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摘要

由于目前的临床诊断无法应对人类可能发生的所有疾病，因此代谢组学血液分析可用于临床实验室实践，以提高疾病诊断和风险评估的效率。根据分析和计算工具的最新进展，代谢分析不需要超过1 μl的血液。因此，干血点法是一种侵入性较低的方法，且取样操作简单，成本最低。此外，可以在家中实验室外采集样品。本文详细介绍了用于血液代谢组学分析的干血滴法。该综述还描述了干血点在直接质谱代谢组血液分析工作流程中的应用，包括直接将提取的血点代谢物注射到四极杆飞行时间质谱的电离源中

需要研究人类血液的低分子量部分(代谢组)

人体代谢组是一套完整的低分子物质(代谢物)，换句话说，是生物体的生化表型。代谢组是基因型与环境相互作用的结果。与基因组、转录组和蛋白质组不同，代谢组与机体的生物学功能直接相关。代谢物是机体内发生的所有生化反应的底物、中间体和产物，包括病理生化过程。因此，代谢组学分析可用于临床实验室实践，以提高诊断效率，识别疾病发生的风险[1-4]。目前的临床诊断是无法应付的全部可能的人类疾病,都存在的身体,和那些只能发生在大量外源性物质的影响下,不断从空气中进入身体,提供食物和水,以及药品。

与现代临床实验室诊断的靶向性相比，血液代谢组学分析具有非靶向性(综述性)。同时在血液中检测一整套低分子物质的能力，包括成千上万的外生物质和各种疾病的标志物，可以显著改善一个人的健康和延长寿命。代谢组学分析允许定期监测一个人的“健康”，控制体内发生的生化过程，并提供纠正它们的机会，这是必要的，也许也是实现人类基因型[5]所规定的长寿的充分条件。

血液代谢组学试验在临床实践中的相关性

首先，即使是被认为健康的人也总是处于慢性中毒状态。同时，在每个人的体内都存在数十种毒素，对健康造成危害，缩短人的寿命。在这方面，需要一种方法，使其能够识别人体内的外来生物（具有极端多样性的特征）[5]。

如上所述，外源性生物与药物、食物和水一起不断地从空气进入人体。食物中总是含有某种程度上对身体有害的物质，这些物质能够成为突变物或致癌物，进入代谢途径。这些可能是人类产生的毒素，如杀虫剂、工业废物、食品生产的副产品、药品。可能是污染食物和水的细菌和真菌的生活产物[6,7]。无论是在家里还是在工业生产中，烹饪食物都会产生大量毒素。例如，含有氮的肉类和谷物产品的蛋白质在高温的影响下转化为丙烯酰胺和苯并芘，这是最强的诱变剂。在吸食食物时，会出现n -亚硝基物质，进入机体[8]后成为诱变因子。

许多有机物具有挥发性，在呼吸过程中很容易进入体内，引起各种疾病，包括肾脏、免疫系统、荷尔蒙系统、血液，当然还有人体的呼吸系统[9]。任何家用化学品、建筑材料(地板和墙壁覆盖物、刨木和清漆材料)也会释放出可进入人体的挥发性物质[10,11]。在被调查的志愿者中，有98-100%的人存在这些问题[12,13]。这些文献甚至被称为“病态建筑综合症”，用来描述那些在新装修或建造的房间里呆了很长时间的人的状况。地毯是毒素的一大来源;超过90%的被研究地毯都含有大量的神经毒素[15]。在另一项研究中，在每一块被研究的地毯上，平均发现了12种杀虫剂及其衍生物，表明地毯覆盖物是滴滴涕、艾氏剂、阿特拉津和西维里尔等杀虫剂的最大来源，这些杀虫剂通过肺[16]进入我们的身体。

毒素数据库“毒素和毒素目标数据库”(T3DB) (http://www.t3db.ca)包含了4万多种可以进入我们身体的物质。而这些仅是那些被证实有毒性作用的药物，而且是在相对较短的时间内进行测量的。但对于大多数外生物质(包括药物)，它们对人类的影响尚未被时间解决的后果是未知的。任何在生命周期内进入人体的异物，都有可能危害人体健康，缩短寿命。

