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介绍

目前还没有验证微RNA (mi)诊断大便测试筛选结肠癌(CC)市场上,因为粪便密度的复杂性,大便每日变化的脆弱性,在场的三个来源的microrna在凳子上(从粪便匀浆,游离exsosomal microrna从粪液和粪便colonocytes)。之前采用微阵列microrna的实验中,使用Affymetrix GeneChip microrna 2.0数组,immunocaptured和丰富凳子colonocytes 15主题[三个健康对照组和十二个结肠癌患者[三个TNM阶段0 - 1(例如,息肉≥1厘米,绒毛状或tubvillous,或与优质发育不良),三个阶段2,3三个阶段,miR-19a, miR-20a, miR-21, miR-31, miR-34a, miR-96, miR-106a, miR-133a, miR-135b, miR-206, miR-224和miR-302;2、miR-143和miR-145下调)。然后进行绝对定量数字PCR在这15个粪便样本TNM阶段0 - 4总小RNA提取immunocapture,紧随其后的是RT,雇了一个自定义TaqMan®microrna逆转录(RT)装备和TaqMan RT底漆池,和绝对量化microrna的副本/µl,使用基于芯片的Absolute QuantStudio 3D Digital PCR分析，可以验证微阵列的结果。为确保人类而非细菌的小总RNA被选择，共提取协议与大肠杆菌对K1菌株RS18进行检测，比较Agilent的电泳图谱与人、细菌的电泳图谱，并对随机样本进行mRNA/miRNA测序，以确保选择的是人而不是细菌的mRNA。

本文提供的定量dPCR miRNA数据表明，粪便中少数与左右结肠癌相关的成熟miRNA基因表达的定量变化，将为更方便、敏感、特异的诊断筛选分子标志物提供依据。比市场上现有的标记物更有用，如低灵敏度(<15%)粪便潜血试验(FOBT);导致更好的依从性;与昂贵的侵入性结肠癌结肠镜检查相比，更经济。如果在TNM早期发现，治愈该癌症的可能性更高，如果没有在转移前诊断，就会变得无法治愈和致命。

使用miRNA诊断结肠癌筛选试验的优点

单个基因的表达可能会因DNA突变或其RNA或蛋白质水平调节的改变而改变[1]。表观遗传沉默是导致结直肠癌（CRC）基因失活的重要机制[2]。对人类粪便中癌1高甲基化（HIC1）基因启动子甲基化的分析表明，它对结肠腺瘤和癌具有高度特异性（98%）[3]，但敏感性相当低（腺瘤为31%，所有癌症为42%），这表明仅表观遗传标记物不足以进行准确的诊断筛查，但是，要在早期疾病阶段可靠地识别大肠癌，需要结合遗传和表观遗传标记[4]。与处理脆弱的RNA分子相比，处理稳定的DNA相对容易[1]。

科学家的一项研究确切科学Corp .)、马尔堡,妈,这市场mutation-based DNA测试“Cologuard”,评估一个新版本的粪便DNA测试CRC检查使用波形蛋白甲基化标记,另一个变异DY标志加上非退化的DNA样本有限的44 CRC患者和122名正常对照[5]。它的敏感性为88%，特异性为82%，仅用于晚期癌症，而不用于早期腺瘤阶段。此外，DNA突变测试并不划算，因为筛选多个突变非常昂贵，因为这些苛刻的突变测试不是自动化的，而且是劳动密集型的。此外，对致癌基因和抑制基因的突变检测存在以下问题:a)检测这些基因突变的只有不到一半的大腺瘤和癌,b)基因突变的检测non-neoplastic组织,c)突变只存在于肿瘤的一部分,和d)突变通常会产生许多其他基因的表达变化[6、7]。

