组学方法进行分析。

blm处理过的肺成纤维细胞与未处理的肺成纤维细胞相比，释放的特定蛋白质可能在从生理状态到纤维化状态的过渡中起作用，如几种基质金属蛋白酶(MMPs)、骨桥蛋白(OPN)、几丁质酶-3样蛋白1 (CHI3L1)和CD44。我们的研究结果为肺纤维化的病理生理特征提供了进一步的认识，并为药理治疗提供了特定的靶点。

关键字

博莱霉素，特发性肺纤维化，肺成纤维细胞，蛋白质组学分析

缩写

BCA: Bicinchoninic酸;BLM:博来霉素;CHI3L1:几丁质酶-3样蛋白1;DAB:深棕色污渍;DMEM-HG: Dulbecco’s Modified Eagle Medium - High Glucose, 4500 mg/L;ECM:细胞外基质;EMT: Epithelial-Mesenchymal转换;胎牛血清;FSP-1:成纤维细胞特异性蛋白1;内脏大神经:Gelsolin; H&E: Haematoxylin and Eosin; H₂O_2：过氧化氢;IIPs:特发性间质性肺炎;IPF:特发性肺纤维化;MANOVA:多因素方差分析;金属蛋白酶- 1:矩阵Metalloproteinases-1;MMP-2:矩阵Metalloproteinases-2;MMP-3:矩阵Metalloproteinases-3;MMP-7:矩阵Metalloproteinases-7;MMP-9:矩阵Metalloproteinases-9;基质金属蛋白酶:基质金属蛋白酶; OPN: Osteopontin; PBS: Phosphate-Buffered Saline; PDGF: Platelet-Derived Growth Factor; PRDX2: Peroxiredoxin 2; PRDX6: Peroxiredoxin 6; RNS: Reactive Nitrogen Species; ROS: Reactive Oxygen Species; S100A4: S100 Calcium-Binding Protein A4; Tagln-2: Transgelin-2; TGF-β1: Transforming Growth Factor-β1; TNF-α: Tumor Necrosis Factor-α; Vim: Vimentin; α -sma: α-Smooth Muscle Actin

简介

纤维化肺疾病是一种广泛的病理学，其特征是不同程度的炎症和纤维化。在这组疾病中，纤维化程度最高的是特发性肺纤维化(IPF)，其发病机制尚不清楚，预后非常不利[1]。目前仍缺乏具体的治疗方法，吡非尼酮或酪氨酸激酶抑制剂任天达尼的抗纤维化治疗已被证实仅能减缓疾病进展[2]。在病理开始时，重复损伤事件导致上皮细胞凋亡，成纤维细胞形成“病灶”，ECM成分积累。成纤维细胞被肌成纤维细胞激活，并表达多种细胞因子和生长因子，如PDGF、TGF-β1和TNF-α，刺激细胞迁移、增殖和细胞外基质积累。肌成纤维细胞是纤维性疾病结缔组织重构的主要决定因素，也负责过度ECM沉积，肺泡上皮细胞凋亡和肺实质的进行性破坏。所有这些过程最终导致肺部功能的逐渐损害，最终导致呼吸衰竭。博莱霉素(BLM)是诱导动物肺纤维化最广泛使用的药物，至少能够重现IPF患者观察到的主要组织学特征[3-5]。目前，尽管对纤维化肺疾病有了更好的理解，但肺移植仍然是晚期IPF患者唯一真正的治疗机会[6-8]。在这种情况下，我们评估了blm诱导的从成纤维细胞到肌成纤维细胞表型转换中蛋白质合成和释放的调节。 In brief, secretome and proteins of microvesicles released by BLM-treated lung fibroblasts were analyzed to obtain a general overview of the proteins released from activated cells in order to better understand the pathophysiological features of lung fibrosis.