迄今为止，越来越多的人注意到作为药物的那些外源性物质可能产生的毒性作用，即不合理的药物治疗。在60%的病例中观察到不合理的药物治疗，这是大规模自我治疗、非专利药生产的增加、患者同时服用几种药物以及药物在不同人群中的不同药代动力学的结果。医生无法自信地说明患者血液中目前存在哪些药物，以及药物浓度如何[17]。不合理的药物治疗不仅会导致慢性药物中毒，从而缩短寿命，还会导致死亡。只有在美国，每年有10万人死于不合理的药物治疗。

其次，已知的人类疾病有几千种。进行能够发现它们的诊断的指征是疾病的临床症状的表现，即当疾病已经对健康造成可见损害时。如果没有这些表现，几十种疾病就会在人体内潜伏很长时间，使人的健康恶化，缩短人的寿命。因此，需要一种方法来识别人体[5]中各种可能的病理过程。

世界卫生组织(世卫组织)已描述了几千种疾病分类形式。不幸的是，在绝大多数情况下，甚至在疾病发展时也能发现疾病的症状。通常这种情况会持续数年，根本不表现出来，当治疗只能缓解一个人的病情，而不是治愈它时，就做出了诊断。由于所述疾病种类过多，包括实验室诊断在内的预防措施无法应付现有情况。

血液代谢组测试的目的是解决上述两个全球性诊断问题:人体中存在成千上万种每天毒害人体的外源性物质，以及在同一有机体中同时发生的许多病理过程。如上文所述，只有一种非针对性的血液代谢组学测试才能反映出超出"标准"和"健康"范围的全部低分子物质，即对健康有害的绝大多数疾病的外源性物质和标志物。

血浆代谢组的质谱分析

通常，用于疾病诊断或毒理学研究的代谢组学分析是对血液作为激素、底物和生化反应产物的主要载体的低分子量成分的分析[18,19]。血液代谢组学检测有两种方法:NMR波谱法和质谱法[2,20-23]，但在医学研究中进行代谢组学分析时，主要使用质谱法，因为该方法灵敏度较高。Lokhov对血液代谢组的质谱分析做了非常详细的描述，等等。[24]。

这种情况下的质谱是通过将酸化甲醇中的血液样品直接注射到四极其飞行时间质谱仪的电喷雾电离源。得到的质谱反映了代谢物模式，其与健康人代谢组中的统计分析使我们能够建立代谢物的正常性，鉴定异种型，疾病低分子量生物标志物，并应用代原诊断签名[24]．

需要注意的是，进行代谢组学分析时，用血不得超过1 μl，仅为操作方便而定，甚至可在实验室外进行。鉴于这篇综述的重点，有必要详细考虑使用“干血斑”(DBS)方法来获得用于代谢组学分析的样品。

DBS在生物医学研究和医学中应用的历史背景

利用收集到的纤维素纸卡上血的想法是由于伊瓦尔基督教本古，现代临床微量分析[25,26]的父亲，谁在1913年确定的葡萄糖DBS [27]的洗脱液。随后，一些研究人员使用的DBS在血清学检测来诊断梅毒[26]。1924年，查普曼总结DBS分析的好处，强调四点今天仍然适用：相对于传统的静脉穿刺（1），需要的血液量小得多，这实际上是在儿科诊断最重要的;（2）的血液采集是简单的，非侵入性的和廉价的;（3）细菌污染或溶血的风险是最小的;和（4）DBSS可以持续很长一段时间，实际上没有随后的分析[26,28]的结果恶化。除了在梅毒检测，早在1953年使用DBS的，用于检测针对麻疹，腮腺炎，脊髓灰质炎病毒，副流感病毒和呼吸道合胞病毒（RSV）抗体[26]的方法中，以及用于检测抗体对从疫区采取了DBS血吸虫和超过三个月后[29]进行分析。