蛋白质方法目前不适合筛查和早期诊断,因为蛋白质是不特定的肿瘤或组织类型(例如,CEA),对蛋白酶的易感性,目前缺乏手段放大蛋白质,不以超过75%的预测功能蛋白质的多细胞生物,蛋白质丰度和活性之间并不总是直接相关的，最重要的是，这些标记物剥落后的检测通常表明肿瘤处于晚期。在微创体液(如血液)中，蛋白质表达的动态范围高达10¹⁰。此外，mRNA水平不一定与蛋白质表达相关。蛋白质微阵列研究表明，蛋白质表达远远超过RNA水平，只有翻译后修饰的蛋白质参与导致肿瘤发生的信号转导途径。在c临床试验被认为是结肠肿瘤形成的敏感和特异指标，尤其是在早期[7]。采用液相色谱（LC）-质谱（MS）的血清蛋白质组学研究以无偏见的方式进行，未能区分患有大腺瘤的个体(≤ 1 cm）和正常个体[9]。与核酸相比，蛋白质组学研究是一门较新的学科；因此，识别和验证适合用作临床标记物的蛋白质以及解决偏见和验证问题需要相当长的时间[10]。

另一方面，已经证明了转录组mRNA方法，以检测初步研究中具有高敏感性和特异性的腺瘤和结肠癌[1]，但没有进行随机化，标准化，盲化的前瞻性临床研究以验证优势mRNA方法。研究表明，转录组mRNA和miRNA表达签名的组合改善了CRC的生物分子分类[11]。此外，不仅miRNA调节mRNA，而且还调节蛋白质表达。两项研究表明，单一的miRNA充当细胞抑制曲调数百蛋白的表达[12,13]。因此，对于CRC筛选，MiRNA标记更加全面，优选DNA，表观遗传，mRNA或基于蛋白质的标记物[14-18]。通过PCR表达通过基于芯片的方法使用稳定的不可降解的miRNA的额外优点是自动，使得通过执行这些测定的实验室人员更加经济，更容易接受[4]。

小型非编码蛋白序列的发现，17-27个核苷酸长RNA（MicroRNA），开辟了开发非侵袭性筛查试验，以便对许多癌症的早期诊断进行非侵入性筛查试验。最新的miRBase2018年3月12日第22版[http://ww.mirbase.org]表明标记为“高置信度”的miRNA的总数到1996年比上一版本增加了168个[19]。MiRNA功能似乎可以调节发育[20]、凋亡[21]和特定的MiRNA在肿瘤发生[22,23]中至关重要，可以有效地对固体肿瘤[24-26]和液体肿瘤[27,28]进行分类，并且可以作为癌基因或抑制基因[30]。MiRNA基因经常出现在脆性位点，以及杂合性丢失的最小区域，或公共断点区域的扩增[30]，这意味着它们参与了癌症的发生。miRNA有可能作为癌症诊断、预后和/或治疗反应的生物标志物[31,32]。正常组织和肿瘤组织的miRNA表达谱不同[33,34]，这表明它们的表达谱比蛋白质编码mRNA基因的表达谱更准确地将相似的肿瘤类型聚集在一起[35,36]。

一项研究检测了315例正常结肠粘膜、小管上皮性腺瘤、精通DNA错配修复（pMMR）和DNA错配修复缺陷（dMMR）的腺癌样本中735个miRNA的整体表达代表散发性和遗传性CRC I-IV期提示pMMR和dMMR肿瘤中存在共同的生物学途径，尽管它们之间存在许多分子差异，包括miRNA水平的差异；表明需要注意错配DNA修复（MMR）[36]。

与筛选大量信使（m）RNA不同(1），用于将癌症分化为来自正常的癌症的适度数量，并且与mRNA不同，粪便中的miRNA仍然是完整的并且稳定的检测[38]，因此必须得出结论，MiRNA分子用于使用更好的标记为结肠癌开发可靠的非侵入性诊断标志物[14-18]，因为：a）细菌存在大肠杆菌不妨碍通过dPCR[38]等敏感技术检测miRNA, b)原发肿瘤或病变组织中的miRNA表达模式与粪便样本相同[37-40]。与miRNA检测相比较的金标准是“结肠镜检查”，从患者的医疗记录[41]中获得。然而，由于愈创木FOBT的低灵敏度仍是年度检查中最常用的筛查方法(www.cancer.org)[42]，该检测也应包括在人类粪便中与拟采用的dPCR诊断miRNA筛查方法进行比较。