方法

肺成纤维细胞的分离和培养

将健康小鼠(8-10周龄)的肺移植，组织切成2-4毫米的小块²)．野生型C57BL/6雌性和雄性小鼠(8-10周龄)购自Harlan Laboratories。意大利遵循了意大利卫生部根据意大利法律通知的关于护理和使用研究用动物的国家准则(D.L. 116/92，执行欧共体第609/86号指令)。这项研究是与位于比萨的托斯卡纳·加布里埃修道院基金会和CNR实验生物医学中心合作进行的。

用1mg /ml消化组织碎片梭菌属的胶原酶(Sigma-Aldrich, Milan, Italy)在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中37°C孵育1小时。酶促消化后，组织碎片在室温下300 x g离心10分钟，重新悬浮在细胞生长培养基(杜尔贝科改性鹰中高葡萄糖，4500 mg/L (dmeme - hg)，添加10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺和1X青霉素-链霉素溶液)中，在标准条件下37℃培养至少24小时。实验用第三代的细胞进行。

MTT细胞增殖试验

MTT细胞增殖试验中，肺成纤维细胞被镀于96孔培养皿中(2000个/孔)。每个试验点设置3个重复。BLM浓度分别为0.5 μg/ml、48、72 h;1.5μg / ml;2.5μg / ml;3.5μg / ml。MTT试剂20 μl (CellTiter 96^®每孔加入Assay, Promega)，细胞孵育4小时至37°C，直到可见紫色沉淀物。最后，在490 nm处记录吸光度。

Secretome集合

大约10⁶将细胞接种到直径为100 mm的培养皿中，培养至细胞密度达到90%汇合。用于分泌组分析，制备3个培养皿/实验点(blm处理细胞和对照细胞)，包含7ml不含酚红的FBS游离培养基。收集条件培养基，以300 x g离心以清除细胞碎片。按照制造商的建议，使用Amicon Ultra-3 (Millipore)去除盐分和浓缩蛋白质。

细胞外囊泡(EV)分离

制备20个培养皿/实验点(blm处理细胞和对照细胞)，每个培养皿含7 mL培养基，用100 000 x g超离心胎牛血清培养，避免牛囊泡污染。使用Comelli等人(2014)描述的方案通过差速离心分离囊泡，并对[9]进行了微小的更改。简单地说，培养基在2000 x g下离心30分钟，以丢弃凋亡泡;在11万x g下离心1小时，在4℃下获得微泡和外泌体(EV)。用PBS洗涤球团，在4℃下11万x克离心2小时，得到的球团在-80℃保存，直到分析。为了提取用于MS分析的蛋白质，囊泡球经过5个冻融循环:在液氮中溶解30s，然后在50°C解冻2min;超声处理5 min。

质谱分析的样品准备

对于分泌组和EV样本，蛋白质浓度由双二酚酸(BCA法，Thermo Fisher)测定。每个样品40µg，用5 mM DTT在80℃还原30 min，然后冷却至室温，在37℃烷基化30 min，加入最终浓度达10 mM的碘乙酰胺。消化通过添加0.50 μ g胰蛋白酶测序等级(罗氏)在37°C下过夜，肽混合物用10-20 μ l 1%甲酸酸化。

Nano-LC-MS女士/片^TM分析

使用纳米高效液相色谱系统(Eksigent, ABSciex)对多肽进行色谱分离。第一个加载步骤将样品预浓缩在柱前筒中(PepMap-100 C18 5µm 100 A, 0.1 x 20 mm, Thermo Scientific, USA)，然后在C18 PepMap-100柱中分离肽段(3µm, 75µm x 250 mm, Thermo Scientific, USA)，流速为300 nL min^－1．用洗脱液A(超纯水，0.1% FA)在5 - 40%洗脱液B (ACN/0.1% FA)的线性梯度下运行70分钟，然后进行10分钟的吹扫步骤和20分钟的重新平衡步骤。从色谱中洗脱的多肽直接用TripleTOF处理^TM5600质谱仪(ABSciex，美国)配备DuoSpray^TM离子源(ABSciex，美国)。使用新的SWATH获取数据^TM霰弹枪数据独立MRM量化方法。库用ProteinPilot软件处理MS/MS数据^TM软件(ABSciex，美国)使用Paragon^TM和专业集团^TM小家鼠的算法和Uniprot 2015数据库。错误发现率(FDR)分析设置为95%的置信水平。使用PeakView进行无标签统计比较分析^TM软件(ABSciex, USA)与MS/MS(ALL)， SWATH™采集MicroApp 2.0和MarkerView^TM(美国ABSciex)。使用从每个分析的最高分蛋白中选择的肽(最高置信度和最高水平过渡)获得保留时间对齐。处理设置为:每个蛋白7个肽段，每个肽段7个过渡，分泌组和微泡/外泌体的肽段置信度分别为80%和88%(根据Paragon算法结果)，FDR为5%;XIC选项:提取窗口10分钟，宽度50 ppm, 0.1 Da。标准化是使用一个全局的标准化剖面(总蛋白含量)来完成的。主成分分析(PCA)用于数据集之间的证据分组。两组比较采用t检验(FC) > 2, p值< 0.05。