1963年，在Bang的第一篇报道的50年后[26,30]，Guthrie发表了他著名的诊断新生儿脚跟DBS中苯丙酮尿的方法[31,32]。虽然目前还没有进行这种分析，但它仍然构成了世界各地新生儿现代筛查项目的基础。由Guthrie开发的初步苯丙酮尿筛选半定量试验，以抑制细菌培养为基础，非常敏感，但疗效较差[34]。由于引进了先进的分析方法，扩大了检测能力并提高了其有效性，扩大了使用DBS进行新生儿筛查的可能性。在许多医疗中心，检测开始包括先天性甲状腺功能减退和囊性纤维化[35]的筛查。

虽然DBS已被视为普遍接受的收集，存放，运输和分析人类血液[29]，但其在实验室实践中的使用量仍然是主要关注的是感染诊断和对遗传性代谢的新生儿进行筛查障碍[36,37]。然而，自2005年以来，新的和创新技术已经开始使用DBSS。这导致了目前每年50到近450岁的DBS对DBS的相关科学出版物数量的几乎指数增加。在新的申请领域是毒性和药代动力学研究，代谢分析，治疗药物监测，法医毒理学，环境污染控制[37,38]中的这种多样化领域。

DBS在医疗诊断中的应用

在液体血液样本(全血、血浆、血清)之前使用DBSs的优势是明显的:1)在任何人群中接受简单和可及性;2)采血不需要临床实验室条件;3)样品不需要紧急追加处理(如生产血清);4)体积小，储存和运输时更紧凑;5)样品处理危险性较小;6)样品污染概率低。

然而，小的样品体积也意味着目标分析物的浓度可能相当低(可能小于1 ng/L)，这就需要一种非常灵敏的方法来检测和定量物质。目前分析DBSs最常用的方法是质谱法[39-42]。质谱(MS)在临床实验室的使用导致DBS方法的使用更加频繁，而不仅仅是在筛查新生儿时，MS在90年代[43]开始被使用。

研究人员开始发现DBS在质谱分析中的新应用。DBS方法已用于多种临床目的，包括药物毒理学和运动兴奋剂筛查。但另一方面，科学家和实验室工作人员在如何确保DBSs的质谱分析的最佳灵敏度、重现性和准确性方面存在问题。

40多年前(1976年)首次报道了用质谱分析干血斑的方法，用化学电离[44]检测脂肪酸。20世纪80年代中期，气相色谱(GC)成为分离和分析挥发性小分子的主要方法，采用气相色谱-质谱联用物质检测(GC- ms)[45]测定DBS样品中的衍生脂肪酸。20世纪90年代，当电喷雾离子化商业化后，与物质质谱检测相关的液相色谱(LC-MS)被引入到新生儿筛查实验室的分析工具中，这导致了对苯丙氨酸和酪氨酸这两种早期标志物的筛查范围扩大[43,46]。迄今为止，干血点质谱(串联质谱)是世界各地许多实验室筛查新生儿的主要工具;并将其他测试添加到列表中。除了对新生儿进行筛查外，还使用串联干血质谱(DBS-MS)进行流行病学筛查，分析血点是否存在苯甲酰ecgonine(可卡因的主要代谢物)[47]。

目前，质谱在DBS中检测到的物质和生物标志物的清单每天都在增加[48,49]，已经远远超出了对新生儿的筛查。值得注意的是，MS的DBS分析现在涵盖了治疗药物监测(TDM)领域的翻译研究和临床诊断测试;药物动力学;毒性动力学;法医体检;内分泌和新陈代谢;以及生物测定的其他领域。文献中广泛报道使用DBS-MS(包括LC-MS和GC-MS)对各种药物进行治疗和毒理学分析[50,51]。此外，DBS-MS现在经常用于体育兴奋剂测试，以检测合成代谢、能源性和掩蔽剂[52-54]。