凳子相对于其他测试介质的优势

与其他结肠癌筛查方法相比，粪便检测有几个优势，因为它确实是非侵入性的，不需要令人不愉快的泻药准备，正式的健康检查，或工作或日常活动之外的时间[43-46]。与乙状结肠镜不同的是，它能反映结肠的完整长度，取样的方式可以代表结肠的左右两侧。也有人认为，结肠细胞是连续和大量地释放到粪便流，而血液是间歇释放的，如愈创愈大便隐血试验(FOBT) [42];因此，这种自然富集现象部分地避免了使用实验室富集技术来富集致瘤结肠细胞的需要，例如，当血液用于筛选[47]时。此外，由于可以对标本邮寄进行检测，从地理位置上进行粪便筛查基本上是畅通无阻的。美国癌症协会(ACS)已经承认基于粪便的分子检测是一种有前景的CRC筛查技术(www.cancer.org)．

从粪便中分离结肠菌，并将Agilent电泳(18S和28S)模式与从全粪便中提取的总RNA进行比较[48-50]，以及RT裂解缓冲液(Quagen)对结肠菌进行差异裂解，可解释为验证T.粪便（18S和28S）中观察到的电泳模式确实是由于人类结肠细胞的存在，而不是由于粪便中的细菌污染大肠杆菌(16、23年代)。考虑到一些外泌体RNA会从纯化的结肠菌释放到粪便中，必须尝试纠正外泌体RNA效应[51]。

MiRNA dPCR研究设计

为了检测miRNAs作为可靠、定量、敏感和特异的诊断生物标志物，用于结肠癌的早期非侵袭性筛查，使用绝对dPCR检测，必须在一项使用巢式病例对照流行病学设计和使用前瞻性标本收集的研究中验证初步工作。美国国家癌症研究所早期检测研究网络(National cancer Institute 's Early Detection Research Network)对对照组受试者和试验结肠癌患者进行回顾性盲评价(PRoBE)http://edrn.nci.nih.gov用于癌症生物标志物发现研究．

选择14 miRNA，其中12个表达式的表达增加，2表明通过基于芯片的数字（D）PCR试验在表1和2中呈现出对绝对miRNA表达的表达降低，以及图1和图1。

表1。人类粪便中14种上调或下调的微rna的特征。

microrna的	差异	下调	染色体的位置	已知推定的癌症靶基因
MiR-19a	是的	没有	13 q31.3	待定
mir-20a.	是的	没有	13 q31.3	PTEN、TMP1
MiR-21	是的	没有	17 q23.1	PTEN、BCL2 PDCD4、TIMP3 SPRY2, REC, T1AM1
MiR-31	是的	没有	9 . 3	FOXC2 T1AM1, AX1N1, FOXP3 H1F1AN
mir-34a.	是的	没有	1p36.22	BCL2, TP53 E2F3、NOTCH1 E2F1 S1RT
mir - 96	是的	没有	17 q32.2	喀斯特
mir - 106 a	是的	没有	Xq26.2	PTEN，E2F1，RB1
mir - 133 a	是的	没有	18q11.2/20q13.33	巴克斯，克拉斯
mir - 135 b	是的	没有	1 q32.1	MSH2
mir - 200 c	是的	没有	12 p13.31	Zeb1.
mir-224.	是的	没有	Xp23	待定
MiR-30a	没有	是的	6个问题	RASA1, ERG、SEMA6D SEMA3A
mir - 143	没有	是的	5问	KRAS，MAPK7.DNMT3A
mir - 145	没有	是的	5问	APC, TGFBRE IRS1、STAT1 YES1 FLI1

表2．QuantStudio对粪便中上调/下调mirna的绝对定量研究^商标基于3D芯片的数字PCR。

FAM™，VIC®和ROX™染料，可从Life Technologies [49］

图1。图说明QuantStudio^商标3D数字PCR系统芯片；芯片盒盖（1）；数字PCR 20K 10毫米²纳米流体v2芯片(2)，包含20000个反应孔;QuantStudio^商标3D数字PCR芯片案例(3);芯片ID (4);装料口(5);以及反应孔，即悬浮单个PCR反应的20000个物理孔。