免疫印迹分析

蛋白质提取物(20µg)在10% SDS-PAGE上运行，并使用Trans-Blot SD半干转移细胞(Biorad)转移到硝化纤维素膜(Amersham)上。使用以下抗体:抗骨桥蛋白(抗opn, 1:50 00) (Meridian LifeScience);anti-CD44(施用)(Abcam);抗几丁质酶3-like 1(抗chi3l1;施用)(Biorbyt)。

BLM体内给药

野生型C57BL/6雌性和雄性小鼠通过气管内灌注暴露于BLM (Sigma-Aldrich, Milan, Italy)。小鼠用氯胺酮/羟嗪(Virbac, srl)麻醉(氯胺酮80 mg/kg腹腔注射，羟嗪10 mg/kg腹腔注射)，气管内注入溶解在0.1 ml生理盐水(0.9% NaCl)中的单次亚致死剂量3 U/kg BLM。对照组接受手术气管内灌注生理盐水。小鼠监测28天后处死。

组织学和免疫组化分析

小鼠肺用5%缓冲福尔马林浸泡7-10天固定。标准组织学处理后，用旋转切片机(Microm HM 300, Bio-optica)从石蜡包包样品中切割10-20个5 μm厚的切片，并用三色马松染色(Bio-optica)获得胶原蛋白。免疫组化时，切片置于带正电荷的载玻片上，脱蜡、复水并在蒸馏水中洗涤。H培养后₂O₂在室温下，完成抗原提取(柠檬酸缓冲液pH= 6, 500 W微波10分钟)。使用以下一级抗体:抗- α-平滑肌肌动蛋白(抗- α- sma, 1:100) (Santa Cruz);抗s100钙结合蛋白A4(抗s100a4, 1:50 00) (Novus biologics);anti- vimentin (anti- VIM, 1:50)(圣克鲁斯);抗骨桥蛋白(抗opn, 1:400)(子午生命科学);抗几丁质酶3-like 1(抗chi3l1;施用)(Biorbyt)。遗漏一抗作为阴性对照。抗体结合细胞和/或细胞外成分可见棕色或深棕色染色(DAB)，阴性细胞为蓝色染色(苏木精反染色)。所有切片均在光学显微镜下(奥林巴斯BX43)检查，并通过与奥林巴斯Cell Sens Dimension软件接口的视频系统(奥林巴斯D20相机)进行数字化处理，以进行图像采集。

结果

从健康小鼠肺中分离成纤维细胞，用BLM培养和处理，以诱导和研究可能与纤维化过程相关的表型变化。

为了确定BLM能够在不诱导细胞死亡的情况下测定表型变化的剂量，采用MTT法，并将该药物以特定浓度范围(从0µg/ml到3.5µg/ml)添加到细胞培养中，持续72h。细胞活力下降非常缓慢，从未达到70%以下的值。BLMµg/ml时开始下降，所有剂量处理48小时后没有观察到差异。基于这些原因，选择1.5µg/ml进行后续实验。

为了证明肺成纤维细胞转换为激活表型，也称为肌成纤维细胞，当BLM处理时，进行了免疫组织学分析，并检测αSMA、S100A4和vimentin (VIM)的表达。α-SMA(众所周知，在肌成纤维细胞中新表达)和S100A4的表达在BLM处理的细胞中增加，S100A4是肺纤维化的标记物，而VIM(成纤维细胞的识别标记物)在未处理的细胞中表达更多(图1)。这些观察加强了BLM处理的肺成纤维细胞原代培养可以代表一种假设在体外肺纤维化模型。

图1所示。肺成纤维细胞免疫细胞化学:BLM中未处理(左)和处理(右)成纤维细胞α-SMA和S110A4(刻度条=20µm)

为了进行分泌组分析，成纤维细胞培养至细胞融合达到90%，在无血清培养基中培养48小时，培养基中添加或不添加BLM。质谱分析鉴定出263种蛋白质(表S1)。在图2中，根据UniProt联盟报道了这些蛋白质的亚细胞定位(http://www.uniprot.org)．在这种特定的环境下，值得注意的是，44%的蛋白质是外泌体、基质和细胞外空间蛋白质。