不管临床应用如何，都有一些分析特征。在DBS[44]中，一些参数会影响测量的准确性。从这一点出发，在DBS实验室中分析血液的低分子量部分需要一个通用的分步方案[55-57]。研究人员提出了DBSs的制备和处理流程:(1)采血;(二)染有血点的;(3)干燥血斑;(四)储运;(5) DBS洗脱;最后，(6)DBS洗脱物的质谱分析。

需要指出的是，这种顺序需要适应用于代谢血液分析的直接质谱法的任务。也就是说，当酸化甲醇中的血液样本被直接注射到四极飞行时间质谱计的电喷雾电离源中。

DBS样品的制备

DBS制剂包括以下方法：1）患者的血液收集;2）获得载体上的血斑;3）干燥;4）输送和储存DBS样品。除了常规血液收集的常规要求外，DBSS制备中出现的额外问题，包括DBS样品的质量（这取决于样品的收集以及所获得的斑点的差异），所以收集载体的选择，运输和储存方法。此外，诸如样品粘度，血细胞比容水平的生物学因素和分析物的性质（用于靶向测定）可以导致样品质量的变化。

为了控制这个阶段的质量，下面的指南已经发布：对患者身份 - “安全和质量改进指南患者识别和程序匹配。对安全和质量卫生保健”澳大利亚委员会[58];对毛细血管血液采样 - “指引抽血：最佳实践放血，毛细血管血液采样世界卫生组织。” [59];滤纸的选择和应用样品滤纸 - 在过滤器“采血车纸新生儿筛查项目;批准的标准“[60]，以及包装和DBS的样本的运输 - ”实验室质量保证和标准化程序。准则干血斑标本的装运。美国：美国疾病控制和预防” [61]。

血液采样

血液采样技术对于DBS的准确分析至关重要。毛细管采血是一种常见的方法，因为与静脉穿刺相比，它通常需要更少的样本量，对患者更友好。由于世界卫生组织(WHO)和联合国国际儿童应急基金(UNICEF)对DBS样本的质量进行了认证，并通过提供DBS样本的指南和说明来确保医护人员的安全[62,63]。由于伪影发生概率高，分配了DBS毛细血管采血的特殊条件，包括:选择注射点、穿刺装置大小、注射深度、毛细管血液流速、液滴大小、样品在载体上扩散的均匀性、干燥过程中长时间暴露在空气或光照下对DBS的污染。值得注意的是，世卫组织指出，“使用DBS的工作需要与全血或血浆一样的生物危害预防措施[63]。

在采集血液样本进行代谢分析时，需要考虑到代谢物的某些特征。Lokhov,等等。表明以下几点：首先，这是它们在血浆中浓度的强烈可变性。因此，代谢物在体内的分布取决于其状态和一天中的时间，这对获取样本进行分析的条件提出了严格要求，即应同时采集血样。第二个特点——这是大多数代谢物缺乏物种特异性，这导致了对分析结果的重大影响，例如，食品物质。因此，应在饭前进行血液取样[5]。

选择DBS的运营商

从文献数据众所周知,星展银行样本的收集是进行两种类型的未经处理的固体基质:纯棉滤纸和玻璃微纤维(图1)。承运人的选择,包括厚度和密度,影响毛细管的吸附率和色散的血液。研究表明，例如，薄膜对分析物的非特异性吸附率随着玻璃微纤维纸的使用而降低[64]。因此，这两种固体载体使用的差异会导致DBS样品特性的改变，从而导致现场血容量、分析物稳定性、目标分析物数量的电势差，以及进一步分析的可能性[65]。DBSs中这些具体的分析前差异需要标准化。

图1。用干血点法采集样品。一种含有吸收纸HemaSpot™-HF (Spot On Science)的墨盒。B, Whatman 's protein saver card Whatman™903 protein saver Snap Apart Cart (7078417 GE Healthcare Life Science)。C，卡片免疫健康™Whatman 903(类似Whatman™903蛋白储蓄器Snap Apart Cart)。D，玻璃微纤维条免疫健康™。