绝对定量数字PCR方法

数字PCR是一种新的mirna定量方法，是qPCR的替代方法绝对量化通过将一个DNA或cDNA样本分成许多独立的、平行的PCR反应;其中一些反应包含目标分子(阳性)，而另一些不包含目标分子(阴性)。一个分子可以被放大一百万倍甚至更多。在扩增过程中，染色标记探针的TaqMan化学被用来检测序列特异性的靶标。如果没有目标序列，就不会有信号积累。在PCR分析之后，阴性反应的比例被用来产生样品中目标分子的绝对数量，而不需要标准或内源性对照。在传统的qPCR中，来自野生型序列的信号占主导地位，而来自稀有序列的信号则被掩盖。通过最小化靶间竞争的影响，dPCR克服了扩增稀有序列的固有困难，并允许对选定的mirna进行敏感和精确的绝对定量。

本研究中使用的Applied Biosystem QuantStudio™3D仪器，仅对数字芯片进行成像和初步分析。芯片本身必须在双平块GeneAmp®9700 PCR系统上离线循环。或ProFlex™2x Flat PCR系统。qantstudio™3D数字PCR系统可以在不到1分钟的时间内读取数字芯片，跟随热循环[48]。它允许每个芯片一个样本;不过，双工允许在每个芯片上分析两个目标。当使用QuantStudio™3D数字PCR系统时，数字PCR的样品准备与实时定量PCR没有什么不同。为了从结果中计算出cDNA文库的浓度，如果一个包括所有必要的稀释因子到analysisite™软件中，软件将给出文库中的拷贝/µL。

需要考虑两种稀释度:(a)第一种是反应中样品的稀释度，(b)第二种是加入数字PCR反应前制作的原料的稀释度。例如，如果一个人想加入1µL的样品，该样品已从库存稀释为1:10。因此，如果在16µL(最终体积)反应中加入1µL的样品，则样品的稀释倍数为1:16或1/16 = 0.0625。因为股票也被稀释了1:10(0.1)，你也需要考虑这个因素。最终输入软件的稀释系数为0.0625 × 0.1 = 0.00625(1:160)。人们可以在analysisite™软件中使用任一注释来指示稀释因子。如果把这个值输入“稀释”栏，软件将给出起始材料(库存)中的拷贝数/µL。用于包含目标数量为>2000拷贝/μL的QuantStudio™3D芯片的项目的Poisson Plus算法。泊松加(Poisson Plus)算法以每个芯片为基础，对井与井之间的负载体积变化进行校正。在更高的目标浓度时，这一点变得很重要。 There is also an option to export the Chip data as XML on the Export tab-thousands of discrete subunits prior to amplification by PCR, each ideally containing either zero or one (or at most, a few) template molecules [50].

每个部分都作为一个单独的PCR反应——就像实时PCR荧光FAM探针[或其他，如VIC荧光]。含有扩增产物的样品被认为是阳性(1，荧光)，而那些没有扩增产物的样品——很少或没有荧光(即为阴性，0)。每个样品的阳性与阴性的比率是扩增的基础。与real-time qPCR不同，dPCR不依赖于扩增循环次数来确定每个样本中模板核酸的初始数量，而是依赖泊松统计量来确定绝对模板数量。dPCR独特的样品分割步骤，加上泊松统计允许更高的精度比两个传统的端点PCR。和qPCR方法;从而定量准确地分析稀有miRNA靶点[50,51]。

纳米流控芯片的使用(如下图所示)提供了一种方便和直接的机制来并行运行数千个PCR反应。每口井都装载样品、主混合和应用生物系统TaqMan检测试剂的混合物，并分别进行分析，以检测端点信号的存在(阳性)或不存在(阴性)。为了考虑可能接收到一个以上目标序列分子的井，使用泊松模型应用了修正因子。它具有一个过滤器集，为FAM™，VIC®和ROX™染料进行了优化，可从Life Technologies[49]获得。

芯片本身必须在双平块GeneAmp®9700 PCR系统上离线循环。或ProFlex™2x Flat PCR系统。qantstudio™3D数字PCR系统可以在不到1分钟的时间内读取数字芯片，跟随热循环[48]。它允许每个芯片一个样本;不过，双工允许在每个芯片上分析两个目标。当使用QuantStudio™3D数字PCR系统时，数字PCR的样品准备与实时PCR没有什么不同。为了从结果中计算出cDNA文库的浓度，如果一个包括所有必要的稀释因子到analysisite™软件中，软件将给出文库中的拷贝/µL。