图2。已识别的分泌组蛋白的亚细胞定位。按照UniProt联盟进行蛋白质分类http://www.uniprot.org．Western blot用于验证blm处理和对照(CTRL)成纤维细胞中OPN表达的分泌组分析

在263个确定的蛋白中，有17个蛋白在blm处理的成纤维细胞中与未处理的细胞表达差异。这些蛋白质及其p值和折叠变化见表S2。表1显示的差异表达蛋白，根据文献，可能与纤维化过程有关。

表1。不同的分泌蛋白

组	调节蛋白 BLM vs控制	了调节蛋白 BLM vs控制
陪伴	热休克蛋白hsp90 - α
肌动蛋白结合蛋白和细胞骨架	Cadherin-2
细胞外基质、基质基质和相关因子	赖氨酸氧化酶同源物2	MMP-2 14-3-3蛋白 MMP-3 骨桥蛋白
炎症和氧化应激		Legumain Chitinase-3-like蛋白1
TGF -β	Calreticulin

蛋白质根据其参与肺纤维化的假设进行分组(p值<0.05;折叠变化(FC) >2为上调蛋白，1/FC >2为下调蛋白)

为了验证蛋白质组学结果，使用抗opn抗体进行western blot。与未处理的细胞(CTRL)相比，blm处理的肺成纤维细胞的分泌组中OPN上调，证实了基于质谱的数据。

分泌组评估的主要缺点是必须在无血清培养基中培养细胞，这是一种饥饿状态，因此是应激状态，因为血清中存在白蛋白和其他丰富的蛋白质，掩盖了较少的分泌蛋白。为了评估在更理想的生理条件下分泌的蛋白质，我们分离并研究了细胞外泡(EV)，即blm处理的肺成纤维细胞在标准条件下培养的微泡和外泌体，血清存在。

该协议允许多达464种蛋白质的鉴定(表S3)。识别出的蛋白质根据其亚细胞定位进行分组(图3)。

44个蛋白得到了差异表达，并根据它们的功能和活性进行了分析，特别关注它们在肺纤维化中的潜在参与。完整的清单见(表S4)。表2根据文献报道了可能与纤维化相关的差异表达蛋白。

表2。释放的微泡中差异表达的蛋白

组	调节蛋白 BLM vs控制	了调节蛋白 BLM vs控制
肌动蛋白结合蛋白和细胞骨架	Gelsolin	Septin-2 Filamin-C 角蛋白，II型细胞骨架
细胞外基质及其相关因子		胶原C-endopeptidase 增强器1 酪氨酸蛋白激酶2β
氧化应激与氧化还原调节	黄素还原酶 Peroxiredoxin-2 Peroxiredoxin-6
TGF -β	氯离子胞内通道蛋白4 色素epithelium-derived因素 Galectin-1 凝血因子V CD44 Transgelin-2
DNA修复	Nucleophosmin
炎症	羧肽酶N催化链 Cdc42 羧肽酶B2
钙结合蛋白	钙调蛋白 Calponin

蛋白质根据其参与肺纤维化的假设进行分组(p值<0.05;折叠变化(FC) >2为上调蛋白，1/FC >2为下调蛋白)

图3。囊泡包围蛋白的亚细胞定位。按照UniProt联盟进行蛋白分类，http://www.uniprot.org．Western blot检测了blm处理和对照(CTRL)成纤维细胞中CD44表达的蛋白质组学数据

用抗cd44抗体进行Western blot验证蛋白组学结果;图3显示的数据证实了该蛋白在blm处理的细胞中下调。

为了调查可能的可转让性在体外结果在活的有机体内动物模型小鼠气管内灌注BLM (3 U/kg)，对照组小鼠气管内灌注PBS。28天后处死动物，肺进行组织学分析。在blm处理过的肺部，炎症浸润被证实，在Mallory三色染色中检测到胶原纤维的显著产生和积累。免疫组化图像证实了纤维化的发生和进展，显示blm处理的组织与未处理的组织相比，抗-α-SMA和抗s100a4阳性均增加(图4)。