临床和实验室标准研究所（CLSI）为DBS获得了NBS01-6的指南[60]。CLSI指南建议使用两张特殊卡之一：Whatman 903和Ahlstrom 226.两种过滤文件都被食品和药物管理局（FDA），新生儿筛查质量保证计划（NSQAP）和疾病控制中心批准和预防（CDC）[60]。本指南是用于选择用于获得DBS的载波的起点。

将样品应用于滤纸

Whatman 903和Ahlstrom 226卡都有一个打印收集区，以提供50-75 μl[60]范围内的样品体积。应将一滴完整的毛细血管血滴在采集区域的中间，使孤立点的边界呈径向分散。放射自显影显示这种侧位分布不均匀[66]。通常，生物标记物的浓度沿DBS边缘下降，而中间受“火山效应”(纸层析效应)影响，有时呈斑片状(较厚)[67]。DBS样本的物理特性也会受到患者血红蛋白和红细胞压积水平的影响;这也会影响滴血的扩散区域。

红细胞压积的变化会影响现场血浆的相对百分比。这对于主要在血清/血浆中发现的分析物很重要，因为从不同部位切割的椎间盘中血浆的相对数量可能不同，特别是当红细胞压积极高或极低时[68]。红细胞压积越高的全血样品在滤纸上的分布越少(即形成较小的血点直径)，因此目标分析物在该样品中的扩散距离越短。对于低血细胞比容的血液样本，则观察到相反的效果。因此，由于分析物分布的变化，分析物的浓度(与“正常”血细胞比容的样品相比)可以被测定得更高或更低[69,70]。因此，为了进行准确的定量测定，理想情况下，建议在生产DBS时采集单独的毛细血管血液样本，或直接从DBS卡中确定患者的红细胞压积。

分析物稳定性的保存(干燥、储存和运输条件)

样品DBS必须在运输和/或储存前完全干燥。结果表明，低湿度条件的快速干燥和储存改善了DBS样品的稳定性[51]。在空气中干燥所需的时间长度将取决于局部环境条件，例如空调，室温和湿度。DBS干燥通常需要90分钟至约4小时，理想情况下，DBS样品在此期间不应暴露于直射阳光。

然后将适当干燥的样品放入信封或合适的容器中，进行简单和经济的运输[51]。由于干燥样品体积小，与其他生物样品相比，显著降低了感染传播的风险[71,672]，它可以在不需要特殊温度的小而轻的包装中运输。相对于液体生物样品[51]的运输过程，这是一个显著的优势。

一旦DBS样本在目的地接收到，DBS样本的大小和性质就会使其存储相对容易，因为首先，它们需要最小空间，其次，它们不需要特殊的温度，它们可以存储在室内温度。

然而，人们应该记住，在DBS各种分析物的稳定性可能变化非常大。因此，已显示，在上纸生产DBS的在室温下大量血液生物标志物的稳定性已被证实为至少7天[64];药物，阿片类和核酸的稳定性 - 数月[73,74]，维生素d - 为20年以上[75]。据还表明，在-20℃冷冻或-80℃提高DBS样品的稳定性;往往增加分析物的稳定性，从数天/月至数年[76-78]。此外，根据一些文献数据，一些代谢产物具有在全血干纸滴剂形式更大的稳定性，相对于等离子体[79]。

如前所述，除了储存时间外，还有许多因素会影响分析物的稳定性:滤纸的类型、阳光直射、温度、湿度和目标分析物的性质。在文献中,可以找到一些实验室的方法结果用于制备DBS提高稳定性,例如:1)快速降低血液样本的pH值的稳定时间增加一些结构不稳定的药物,在干燥过程中降解;2)使用乙二胺四乙酸(EDTA)作为抗凝剂保存和稳定DBS样品用于测定酶活性[80,81]。显然，如果分析物的稳定性有这么多的变化，就有必要制定特殊的方案来获取和存储DBS样品。在文献中，有许多适合具体任务和目标的建议。在Zakaria R.等人的一篇综述中，根据文献[49]给出了一个总结表，其中包含了DBS样品对各种分析物的稳定时间。