需要考虑两种稀释度:(a)第一种是反应中样品的稀释度，(b)第二种是加入数字PCR反应前制作的原料的稀释度。例如，如果一个人想加入1µL的样品，该样品已从库存稀释为1:10。因此，如果在16µL(最终体积)反应中加入1µL的样品，则样品的稀释倍数为1:16或1/16 = 0.0625。因为股票也被稀释了1:10(0.1)，你也需要考虑这个因素。最终输入软件的稀释系数为0.0625 × 0.1 = 0.00625(1:160)。人们可以在analysisite™软件中使用任一注释来指示稀释因子。如果把这个值输入“稀释”栏，软件将给出起始材料(库存)中的拷贝数/µL。用于包含目标数量为>2000拷贝/μL的QuantStudio™3D芯片的项目的Poisson Plus算法。泊松加(Poisson Plus)算法以每个芯片为基础，对井与井之间的负载体积变化进行校正。在更高的目标浓度时，这一点变得很重要。 There is also an option to export the Chip data as XML on the Export tab-thousands of discrete subunits prior to amplification by PCR, each ideally containing either zero or one (or at most, a few) template molecules [50].

每个部分都作为一个单独的PCR反应——就像实时PCR荧光FAM探针[或其他，如VIC荧光]。含有扩增产物的样品被认为是阳性(1，荧光)，而那些没有扩增产物的样品——很少或没有荧光(即为阴性，0)。每个样品的阳性与阴性的比率是扩增的基础。与real-time qPCR不同，dPCR不依赖于扩增循环次数来确定每个样本中模板核酸的初始数量，而是依赖泊松统计量来确定绝对模板数量。DPCR的独特样品分区步骤，与泊松统计相结合，允许比传统和QPCR方法更高的精度;从而允许分析罕见的miRNA靶标QualititaTivley和Creatally [50]。

纳米流控芯片的使用(如下图所示)提供了一种方便和直接的机制来并行运行数千个PCR反应。每口井都装载样品、主混合和应用生物系统TaqMan检测试剂的混合物，并分别进行分析，以检测端点信号的存在(阳性)或不存在(阴性)。为了考虑可能接收到一个以上目标序列分子的井，使用泊松模型应用了修正因子。它具有一个过滤器集，为FAM™，VIC®和ROX™染料进行了优化，可从Life Technologies[49]获得。

一个由QuantStudio编写的dPCR程序的工作流^商标3D数字PCR系统如图2所示．

图2。用于结肠癌癌症的数字miRNA PCR的工作流程在人结肠组织或粪便样本中

数字PCR,然而,有几个建议:1)感兴趣的粗略估计的microrna的浓度必须首先进行,为了使适当的稀释,所以没有太多的分区会得到多个副本,防止准确计算感兴趣的microrna的拷贝数;2)使用“引物池法”进行反转录时，每个miRNA必须建立非模板对照和RT阴性对照;3)基于芯片的dPCR方法需要更少的移液步骤，与Bio-Rad Laboratories销售的另一种类型的dPCR相比，减少了潜在的PCR污染，因此被称为“Bio-Rad的液滴数字PCR”，这需要多次移液，可能增加污染的风险[50];4)Quant Studio^商标3D芯片有20000个固定反应孔，而Bio-Rad的液滴PCR依赖液滴的产生;正如Miotto等人[11,48]所报道的那样，这一步骤可能是极其可变的。

一个dPCR数据如表1和表2所示，如图1所示，其中14个与结肠癌相关的成熟mirna优先表达(12个上调，miR-19a, miR-20a, miR-21, miR-31, miR-34a, miR-96, miR-106a, miR-133a, miR-135b, miR-206, miR-224和miR-302;和2个下调，miR-143和miR-145)在健康对照组和0-1至4期结肠癌患者的粪便样本中。

使用5个水平因子类型(正常，阶段01，阶段2，阶段3，阶段4)，通过单因素方差分析获得标准偏差(sd)。还报告了调整后的r平方值，代表由类型解释的变异比例。类型was statistically significant for every gene;all p-values were less than 0.000001 (no adjustmentsfor multiple comparisons). These data are tabulated in Table 3, andshown graphically in Figure 1.