图4．blm诱导肺纤维化的组织学和免疫组化组织特征。将3u /Kg博莱霉素处理小鼠的肺切片与生理盐水处理小鼠的肺切片进行比较。用马洛里氏三色(Mallory)染色的代表性肺组织显微照片显示治疗过的肺间质纤维化灶区(标尺=1毫米)。α-SMA和S100A4代表性图像显示blm治疗的肺纤维化阳性区域。(比例尺= 500µm)

免疫组化分析还使用特异性抗体对两种差异分泌蛋白骨桥蛋白(抗opn)和几丁质酶-3样蛋白1(抗chi3l1)进行免疫组化分析(图5)。这两种蛋白在处理过的纤维化肺中均有强表达，证实并验证了蛋白质组学结果。

图5。免疫染色肺切片的代表性显微照片。将3u /Kg博莱霉素处理小鼠的肺切片与生理盐水处理小鼠的肺切片进行比较。代表性的OPN和CHI3L1抗体图像显示blm治疗的肺纤维化阳性区域。(比例尺= 500µm)

讨论

纤维化进展和恶化的特征表现为II型肺泡上皮细胞的过度增殖和成纤维细胞的聚集和增殖，导致成纤维细胞灶的增加。被激活的成纤维细胞主要负责间质胶原蛋白和其他ECM成分的产生和沉积[10,11]。具体来说，当组织受到损伤时，局部存在的结缔组织成纤维细胞通过形成收缩应力纤维获得收缩活性，新表达α-SMA，而VIM表达减少。事实上，表达α-SMA的肌成纤维细胞不仅能促进收缩，还能合成大量的细胞外基质成分和基质降解蛋白酶，在损伤组织重塑中起着重要作用[12-17]。肺纤维化的一个新标志物是成纤维细胞特异性蛋白1 (FSP1)，也被确认为S100A4。正常小鼠肺实质表达极低水平的S100A4，但在blm诱导的肺纤维化过程中其水平迅速升高。据报道，S100A4表达与肺纤维化小鼠模型中的胶原沉积和肺实质结构变化相关。如图1所示，BLM处理的肺成纤维细胞获得了表征纤维化的形态学和免疫组化特征。本研究的主要重点是在blm诱导的成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转换过程中对蛋白质合成和释放的调节。事实上，肺成纤维细胞的激活和增殖先于ECM成分在受损肺泡内的积累，是潜在可逆疾病向进行性不可逆疾病转变的关键一步。 Indeed, the amount of fibroblast/myofibroblasts foci is considered a main prognostic factor in pulmonary fibrosis disease [11]. In order to gain better insight in the fibrotic process, we analyzed the proteins released by BLM-activated fibroblasts. Secreted proteins play important roles in the regulation of many physiological processes via paracrine/autocrine mechanisms and they gained interest as potential biomarkers and therapeutic targets of diseases [18,19]. Moreover, the identification of proteins released in the extracellular space by fibrotic cells may be of great interest for the comprehension of lung fibrosis, being characterized by increased collagen deposition, accumulation of extracellular matrix components, cell proliferation/trans-differentiation and alteration of normal lung structure. 263 secreted proteins were identified, 44% are exosome, matrix and extracellular space proteins and among them 17 resulted differentially expressed in BLM-treated fibroblasts compared to untreated cells. Several up-regulated proteins are factors related to ECM; it is worth of note that ECM plays a critical role in the repair process, orchestrating the transitions of cell phenotype and function [7,20].

在上调的蛋白中，骨桥蛋白(OPN)尤其令人感兴趣，因为最近的研究报道BLM灌注后，OPN -/-小鼠肺纤维化减轻，活性转化生长因子-β1 (TGF-β1)减少，I型和III型胶原蛋白表达减少[21-23]。OPN还通过改变胶原基质和诱导几种基质金属蛋白酶(mmp)，如MMP-1、MMP-2和MMP-9[24]，影响ECM重塑。MMPs在肺纤维化的发病机制中发挥重要作用已被广泛接受;事实上，我们在blm处理的成纤维细胞中发现了两种上调的mmp: MMP-2和MMP-3。MMP-1, MMP-2, MMP-7和MMP-9在肺纤维化，特别是成纤维细胞[25]灶中高度表达。包括MMP-3在内的mmp有能力调节组织修复，改变非基质蛋白的活性，如细胞因子和膜受体，导致激活负责上皮-间充质转化(EMT)[26]的通路。因此，MMP-3可能在肌成纤维细胞[11]的起源中发挥作用。许多因子和蛋白质与mmp相互作用，调节它们的功能，其中，14-3-3蛋白是一类高度保守的分子伴侣，代表重要的MMP-1调控因子。为了结束这个有趣的循环，值得注意的是，我们还报道了几丁质酶3-like 1 (CHI3L1)的上调，这与MMP-1抑制I型胶原降解有关[27-29]。