DBS样品分析

DBS样品的固体形式与大多数分析方法不相容，需要从纸载体上洗脱样品。因此，样品分析过程通常包括三个主要步骤:1)初步样品制备，2)前处理和3)样品分析。分析可进一步分为色谱分离和质谱检测。但是根据代谢组学的研究，整个分析过程的质量必须与样品的直接质谱分析相对应。

1.样品初步制备

用样品切割光盘:样品制备通常从手动切割从纸载体的一部分干燥的血液点或以自动方式切割出一部分干燥的血液点。通常，为了最小化由于该点的哪个部分被切出的样本差异，建议将光盘一直从干血斑或更接近外边缘的情况下切割[82]。根据该方法，切出盘的尺寸可从3 - 6毫米到整个点的变化。

在文献中，已经提出了方法以最小化血细胞比容变化的问题和样品制备中的相关困难。克服血细胞比容的效果的策略包括：

1. 从纸载体上初步切割磁盘;
2. 将少量全血(如10 μl)应用于预切的小椎间盘(3或6mm)，分析整个椎间盘[83-86];
3. 使用两层聚合物膜从全血样品中获得干燥的血浆斑点，用于固相萃取后进行分析[87];
4. 开发新的DBS样品收集卡，以获得来自全血样品的特定体积（2.5或5.0μL）的血浆样品。该基质的前瞻性优点包括改善测定的再现性和选择性，以及用于提取样品的简化程序并消除血细胞比容效应[88]。

洗脱：为了分析分析物，首先需要使用合适的萃取缓冲液将其与纸载体分离。来自DBS的分析物的有效洗脱是一种复杂的过程，并且由于效率效率低，始终存在分析物的可能性。由于分析物的不完全萃取或降解，样品的较差发生。因此，选择最佳提取缓冲剂的选择可以与化合物不同于化合物。例如：纯甲醇被认为是来自DBS样品的低萃取物质的常见溶剂[89]。另一方面，水使纤维素和靶分析物的羟基之间的相互作用降低，并且在某些情况下增加了有机萃取前的水的部分加入其有效性（例如，用于抗病毒药物）[90]。为了实现具有最大提取效率的分析物的提取，需要优化提取参数，包括提取溶液的组成，额外的超声处理的持续时间，温度和施加施加的组合物，适用于每个靶标代谢物[68,91]]。

2.初步治疗样品。

根据目标化合物的分子特性，已经提出了不同的样品制备方法。样品的初步处理方法，无论是相互结合的还是单独的，都代表了样品制备的经典过程:1)蛋白质沉淀;2)液-液萃取;3)固相萃取;4)对底物进行液体萃取;和/或5)衍生化。

提取和衍生化过程在很大程度上是费时费力。虽然不是必需的用于与LC-MS / MS分析血浆大多数分析物，在许多情况下衍生，DBS分析需要通过补偿小的样品体积提高灵敏度。然而，由于衍生过程延长了总的分析时间，它被认为是一个限制因素，并且是的提取方法有利于DBS的样本分析前处理发展的驱动程序。

引入自动样品制备，与LC-MS / MS系统直接相关，从而降低了该过程的时间和成本。蛋白质沉淀是一种用于TDM的简单而流行的自动化方法[92]。然而，在一个沉淀过程之后，仍然存在盐和其他内源分析物，其可以在MS过程中引起离子抑制。与LC-MS / MS共轭的固相提取设计以自动促进样品的解吸，并且通过用于分析DBS的方法和成本，其两者都是有效的[74,93-96]。与蛋白质沉淀相比，固相提取是样品的改进纯化[97]。与自动提取方法相比，使用自动提取的特定问题，这也可以是分析误差的重要来源：内标在提取物中的分析物的不均匀混合物;稀释样品，结果，在色谱分离和/或将提取物分离在分析塔上的呼应中的条带[44]。因此，在开发解决这些问题的方法的过程中，需要某些策略。