表3。SDs和R的表示²采用绝对数字PCR检测mirna。

类型	米 -19年,一个	miR-20a	miR-21	miR-31	miR-34a	mir - 96	mir - 106 a
sd	92.239	111.1033	99.76355.	146.641	209.0491	278.4756	301.8764
r2	99.4831	99.18486	99.34603	98.65141	97.63002	96.13899	96.19772
类型	miR-133a	miR-135b	mir - 200 c	mir - 224	miR-30a	mir - 143	mir - 145
sd	300.0619	409.6717	449.8674	376.8437	424.9972	132.7633	110.8927
r2	96.85741	95.49454	96.70427	97.61795	97.95389	99.87075	99.91289

图1中每个基因的最小值和最大值都已经显示出来，以使表达更加清晰。一个T.T.op left is high expression Value of 9985, which is the maximum value for that gene, at the bottom one finds the value for the minimum The colors rangefrom dark blue(control) to orange (stage 4). The groups are also distinguished by line type: control (solid), stage0-1 (long dash), stage 2 (dash), stage 3 (dot), stage 4 (dash nd dot). The figure is a parallel coordinate plot made in R, using the package MASS. For statistical analysis.

dcr - mirna诊断粪便筛查方法的创新及临床意义

创新在于多种方法的集体运用，如:我免疫顺磁珠从苛刻的、无创的粪便环境中捕获结肠细胞，其提取的脆弱的总小RNA在粪便排泄后不久由商业试剂盒稳定，因此它永远不会片段，随后在粪便样本中进行标准化分析定量miRNA dcr芯片分析，既不需要劳动密集型，也不需要大量的样品准备，以发展一组用于绝对定量诊断筛选的稳定mirna早期零星结肠癌（第0-1阶段），更便宜，敏感性高，特异性高于市场上任何其他结肠癌筛查试验。需要从粪便样品中分离结肠细胞，以提供我们所提出的miRNA方法如何执行的定量估计。虽然我们可能错过外泌体RNA，但是也可以在从粪便样品获得的miRNA上进行并行试验，以比较仅使用结肠细胞时损耗的程度，并且可以进行适当的对外损失的校正[51]（图3）．

图3．Quantstudio绝对量化人类粪便中的上调或下调的miRNA^商标3D数字PCR芯片系统

致谢

我们感谢为研究提供粪便样本的志愿者;东卡罗莱纳大学生物统计学系的Paul W. Vos博士进行数据统计分析，北卡罗莱纳大学教堂山分校文艺复兴计算研究所的Clark D. Jeffries博士进行生物信息学研究。在进行本研究或数据分析/解释过程中不存在利益冲突。这项研究的经费由GEM Tox实验室的营运基金提供。