从诊断的角度来看，分泌囊泡代表了一个日益增长的兴趣领域，旨在识别生物液体(如血液、尿液、唾液)中的疾病生物标志物[9,30-32]。在目前的研究中，分离出的囊泡允许识别多达464个蛋白质。

在blm处理的成纤维细胞中，有44个蛋白表达差异，其中过氧化物还蛋白6 (Prdx6)和过氧化物还蛋白2 (Prdx2)表达下调，提示氧化还原系统在纤维化过程中发挥作用。过氧化物还蛋白是一种抗氧化酶，有趣的是，与健康对照肺[33]相比，Prdx2在特发性肺纤维化成纤维细胞灶中下调。Prdx6在肺中高水平表达，它被认为是一种新的抗氧化酶，可能在对抗氧化损伤[34]中发挥关键作用。Wang和他的同事证明，过度表达Prdx6的转基因小鼠在高氧环境下对肺损伤的抵抗力增强，导致过氧化氢(H₂O₂)并对多种形式的氧化应激提供保护。因此，酶表达的降低可能加剧肺损伤[35-38]。有趣的是，一些差异表达的蛋白与TGF-β通路有关，因为TGF-β是一种强大的纤维化因子，是从成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转分化的重要激活因子，它的活性可以通过刺激细胞增加基质蛋白合成、减少基质降解蛋白酶的产生和调节整合素表达[39]，从而与ECM的沉积和重塑有关。CD44是一种可能参与TGF-β通路调节的蛋白，与细胞骨架成分和其他配体(如OPN、胶原和MMPs)相互作用，影响成纤维细胞的粘附和动力，从而支持其在组织重塑和纤维化中的潜在作用[40-42]。多项研究表明，CD44的表达在组织损伤后炎症的消退和向修复性纤维化的过渡中起着重要作用。

向激活状态的表型变化必然与肌动蛋白细胞骨架的重塑有关;事实上，在我们的样本中发现了几种肌动蛋白结合蛋白的不同调控。其中，我们发现胶质蛋白(gelsolin, GSN)和转胶质蛋白-2 (transgelin-2, Tagln-2)在经处理成纤维细胞释放的囊泡中表达下调。这一结果与已经发表的各种类型癌症、类风湿性关节炎和肺纤维化的数据一致[43-45]。

人类不同形式的肺纤维化，特别是IPF，具有很高的发病率和死亡率。虽然肺纤维化的致病途径和介导因子在过去几年中已经被深入研究，但迄今为止，涉及的分子途径尚未完全了解。在接受BLM治疗的动物中，肺组织学表现出与IPF患者相似的特征。为了对肺纤维化的病理机制提供更深入的了解，对blm处理的肺成纤维细胞进行了蛋白质组学分析。肺纤维化的特征是ECM的合成和重构，因此我们重点研究了分泌组和微囊包围蛋白。几个MMPs和ECM蛋白导致被治疗的成纤维细胞的分泌组和OPN上调，OPN在炎症和组织修复中都起作用。囊泡分析证实了OPN在成纤维细胞表型调节中的相关性，并证实了CD44的差异表达，它与OPN和MMPs相互作用并影响炎症反应。blm诱导纤维化动物模型中纤维化肺组织中OPN和CHI3L1表达的增加证实了我们的蛋白质组学结果，提示转译的可能性在体外数据在活的有机体内设置。

总之，在blm诱导的肺纤维化实验模型中，已经确定了几个关键蛋白。目前临床治疗的不足为进一步研究提供了强大的动力，以评估这些因素是否可能被认为是新的治疗方法的潜在靶点。

作者的贡献

概念与设计，VDL, AC, MAM。实验室检测和数据收集，VDL, AC, SR, LC, NU, CDP, MT, GP, SB.数据分析和解释:VDL, AC, MAM, SR, GP。起草和修改稿件:VDL, AC, MAM。所有作者阅读并批准了最终稿件。

资金信息

这项工作得到了意大利比萨国家研究中心临床生理学研究所(IFC)的研究资助．

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。

辅助数据视图

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