一种技术已经开发，允许直接分析DBS，而不需要转移到液相或洗脱。正如制造商所描述的那样，“液体微结表面取样探针(LMJ-SSP)”是一种自吸装置，液体从一个有趣的表面被吸走，并被泵送到质谱仪中进行复杂的提取和电离(Prosolia, 2014)。使用LMJ-SSP技术，感兴趣的分析物可以直接从不同的表面提取，并在短时间内用质谱仪进行检测，只需最少的样品处理[98]。结合MS的LMJ-SSP装置用于检测DBS样品中的蛋白质[99]，用于直接串联质谱检测血红蛋白[100]，用于检测治疗药物[101,102]。使用这种方法检测硫代芬制剂表明，这种现场直接衍生化在时间和成本上都是有效的，可以替代样品制备程序[103,104]。

3.样品的分析

与LC相比，气相色谱被认为是一种更便宜、更快的分离方法，因为使用了更长的、更紧凑的毛细管柱，提高了分辨率。与LC-MS相比，GC-MS分析方法通常具有更高的分离能力和有效的重现性。气相色谱-质谱法适用于挥发性和半挥发性有机物的分析，既可用于混合物中未知物质的鉴定，也可用于目标物质的定量分析。这些方法使用DBS样本检测类固醇、代谢物和治疗药物[52,103,105-107]。然而，气相色谱的使用仅限于可溶于某种溶剂、易挥发且耐热的小分子，因为通常需要衍生化将非挥发性分子转化为挥发性分子[108,109]。

LC是用于分析温度敏感的分析物，而不限制分子尺寸的优选方法。此外，不同于GC，靶相互作用，用流动相和固相的两种化合物，从而获得更好的选择性[109]。GC或LC之间的选择取决于靶分析物的所要求的灵敏度和特性。虽然GC-MS提供的选择性，灵敏度和可靠性的许多DBSS分析，文献表明，它并不像受欢迎，因为LC-MS / MS [49]。这可能是由于通过LC-MS / MS进行分析DBS相比，由于GC-MS [110111]快得多，并且通常更经济的方法提供的改进的特异性和灵敏度。此外，改进的HPLC技术允许增加峰分离（甚至更有效的比GC）[108109]的分辨率。

随着二维色谱(2D色谱)(适用于GC和LC)分析的引入，提高了分离效率、分析灵敏度、分析彻底性和定量分析的准确性。2D色谱过程降低了DBSs的基质和运输效应，降低了相关的不准确性[112,113]。随着2D-C系统进一步加入自动提取，当与三重四极串联质谱仪或高分辨率四极串联质谱仪(QTOF)结合时，灵敏度和特异性达到最大[97114]。

离子源技术的进步提高了分析的灵敏度，无论是对DBS样品中的极性和非极性分析物[115-117]。MS/MS检测中的选择性或多重监测模式显著提高了分析的特异性，提高了线性度和检出限[44,118]。

从分析前纯化和色谱分离的相位释放，DBS样品使用直接MS方法和LMJ-SSP方法与MS组合。解吸电喷雾电离（DESI），实时直接分析（DART），以及直接电喷雾电离质谱（ESI-MS）用于从表面产生离子，从而避免纯化或衍生化方法[119-126]。然而，应记住，消除初级净化和样品分离可能导致由于破坏代谢物干扰而导致敏感性和准确性的损失[125]。因此，建议使用直接MS方法来提高测量的灵敏度和准确性[111,127]。最终，必须通过实现所需的结果来平衡时间效率和吞吐量。

血液代谢组的质谱分析

通过使用具有高分辨率检测的质谱仪提供代谢分析的非目标（概述）性质。同时，质谱是一个“窗口”，宽度为1000DA，其中所有低分子物质都反映在一系列浓度上的0.0001Da的分辨率，其浓度高达10⁵，能够在质谱计的电喷雾电离源中电离。鉴于只有少量低分子量物质没有完全电离成电喷雾，代谢分析可能适合检测血[5]中所有低分子量成分的异常。

