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摘要

建立了高效液相色谱-二极管阵列检测棕榈基异丙酯中对甲苯磺酸异丙酯(IPTS)的改进方法。样品制备包括一种易于操作的溶剂萃取技术，允许IPTS在非常低的水平上被检测和定量。该方法的检出限为0.96 μg/g，定量限为2.91 μg/g。从棕榈酸异丙酯和异丙酯两种异丙酯中回收IPTS豆蔻酸盐,范围分别为96.1 ~ 102.1%和90.2 ~ 96.8%。该方法的变异系数小于7%，具有较好的准确性和精密度。校准曲线(0.25 ~ 20 μ g/ mL)的相关系数为0.9999。该新方法用于分析不含IPTS的商品异丙酯(基于已公布的GC-FID分析方法)。结果再次证实，0.96 μg/g未检出IPTS。采用气相色谱-质谱联用仪(GC-MSD)对异丙酯加标样品进行了IPTS鉴定。

关键字

石油化学，基因毒性活性，异丙酯，对甲苯磺酸异丙酯，高效液相色谱法，方法验证

简介

异丙酯广泛用于化妆品和局部药物制剂，特别是当需要通过皮肤传递有效成分时。许多异丙酯生产厂家采用的传统方法是脂肪酸与异丙醇酯化。p-甲苯磺酸是该工艺常用的均相催化剂。在酯化过程中，可能发生被称为磺基化的副反应。该工艺条件(无碱、无水、高温)可能导致糖基化。磺基化包括p-甲苯磺酸与异丙醇形成副产物异丙基p-toluenesulfonate(进行)。

IPTS或异丙基甲磺基酯与其他类型的烷基甲磺基酯、甲磺酸酯和苯磺酸酯的遗传毒性活性已在一项研究中得到证实在体外研究[3]。迄今为止，只有欧洲药品管理局(EMA)和美国食品和药物管理局(FDA)提出的一份议定书草案中有基因毒性杂质的限制，主要涉及原料药和产品[4,5]。到目前为止，还没有对异丙酯中IPTS的监管限制。包括IPTS在内的各种类型磺酸酯定量分析的色谱方法已有报道，但仅限于原料药和制品[6-14]。在我们过去的工作中，采用气相色谱-火焰离子化检测器(FID)测定棕榈油衍生的异丙酯中的IPTS。该方法检测限为12.5µg/g，定量限为25µg/g[15]。在这项工作中，我们报告了一种改进的方法，使用高效液相色谱与二极管阵列检测器(DAD)。该方法可以在极低的精度和精密度下检测和定量棕榈油衍生异丙酯中的IPTS。

实验

化学品、材料及仪器

马来西亚Pulau Pinang的AcidChem International Sdn Bhd提供了用于回收研究的棕榈酸异丙酯和肉豆酸异丙酯样品。用该方法监测IPTS的异丙酯从商业公司获得。阿波罗科学公司(英国柴郡)提供异丙基p-甲苯磺酸盐(纯度97%)。hplc级乙腈(>99.0%纯度)和纯净水均由Fischer Scientific (Pittsburgh, PA, USA)提供。在杜兰^®容量烧瓶(10毫升)来自肖特有限公司(美因茨，西德)，而电子分配器Multipette流，0.2和2.5毫升的组合从埃本多夫(汉堡，德国)购买。微瓶(部件号:5182-0715)从安捷伦科技(Palo Alto, CA, USA)获得，涡流混合器由Benchmark科学公司(New Jersey, USA)提供。Hypersil Gold反相C8色谱柱(250 mm × 4.6 mm I.D, 5 μm粒径)产自Thermo Scientific Ltd (Walthan, MA, USA)。

校准标准的解决方案

采用hplc级乙腈制备IPTS初始标准原液(≈1000 μg/mL)。用乙腈稀释至100 g/mL作为二次原液。用乙腈稀释二次原液配制6个浓度范围为0.25 ~ 20 μg/mL的校准标准品。

加标/回收率研究的样品制备

在每种情况下，异丙基酯(2g)转移到10 mL的容量瓶中，使用初始标准原液(1000 μg/mL)加入IPTS。然后，制备出IPTS含量为2.5、5.0和50.0µg/g的3个标配的异丙酯。IPTS从加标样品中使用这里描述的溶剂萃取技术。将乙腈填充到刻度(10 mL)，用涡流搅拌器将混合物均质几分钟，以方便将IPTS萃取到乙腈馏分中。当混合物沉淀成两层后，上层(乙腈)小心地转移到另一个10ml的容量瓶中，直到大约1ml剩余的乙腈留在酯层上方。加入第二部分乙腈(2 mL)，然后加入第三部分乙腈(1 mL)，分别进行第二次和第三次萃取。收集的乙腈提取物与第一提取物结合。在使用HPLC-DAD分析之前，在量瓶中相应地调整组合提取物的体积为10 mL。

