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罗格斯大学环境与生物科学学院，新不伦瑞克，新泽西，08901

我们之前的论文Part 1[1]基于与SARS表位的氨基酸序列同源性，鉴定出了184个可能的covid - 19表位。

在这一部分中，我们将使用更复杂的分析，我们称之为同义密码子使用的木村肽分析(KPASCU)。这一分析是与Sydney Brenner一起开发的，作为我们之前与Francis Crick和Aaron Klug爵士[2]合作的一部分。

目前，大多数生物信息学家通过蛋白质氨基酸序列之间的同源性来分析序列。这种分析的假设是，如果相同的核苷酸序列在两种不同病毒的两种不同蛋白质中编码相同的肽序列;那么，这就是“共同祖先的后裔”的证据。这是达尔文的假设，也是最常用的分析方法。例如，就在最近，以下序列VLLFLAFVV被鉴定为SARS和covid - 19的包膜蛋白(E)中的共同表位[3]，他们建议将其作为疫苗基础的表位。他们的工作相当漂亮。然而，我们认为这可能不是建立疫苗基础的最佳表位。我们有两个理由。首先，这个序列是完全疏水的，这在抗体-表位相互作用中是罕见的。

第二个原因是，“来自共同祖先的后代”不是对序列的正确解释，无法确定可以作为疫苗基础的表位区域。他们提出的序列在我们之前的论文第1部分中被确定为184个共同表位之一。事实上，我们在之前的论文[1]中对184个可能的表位区域进行了检查，发现该E蛋白的暴露表面积较大，为LIVNSVLLFLAFVVFLLVTLAILTALRLCAY。这意味着它们长达9个氨基酸的表位序列是位于包膜蛋白表面且抗体可接近的31个氨基酸序列的一部分。

图1显示了该区域SARS和covid编码的核苷酸序列之间的关系。见下文。

图1所示。SARS与covid - 19包膜蛋白(E)比较

首先值得注意的是，SARS和covid - 19中该区域的核苷酸编码除了在第四个缬氨酸上有一个同义核苷酸变化外，其他都是相同的。在SARS中，该缬氨酸由GUC编码，而在covid - 19中，该缬氨酸由GUU编码(在RNA水平上，图1给出了DNA序列)。这是两种病毒之间从C到U的简单过渡突变。有趣的是，脊髓灰质炎病毒中单个C到U的变化是从Leon毒株(致病性)到Sabin疫苗(非致病性)的变化[4]。因此，只要在适当的地方进行一次改变，就可以将致病性病毒转化为非致病性病毒，即活病毒疫苗(Sabin)。然而，SARS和covid - 19之间的这种变化并没有将covid - 19转化为非致病性菌株[*]。

图1显示，SARS和covid - 19这两个区域之间几乎完美的编码身份表明，这些区域是“共同祖先的后裔”。因此，可以得出结论，在核苷酸序列上没有特定的编码选择，在编码的表面氨基酸上也没有任何结合选择。

虽然他们的工作[3]在生物信息方面非常出色，但我们认为这不是一个强有力的疫苗候选，因为没有证据表明氨基酸序列被选择用于独立于其编码的功能。它只是“共同祖先的后裔”。

covid - 19表面氨基酸结合强烈的证据。

有什么证据可以证明一个氨基酸序列被选择为具有独特的功能，比如一个独立于其编码序列的强结合功能?

一种证据是氨基酸序列的“趋同进化”，而不是“来自共同祖先”。例如，貘和猪长得很像，但貘是奇趾动物，猪是偶趾动物[5]。在分子水平上，“趋同进化”看起来就像SARS和covid - 19的表位之间的氨基酸序列相同，但编码任何两个相同表位的核苷酸序列并不相同。他们的编码会非常不同。

换句话说，不同的同义密码子编码相同的氨基酸序列将是“趋同进化”的证据。氨基酸序列的趋同是选择发生在氨基酸而不是核苷酸序列上的证据。这也将证明核苷酸序列不是相关的，也不是来自一个共同的祖先。

功能趋同进化的实验证据-两个不同的核苷酸序列进化为编码相似的氨基酸序列，这些氨基酸序列被选择用于结合相同的目标。

我们进行了一项实验，我们在丝状噬菌体表面生成了一系列不同的肽，大小从7到12不等[6,7]，并将它们与特定的7个氨基酸靶标(TNF α人类表位)结合。然后对结合的噬菌体进行纯化、扩增和多次回弹。结果如图2所示。

图2。两种噬菌体结合TNF α表位(Humira靶点)的结果

鉴定了上述两个噬菌体，它们在彼此完全相同的位置编码4个相同的氨基酸序列。

4个氨基酸序列分别为H R L X d (His-Arg-Leu-N-Asp) 1个噬菌体结合序列在7个氨基酸组合文库中鉴定，2个噬菌体结合序列在12个氨基酸结合文库中鉴定。从两个不同大小的文库中独立获得相同位置的相同4个氨基酸的统计显著性小于16万分之一。

结果表明，相同的氨基酸序列收敛为目标表位的结合序列，但编码它们的序列不同。这是同一序列的不同密码子编码。这是选择是针对氨基酸序列而不是核苷酸序列的证据。我们将其称为Kimura肽，因为Kimura提出同义编码的固定是随机的[8]，该假设用于计算突变率。