参考文献

1. Ahmed FE, Vos P, iJames S, Lysle DT, Allison RR，等(2007)在粪便和组织中筛查人类结肠癌的转录组分子标记。癌症基因组Proteom4：1-20。[crossref]
2. Ahmed FE(2007)结肠癌表观遗传学:环境因素的作用和分子生物标志物的寻找。环境科学与健康C环境癌生态毒理学综述25日:75 - 130。[crossref]
3. Lenhard K，Bommer GT，Asutay S，Schauer R，Brabletz T等（2005）粪便中启动子甲基化分析：检测结直肠癌的新方法。中国新药杂志3: 142 - 149。
4. Davies RJ, Miller R和Coleman N(2005)大肠癌筛查:分子粪便分析的前景。自然加速癌症5: 199 - 209。[crossref]
5. Itzkowitz Sh，Jandorf L，Brand R，Rabeneck L，Schroy PC III，等。（2007）改善了结直肠癌筛选的粪便DNA测试。中国新药杂志5: 111-117.[crossref]
6. Imperiale TF, Ransohoff DF, Itzkowitz SH, Turnbull BA, Ross MA(2004)在平均风险人群中粪便DNA和粪便潜血对大肠癌筛查的影响。新Eng J Med351: 2704 - 2714。[crossref]
7. 凯恩斯，西达兰斯基(1999)癌症诊断的分子方法。Biochim Biophys学报1423:C11-C18。
8. Ahmed FE(2009)液相色谱-质谱:蛋白质组分析和生物标志物发现和验证的工具。Exp-Opin-Mol诊断3:429 - 444。[crossref]
9. Greenbaum D，Colangelo C，Williams K，Gerstein M（2003）在基因组尺度上比较蛋白质丰度和mRNA表达水平。基因组医学杂志4：117-126。[crossref]
10. Rifai N，Gillette Ma，Carr，SA（2006）蛋白质生物标志物发现与验证：临床效用的长而不确定的途径。自然Biotechol24: 971-983.[crossref]
11. 关键词:微卫星不稳定结直肠癌，mRNA/microRNA，基因表达谱摩尔癌症6: 54。
12. Baek D, Villén J, Shin C, Camargo FD, Gygi SP，等(2008)microrna对蛋白质输出的影响。自然455: 64 - 71。[crossref]
13. Selbach M, Schwarheuser B, Thierfelder N, Fang Z, Khanin R, et al. (2008) microrna诱导蛋白质合成的广泛变化。自然455: 58 - 63。
14. 关键词:微卫星不稳定结直肠癌，mRNA/microRNA，基因表达谱摩尔癌症54。[crossref]
15. Ahmed Fe，Ahmed NC，Gouda M，VOS PW（2017）MIRNA用于粪便或血液中结肠癌早期阶段的诊断筛查。外科病例代表1: -。
16. Ahmed FE (2014) miRNA作为结肠癌诊断筛查的标志物。专家Rev抗癌14: 463-485.[crossref]
2021版权所有。版权所有
17. Ahmed FE, Ahmed NC, Gouda MC, Bonnerup C (2017) MicroRNA作为结肠癌筛查的分子标志物。外科侵入性手术病例报告1：14-15。
18. Ahmed FE (2017) MicroRNAs在粪便和血液中作为结肠癌诊断筛查的分子标志物。Int地中海牧师9: 124。
19. Kozomara A和Griffiths-Jones S (2018) miRBase:使用深度测序数据注释高可信度microRNA。核酸Res43: D68-D73。[crossref]
20. Reinhart BJ, Slack FJ, Basson M, Pasquinell AE, Bettinger JC，等(2000)RNA调控秀丽隐杆线虫的发育时机。自然403: 901-906.
21. Xu P, Guo M, Hay BA (2004) microrna与细胞死亡的调控。趋势麝猫20：617-624。[crossref]
22. (2005) MicroRNA生物发生与癌症。癌症es.65: 3509-3512.[crossref]
23. 微rna分析在癌症诊断中的意义。oncogene.25日:6220 - 6227。[crossref]
24. Yanaihara N, Caplen N, Bowman E, Seike M, Kumamoto K, et al.(2006)独特的microRNA分子谱在肺癌诊断和预后中的应用。癌症细胞9: 189 - 198。[crossref]
25. Iorio MV, Ferracin M, Liu CG, Veronese A, Spizzo R, et al.(2005)人乳腺癌MicroRNA基因表达失调。癌症es.65: 7065 - 7070。[crossref]
26. 康明斯JM，何Y，李里RJ，帕利亚里尼R，迪亚兹LA Jr，等（2006）大肠微RNA组。美国科学院学报103: 3687-3692.[crossref]
27. Calin GA, Ferracin M, Cimmino A, Dileva G, Shimiz M, et al.(2005)与慢性淋巴细胞白血病预后和进展相关的microRNA特征。新英格兰医学杂志353: 1793 - 1801。[crossref]
28. (2005) miR-155和BIC RNA在人B细胞淋巴瘤中的积累。美国科学院学报102: 3627 - 3632。[crossref]