监测工业异丙酯中IPTS的样品制备

将商品异丙酯(2g)准确转移到10ml容量瓶中。样品加标量分别为1µg/g和5µg/g。从异丙酯中提取IPTS的工艺与加标/回收研究中描述的相同。在HPLC-DAD分析之前，用乙腈填充含有组合提取物的10ml容量瓶至标记处。

HPLC和分析条件

分析使用的是安捷伦高效液相色谱(Palo Alto, CA, USA)。该系统配备了一个二极管阵列探测器、一个四元泵和一个恒温柱室。使用安捷伦开放实验室化学站软件进行数据采集和仪器控制。使用自动进样器将标准、加标和空白酯样品(5µL)注入HPLC系统。采用反相C8色谱柱等压分离。流动相为乙腈:水(50:50 v/v)的混合物。流速1.0 mL/min，柱温24^oC. IPTS定量采用外部校准。

气相色谱-质谱鉴定

采用气相色谱-质谱联用检测法(15)对加标的异丙酯样品中IPTS进行检测。加入的样品首先使用新开发的高效液相色谱法进行分析，并通过与IPTS标准品的保留时间进行比较来确定IPTS峰。然后对相同的样本进行GC-MSD分析。分析使用7890A-5975C Agilent Technologies GC-MS，配以Agilent 19091J-413 MSHP-5色谱柱(30 m长x 0.25 mm ID, 0.25 μm膜厚)。烤箱温度设定为100的起始温度^º然后在4ºC/min上升至250ºC，在250ºC继续保持10 min。样品(1µL)以10:1的分离模式直接注射。采用电子冲击(EI)模式，扫描范围为35.0 ~ 500.0。以纯度为99.99%的氦气为载气，流速1.0 mL/min。入口温度和压力分别为250ºC和10.52 psi。

结果

利用高效液相二极管阵列检测器成功地开发了棕榈酸异丙酯和肉豆蔻酸异丙酯中IPTS的低水平检测方法。图1为IPTS标准品(0.5µg/mL)、空白和异丙酯加标2.5µg/g酯的代表性HPLC色谱图。通过系统适用性测试和方法验证对该方法进行评价，如线性、灵敏度作为检测限和定量限、精密度和选择性。通过对1 μ g/mL IPTS溶液的分析得到的系统适宜性参数为:理论板数>2000，尾砂因子<2.0，峰对称性在0.9 ~ 1.2范围内，容量因子>2。校准曲线的方程为y = 127.39x + 3.1282(图S1)，相关系数为R²0.9999)。该方法检测限为0.96 g/g，定量限为2.91 g/g。在乙腈中重复注射IPTS标准品，浓度接近定量(0.5µg/mL)，以评价HPLC系统的精密度。结果表明，峰面积的注射精度< 2.96%，保留时间< 0.8%。制备6份IPTS标准液(2.5µg/g)独立样品，评价方法精密度。每个样品溶液注射一次。所得RSD %为4.21% (IPM)和9.53% (IPP)。表1显示了IPTS在异丙酯、IPP和IPM中加标/回收的准确度结果。

表1。IPTS在异丙酯、IPP和IPM中加标/回收，获得了准确性结果。

水平飙升 (μg g－1）	平均回收率(%)±SD (CV) n = 4
	IPP	IPM
2.5	102.1±6.2 (6.08%)	96.8±4.2 (4.35%)
5．0	96.5±4.7 (4.92%)	90.2±3.9 (4.37%)
25.0	96.1±2.7 (2.84%)	96.03±2.8 (2.93%)

IPP =棕榈酸异丙酯;IPM =十四烷酸异丙酯;IPTS=对甲苯磺酸异丙酯，SD =标准差，CV =变异系数，n =重复次数

图2a显示了加标的异丙酯(25µg/g)的代表性GC-MS总离子色谱(TIC)。IPTS在乙腈(5µg/mL)中的滞留时间为14.99 min (TIC未显示)。在添加了25µg/g的异丙酯中，在14.99 min的峰被初步鉴定为IPTS。使用安捷伦GC-MSD Mass Hunter软件中的NIST库进一步确认加标酯中的峰为IPTS。IPM和IPP与加标的异丙酯样品(图2b)和文库(图2c)的质谱(14.99 min)匹配率分别为78.1%和80.1%。这进一步证实了IPTS的身份。

图2。IPP中IPTS标准品的总离子色谱图(a)和质谱图(b)以及文库中的质谱图(c)。

方法对商品异丙酯的适用性

本研究的目的是检测IPTS，其检出限远低于文献报道的GC-FID法12.5µg/g(15)。首先对不同来源的8种商品异丙酯进行了GC-FID分析，未检测到IPTS。这些相同的样品用新开发的方法再次分析。检测结果显示，IPTS检测结果为0.96 μ g/g, LOD低得多。为了进一步证实新方法的适用性，同样的8个商业样品加标为1µg/g(接近检测限)、5µg/g和25µg/g。该方法能够在商业样品中检测出1µg/g的IPTS峰。8个加标样品的回收率分别为5µg/g和25µg/g，均在80-120%的可接受范围内。

