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收稿日期:2019年3月14日
录用日期:2019年3月26日
发布日期:2019年4月02日
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©2019 Brukner I.这是一篇开放获取的文章,根据创作共用署名许可条款发布,该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、发布和复制,前提是注明原作者和来源。
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Brukner I (2019) tcdB艰难梭菌生物标志物的绝对和相对表现。整合Mol Med 6 DOI: 10.15761/ im .1000363
麦吉尔大学医学院,加拿大魁北克省蒙特利尔
加拿大魁北克犹太总医院医学部
加拿大魁北克戴维斯夫人医学研究所
加拿大魁北克戴维斯夫人医学研究所
麦吉尔大学医学院,加拿大魁北克省蒙特利尔
麦吉尔大学病理学系,魁北克,加拿大
麦吉尔大学医学院,加拿大魁北克省蒙特利尔
加拿大魁北克犹太总医院微生物科
麦吉尔大学医学院,加拿大魁北克省蒙特利尔
加拿大魁北克犹太总医院医学部
DOI: 10.15761 / IMM.1000363
艰难梭状芽胞杆菌感染是抗生素相关性假膜性结肠炎的主要病因,如果不被发现或不治疗,这种疾病可能是致命的。在美国,平均每年有15000人死亡,50万新发病例。目前使用的诊断性生物标志物是tcdB基因或其基因产物(毒素B)。该测定方法的临床解释特别具有挑战性:(1)生物标志物检测可以在没有症状表现的情况下进行,(2)由于测定灵敏度限制而缺失的生物标志物可能是致命的。为解决临床不确定性,已考虑定量分析。尽管多方努力,tcdB/toxB的定量阈值仍未建立,且具有显著的临床影响。在这里,我们阐明了为什么基于质量/体积的正常化在过去是徒劳的。具体来说,测量菌群总数(使用“通用细菌”16S qPCR rDNA测定法)来计算相对丰度C固执的的tcdB生物标志物之间存在强而显著的负相关C difficile(右2N = 227 = 0.73, P = 10-39年)和其余的肠道微生物。新的参数(Cq (toxB)-Cq (16SrDNA))是从两个生物标记物计算出来的,与采样变异性无关,并固有地包含了破坏特性C固执的其余的微生物群。通过整合tcdB的相对丰度(在总菌群的背景下),并纠正“急性腹泻的生物量冲刷/稀释效应”,这些生物标志物可以共同提高CDI检测的预测价值。
细菌生物量是粪便有机部分[1]的主要组成部分(干固体的25-54%)。粪便、粪便拭子或直肠拭子是用于腹泻分子诊断的样本类型。样品加工涉及到各种技术变量。例如,可通过在次采样前将粪便均质化和在样品处理[2]之前使用标准体积输入(使用10微升微生物循环)来改善粪便异质肠道微生物组含量的采样。然而,尽管有所有的预防措施,由于病例相关的差异“生物量冲刷”,肠道物质在不同的患者之间是“不同稀释”的,在出现急性腹泻症状时,总细菌负荷可能变化到几个对数值[3]。当分析前取样变异性较大时[1,2,4-8],而量化是为了建立患者的临床状态,基于样本质量或样本量的归一化是无效的。
最近的报道表明,tcdB检测的周期阈值(Cq)在有症状和无症状患者之间重叠。毒性基因tcdB PCR的中位Cq值梭状芽孢杆菌-阳性健康个体的tcdB基因载量明显高于有症状的患者,表明无症状定殖者的粪便中存在较低的tcdB基因载量。然而,缺乏一个数值上的共识,未来的诊断策略也不是决定性的[9-16]。尽管有证据表明,qPCR和新的“超灵敏”酶免疫分析技术在CDI检测中都具有单分子分辨率,但采样的分析前可变性至少可以部分解释目前无法建立具有实际临床价值的精确定量阈值[12,17-20]。由于基于质量或体积的腹泻正常化不能纠正急性CDI期过去肠道内容物的冲刷,症状和无症状的toxB/tcdB阳性样本将提供部分重叠的绝对定量值。我们应用了Cq值的相对归一化,该策略在“典型”基因表达研究中得到了很好的描述和推广,并在MIQE指南中得到了总结[21,22]。在此,我们报告了“其余细菌微生物”与tcdB生物标志物呈负相关,从而提供了有价值的生物标志物,能够清楚地识别tcdB负担极高的样本,独立于每体积和/或粪便物质的tcdB绝对浓度。