29. Chen CZ (2005) MicroRNAs作为癌基因和肿瘤抑制因子。英国医学杂志353: 1768-1771.[crossref]
30. Calin GA, Sevignai C, Dumitru CD, Hyslop T, Noch E, et al.(2004)人类microRNA基因通常位于涉及癌症的脆弱位点和基因组区域。美国国家科学院学报101: 2999 - 3004。[crossref]
31. schpler T, Reinert JT, Oslenfeld MS, Christensen LL, Silahtaroglu AN, et al. (2008) II期结肠癌的诊断和预后microrna。癌症es.68: 6416 - 6424。[crossref]
32. Schetter AJ, Leung SY, Sohn JJ, Zanetti KA, Bowman ED，等(2008)MicroRNA表达谱与结肠腺癌进展和治疗结果相关。J医学会299: 425-436.[crossref]
33. Barbarotto E, Schmittgen TD, Calin GA (2008) microrna与癌症:概要，概要，概要。Int J癌症122: 969 - 977。[crossref]
34. Calin GA, Croce CM(2006)人类癌症中的MicroRNA标记。Nat牧师癌症6: 857 - 866。[crossref]
35. Lu J, Getz G, Miska EA, Alvarez-Saavedra E, Lamb J, et al. (2005) MicroRNA表达谱对人类癌症的分类。自然435: 834 - 838。[crossref]
36. Oberg AL, French AJ, French AJ, Sarver AL, Subramanian S, et AL . (2011) MiRNA在结肠息肉中的表达为结肠癌的多靶点模型提供了证据。《公共科学图书馆•综合》6: e20465。[crossref]
37. Ahmed FE，Jeffries CD，Vos PW，Flake G，Nuovo GJ等（2009年）粪便和组织中筛查散发性人类结肠癌和溃疡性结肠炎的诊断性microRNA标记物。癌症基因组蛋白质6: 281 - 296。[crossref]
38. Ahmed FE (2007) miRNA在肿瘤发生和生物标志物选择中的作用:方法学观点。专家Rev Mol Diagn7: 569-603.[crossref]
39. Ahmed FE (2014) microRNA分子在结肠癌病因学中的作用。临床生物医学6: 2。
40. Ahmed FE, Ahmed NC, Vos PW, Bonnerup C, Atkins JN，等。癌症基因组蛋白质组学10: 93 - 113。[crossref]
41. Peterson NB, Murff HJ, Ness RM, Dittus RS(2007)美国男性和女性结肠直肠癌筛查。J妇女健康(Larchmt)16：57-65。[crossref]
42. Morikawa T, Kato J, Yamaji Y, Wada R, Miksushima T, et al.(2006)免疫化学粪便潜血试验和全结肠镜检查在无症状人群中的比较。胃肠病学125: 422 - 428。[crossref]
43. Matsushita HM, Matsumura Y, Moriya Y, Akasu T, Fujita S, et al.(2005)一种从自然排出的粪便中分离结肠细胞的新方法及其在大肠癌诊断中的临床应用。胃肠病学129: 1918 - 1927。[crossref]
44. Davidson LA，Lupton JR，Miskovsky E，Fields AP，Chapkin RS（2003）使用脱落结肠细胞定量人类肠道基因表达谱：一项初步研究。生物标记物8: 51 - 61。[crossref]
45. JørgensenOD，Kronborg O，Fenger C（2002）使用粪便隐血血液检测进行结直肠癌筛选的随机研究：结果13年后七个双年筛选回合。肠道50: 29-32。[crossref]
46. Link A, Balaguer F, Shen Y, Nagasaka T, Lozano JJ, et al.(2010)粪便microrna作为结肠癌筛查的新生物标志物。癌症流行病学生物标记19:1766 - 1774。[crossref]
47. Ahmed FE, Ahmed NC, Vos PW, Bonnerup C, Atkins JN, et al.(2012)诊断microRNA标记物筛查散发性人结肠癌血液。癌症基因组Proteom9：179-192。[crossref]
48. https://www.agilent.com/cs/library/pplications/5989-1165 en.pdf.
49. Schroeder A, Mueller O, Stocker S, Salowsky R, Leiber M, et al .(1993) RNA完整性值:一个RNA完整性值，用于分配RNA测量值。BMC MOL BIOL.7: 3。[crossref]
50. Fleige S, Pfaffl MW (2006) RNA完整性及其对实时qRT-PCR性能的影响。摩尔地中海方面27: 126-139.[crossref]
51. Valadi H, Elkstrom K, Bossios A, Sjostrand M, Lee JJ，等(2007)外泌体介导的mrna和microrna转移是细胞间遗传交换的一种新机制。Nat细胞生物9: 654 - 659。[crossref]