这是木村中性突变假说第一次也是唯一的直接实验验证。木村假说的所有其他证据都是事后生物特征分析。

我们在这里提出的是一个功能直接测试，选择可以发生在蛋白质水平与中性固定的同义编码。因此，至少Kimura是正确的，他和Jukes[9]的中性突变进化模型至少在结合功能方面可以成为蛋白质序列进化的一部分。

脚注:该结合序列HRLxD是结合人类TNF α表位的序列的一个子集。这个完整的序列可以代替修美乐而没有修美乐的淋巴瘤副作用。

木村肽分析方法的新应用

使用木村肽分析方法来确定未知病毒的有效表位是新颖的。

如果相同的序列在相关病毒中被不同的同义编码所编码，则说明选择发生在蛋白质或肽区。具体来说，如果已知该区域是一个表面肽区，比如一个表位或一系列共线表位，那么它就有力地证明了该区域是通过与一些必要的受体或结合坞的结合相互作用被选择的，以实现病毒的适应性生存。然而，另一方面，如果它被宿主抗体选中;那么，病毒就无法存活。没有病毒存活就不会有疾病。由于它最初是作为病毒一些重要生存功能的表面肽，如受体结合或膜插入，因此，它后来成为宿主抗体的靶标。

因此，我们预测以下表位是covid - 19存活所必需的，以及用于制造疫苗和/或中和结合肽的适当表位。我们可以通过分析已知的与SARS和covid - 19共同的184个表位来做到这一点。

非常重要的是，该表位序列需要通过绘制covid - 10感染康复患者抗体的表位结合图谱来确认(图3)。New England Biolabs已经公布了通过噬菌体展示文库筛选单克隆抗体来鉴定其结合序列的方案[7]。

图3。木村肽分析三个表位序列的总结

8/16 50%和1个差值。

同义词的差异

信封1/31 3%

膜4/10 40%

12/23峰值52%

Spike s2 8/13 61%

通过低温电镜观察，预测尖峰区S2 (RBD)为结合区。(然而，COVID - 19的这一区域与SARS的表位功能只相差一个氨基酸，尽管它由8个不同的同义密码子编码。三个与SARS结合的单克隆不与covid - 19的同源区结合。

显然，一个氨基酸的差异是显著的，即使有很多不同的密码子使用，也排除了它作为covid - 19表位的可能性。

Spike 2 -该区域由Spike S2的26个氨基酸组成，是最有可能用于开发疫苗的表位候选者。

因为它有超过12个氨基酸，所以它也具有免疫原性，可以用作肽兴奋剂，产生针对它和covid - 19的抗体。因此，这种肽或这种肽的亚群可用于制造疫苗和/或直接刺激和抗体反应(Q S L Q T Y V T Q Q L I R a a E I R a S a N L)。

此外，以下序列和子集可作为结合组合文库制作的配体的靶标[6]。如果用作被动免疫，这些配体可以取代单克隆体。

1)如果我喜欢我就喜欢我

2) q是1,q是1,q是1,q是1,q是1,q是1,q是1,q是1,q是1

3) p q = p q = h v v = h v v = y

这些配体的合成速度比单克隆体快得多，单克隆体也应该被合成。然后这些配体可以中和病毒及其感染能力。

此外，这些编码的DNA序列可以插入到腺病毒载体中，以创建竞争性病毒，产生针对covid - 19病毒的抗体。

再次需要重申的是，使用组合文库对来自感染患者的抗体进行表位定位，将确定可用于制造疫苗的表位。如果通过组合作图鉴定的表位与木村肽分析鉴定的表位相对应，则可以确定已经鉴定了正确的中和表位。

此外，值得注意的是，covid - 19的结合表位比SARS的结合表位“更强”。还有更多同义编码。这意味着这种病毒虽然没有SARS那么致命，但传染速度会更快。毒力的降低可能是由E蛋白的同义C到U的变化来解释的，这类似于脊髓灰质炎的Leon株在472位向Sabin株的减少。这是脊髓灰质炎中GC到GU碱基对的变化，可能类似于SARS和covid - 19的变化。

*作为一种替代策略，随着疫情的减弱，可以分离出一种竞争性的covid - 19非致病性菌株。我们以前曾在防治艾滋病方面分离出一种非致病性的竞争性艾滋病毒株。(Scolaro, M.， Durham, R.和Pieczenik, G.(1991)“HIV的潜在分子竞争者”，The Lancet, Vol.337, p.731)。

参考文献

1. 张建军，张建军，张建军(2020)”快速研制武汉冠状病毒(WCV)疫苗和治疗策略医疗案例代表3: 1 - 1。
2. Crick FH, Brenner S, Klug A, Pieczenik G(1976)蛋白质合成起源的推测。生命的起源7: 389 - 397。
3. Abdelmageed MI, Abdelmoneim AH, Mustafa MI, Elfadol NM, Murshed NS等。(2020)人2019-nCoV E蛋白多表位肽疫苗的设计:免疫信息学方法BioRxiv。
4. Pieczenik G(1994)基因型选择理论:根据G: U碱基配对和HIV-1非致病性菌株的存在预测进化方向。生物化学与生物化学32: 879 - 887。
5. 道金斯R (2005)祖先的故事，波士顿:水手出版社。p。195。
6. Pieczenik G(1999)分类和识别生物信息的方法和手段。美国专利商标局5866363。
7. 新英格兰生物实验室(2020)手动-噬菌体显示肽库．
8. 木村M(1968)分子水平上的进化速率。自然217: 624 - 626。
9. King JL, Jukes TH(1969)非达尔文进化论。科学164: 788 - 798。