讨论

样品制备，色谱方法开发和系统适用性

在以往用气相色谱-火焰离子化检测器分析异丙酯中IPTS的工作中，在气相色谱分析之前采用了一种简单的溶进样制备技术。样品注入采用10:1[15]的入口分流比。然而，这种样品制备技术有一定的局限性。基质的存在限制了能被引入气相色谱入口的加标IPTS的数量。如果需要更低的检测限，可能需要在GC系统中引入更高的样本量。这是通过改变分流比或使用无分流入口模式完成的。然而，酯基质的存在可能导致气相色谱柱过载。这反过来可能导致基质干扰IPTS峰值。

本研究发现，利用HPLC-DAD法检测化妆品基质中异丙酯中的IPTS是可能的。然而，样品制备和流动相组成进行了修改。流动相混合物的水相是hplc级的水，不添加缓冲液四丁基磷酸铵，如用于化妆品基质[16]的方法。在不添加缓冲液的情况下，高效液相色谱流动相混合物能够选择性地检测异丙酯中的IPTS。异丙酯采用了不同的样品制备技术。对于化妆品，第一步是将样品溶解在乙腈中，然后用涡激器均匀化。然后，每个样品在注入HPLC系统之前用特氟龙过滤盘过滤。然而，用于化妆品的样品制备技术不适合异丙酯。酯类不溶于乙腈，会发生相分离，不能直接注入。用乙腈从酯中提取IPTS。 IPTS had good solubility in acetonitrile but isopropyl esters were insoluble. Therefore, any IPTS present in the esters would be collected in the acetonitrile fraction during the mixing process. The direct injection method used for cosmetic products limits the amount able to be used during sample preparation. The method is only able to analyse IPTS without matrix interference using a weight/volume of 0.04 g/mL. In this work, the weight/volume used was 0.2 g/mL. The new limit of detection for IPTS in isopropyl esters (0.96 µg/g) was lower than in cosmetic matrices at 12.8 µg/g [16]. This modified HPLC condition used for cosmetic products was evaluated for its suitability in analyzing a different matrix such as isopropyl esters without matrix interference. Acetonitrile used as the extracting solvent during sample preparation was also used in the mobile phase mixture. The system suitability results further confirm the suitability of the developed conditions for the analyses of IPTS in palm oil-based isopropyl esters.

方法验证

用7个浓度的IPTS标准溶液评价该方法的线性。校准曲线是IPTS相对于浓度的峰面积测量的平均响应图。相关系数(R²)的0.9999表示线性良好(图S1)。

按公式计算检出限(LOD)和定量限(LOQ)，分别为3.3 (Sy/S)和10 (Sy/S)。Sy为曲线响应的标准差，S为校准曲线的斜率。定量限通常从最低浓度中选择，可以测量良好的准确性和精密度。在本研究中，选择最接近计算LOQ的(2.5 μg/g)峰值水平进行评价。结果表明，在2.5 μg/g的浓度下，两种异丙酯的准确度和精密度都很好，RSD均<7%(表I)。

通过加标和回收率试验，评价了新方法的准确性和精密度。以棕榈酸异丙酯(IPP)和肉豆蔻酸异丙酯(IPM)在4个浓度水平上加标测定回收率。异丙酯制造时不使用p以-甲苯磺酸为催化剂，作为尖化基质。从酯中提取IPTS并用HPLC-DAD分析。用外标曲线对加标样品的IPTS进行定量。为了确保加标样品中的IPTS峰是纯的，使用OpenLab ChemStation软件进行纯度检查。在这项工作中，发现归属于IPTS的峰没有共洗脱杂质。IPP的回收率为96.1-102.1%，IPM的回收率为90.2-96.8%(表I)，在80 - 110%[4]的可接受范围内。以%RSD测定的回收率研究的日内精密度<7%，具有良好的重复性。回收率的百分比是根据加标样品的结果和已知的添加浓度来计算的。空白异丙酯样品显示基质中没有IPTS和其他峰(图1b)。加标IPP的色谱图(图1c)显示在12.3分钟时出现一个属于IPTS的峰。 This was based on a retention time comparison with an IPTS standard solution (Figure 1a). The precision of the HPLC system (for injection and retention time) and method precision were satisfactory as indicated by RSDs of less than 10 percent. The method was also found to have good selectivity as they can be applied for low level detection of IPTS in commercial isopropyl esters from different sources.

图1所示。HPLC-DAD代表色谱图:(a) 0.5 μg ml^－1IPTS (b)空白IPP样品，(c) IPP加标2.5 μg g^－1，在230 nm处监测。

结论

采用高效液相色谱- dad法建立了一种快速、简单、改进的极低水平检测方法，用于异丙酯中IPTS的检测和定量。该方法的检出限比GC-FID法[15]低得多。验证数据表明，该方法具有准确性、精密度、灵敏度、线性和选择性。样品制备简单，易于使用溶剂萃取过程处理。

确认

作者感谢MPOB总干事允许发表本文。这项工作完全由马来西亚棕榈油委员会资助。

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