样品处理方法与BD GeneOhm TM C diff分析手册(https://www.bd.com/resource).所有的寡核苷酸由集成DNA技术公司(IDT)(美国爱荷华州)合成:tcdB引物MTO2F (5'TGCAGCCAAAGTTGTTGAAT3 ')和MTO2R (5'GCTCTTTGATTGCTGCACCT3 '),探针MTO2P (/56-FAM/TCTGAAGGA/ZEN/TTACCTRTAATT GCAA/3IABkFQ/;qantinova探针PCR试剂盒(Cat No.;/ID: 208254,加拿大Qiagen);抑制控制靶点的完整序列为(5 ' tgcagccaaagttgttgaatgcaatggtcccaatggctaacgcgcagagccttcaggtcagaaatttgccatc cgagacatcaggtgcagcagcaatcaaagagc3 '),通过水解探针/56-FAM/TTCTGACCT/ZEN/GAAGGCTCTGCGCG/3IABkFQ/检测。描述的tcdB qPCR方法在过去通过多种商业检测(艰难梭菌快速检测完成,Alere;BD Max, BD和BD GeneOhm, BD),在我们机构使用了近10年,以检测tcdB生物标志物阳性的症状患者。使用通用16S rDNA扩增子获得样品的相对归一化,作为总细菌负荷的测量,如所述[23]。qPCR在Roche Light Cycler 480仪上进行,PCR程序如下:等待94oC加热2分钟,循环45x (94oC, 10秒,随后启动,延伸和获得荧光在50oC 20秒)。对RFU(相对荧光单位)与周期曲线进行可视化分析。内PCR阳性对照为基因组DNA梭状芽孢杆菌ATCC 43255,调整以产生正的和稳定的Cq值。采用LC480软件(V 1.5.1.62 SP3),采用二阶导数分析和高灵敏度模式计算Cq值。根据tcdB和/或抑制试验结果与曲线形状之间的相互作用和/或生成的Cq值,由操作员(阳性/阴性/抑制)决定结果。在稀释10倍的样品上进行总细菌负荷定量(与等效的tcdB试验相比),以确保16S rDNA反应的抑制不是确定Cq值的主要因素。在校正样品稀释后,计算16S和tcdB反应(每个反应在不同的孔中进行)的Cq值的差异。
2015年在犹太总医院临床微生物实验室收集经实验室开发试验(tcdB qPCR)宣布为tcdB阳性的临床粪便样本227份。在这些样品中测量总细菌载量(16s rDNA的Cq qPCR值)作为第二个生物标志物。本组患者tcdB的Cq平均值为28.8,最小-最大值范围为20.5 ~ 38.6。重复性测量的标准差低于2 Cq单位。选择第二个生物标志物的目的是标准化分析前样品的可变性,即计算的相对丰度梭状芽孢杆菌在整个粪便菌群中。临床标本(16S rDNA qPCR)细菌总负载量Cq值分布平均为16.6,最小-最大值为12.2 ~ 23.7。使用配对的数值数据(tcdB和16S rDNA),每个样本的相对丰度C。难相处的计算,从而修正了无法控制的抽样变化(如大便量、大便量和排便频率)。当tcdB的绝对Cq值与相对值相互对照时,强相关性(R2N = 227 = 0.73, P = 10-39年)。数量Cq (tcdB) - Cq (16S rDNA)反映tcdB在总植物区系中的相对丰度。这个数字的平均值是12.9,最小最大值范围在2.2到20.2之间。的相对丰度越小C固执的是多少。如果这个数字保持恒定,并且独立于tcdB生物标志物的浓度,我们就会假设梭状芽孢杆菌与其余的细菌微生物有共生关系。然而,数据表明,过度增长梭状芽孢杆菌强烈抑制其余肠道菌群(通过竞争),提示肠道生态系统的病原物种侵略性过度生长。毒性物质的相对丰度梭状芽孢杆菌在无症状病例中,通常只代表一小部分[24]。例如,最近对肠道微生物群的高分辨率分析揭示了梭状芽孢杆菌负担,暗示着富足梭状芽孢杆菌CDI患者的[25]为1.78%或更高,与健康对照组(0.008%)差异较大。总之,通过测量tcdB相对于总菌群的相对丰度,该方法修正了急性腹泻期间粪便样本的“生物量冲刷/稀释”效应,并捕获了个体的比例梭状芽孢杆菌和其他的微生物群相比。这两种生物标志物的联合使用可以提高检测CDI的预测价值。
感谢Mm Coleen Delisle和Jack Travors博士的批判性意见和建议,感谢Yves Longtin博士对技术进步主题的持续兴趣,感谢Andre Dascal博士为建立临床微生物学和新型分子技术之间的桥梁所做的努力。工作部分由CIHR资助(申请号为345267)。我们要感谢Nadia Nour博士为商业化所做的努力。
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收稿日期:2019年3月14日
录用日期:2019年3月26日
发布日期:2019年4月02日
©2019 Brukner I.这是一篇开放获取的文章,根据创作共用署名许可条款发布,该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、发布和复制,前提是注明原作者和来源。
Brukner I (2019) tcdB艰难梭菌生物标志物的绝对和相对表现。整合Mol Med 6 DOI: 10.15761/ im .1000363
犹太总医院,内河街3775号,Montréal, E-613室,Québec, H3T 1E2,加拿大
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