就医疗目的而言，血液代谢组学分析是通过直接质谱法进行的，即在不事先分离的情况下，直接将分析的样品注入质谱仪的电离源中，由于样品处理的任何额外阶段都可能会对代谢组的整体情况造成扭曲，因此从这些阶段“释放”可以使分析结果尽可能地接近“真正的”代谢组。现代质谱仪的使用具有高分辨率的物质质量检测允许获得“真正的”代谢组。例如，使用混合四极杆飞行时间质谱仪(Q-TOF)进行直接质谱分析，可以仅在一种质谱检测模式下检测血液中的15,000个离子代谢物。这个可检测的离子数量应该足以反映整个人体血液的低分子量组成[128]。

图2。基于MS数据的人体血液代谢组获取方案。滤纸上干燥的毛细血管血点送到实验室进行代谢组学研究。从血液样本中提取低分子量物质(1)，并使用直接质谱(DIMS) (2)，血液代谢物的质谱得到(3)。下面的例子是将血液代谢物直接输注到四极杆飞行时间质谱计(Micro TOF-Q, Bruker Daltonics)的电喷雾电离源中检测正电荷离子得到的质谱(4)。质量-电荷比是50-1000。质谱显示了代谢物的主要注册组

Lokhov和合作作者[5]在直接质谱的基础上区分了代谢组血液测试的以下主要特征。

1. 该方法分析高达1000 Da的低分子物质，包括毒素、药物和体内发生的生理和病理生化反应的代谢物。
2. 该方法不分析金属离子。
3. 该分析没有针对性，这使其有可能识别血液中所有非规范物质的种类。
4. 在血液中发现的每一种非规范物质都有可能被识别出来。
5. 血液样品的质谱分析是“按原样”进行的，即不需要进行初步的样品制备，直接将分析的样品注入质谱的电喷雾电离源中。
6. 它可以使用任何生物材料:血浆，静脉血，毛细血管血，在滤纸上干燥的一滴血液。
7. 分析时，需要有微量的生物材料(不超过1 μl)。
8. 代谢物分析的有效性取决于所用质谱仪的功率;为了有效分析，质谱仪的分辨率必须不小于20,000（质谱峰值的高度与其宽度的比率，在其高度的中间测量）;测量1-2 ppm的质量的精度和质量的动态测量范围的宽度不小于10⁵．
9. 使用带有电喷雾电离源的质谱仪(软电离几乎不会破坏低分子物质，并能很好地电离);
10. 质谱仪用于正电离离子检测的模式（血液的低分子量最完全反射）;带负电的离子检测中的测量是另外的选择。
11. 质谱数据的比对是质谱数据统计处理的必要步骤。
12. 非规范代谢物的检测是通过对数据进行统计处理，通过计算该物质在血液中的浓度不规范的概率来实现的。
13. 非标准物质的鉴定采用标准化方法进行，包括鉴定的4级真实性。
14. 通过统计计算代谢型属于健康个体抽样的概率，估计代谢型与正常代谢型的对应关系以及代谢型与正常代谢型的偏差程度。
15. 代谢分析的结果不具有临床实验室诊断或化学毒理学研究的状态结果。
16. 分析结果的解释由医生-生物化学家或毒理学家进行。

质量控制

总之，还应讨论关于验证标准的重要观点和临床实验室实践中DBS分析的方法。欧洲生物分析论坛（EBF）描述了DBS样本分析方法的细节，为DBS方法的验证提供了具体建议[129]。包含EBF建议的文件包括具体点：用于集合DBS的卡的可变性;样品变异性;DBS的均匀性;定位在磁盘被切出的地方的斑点;样本的稳定性;血液物理参数的影响;载体的影响;萃取; the application of the internal standard (IS) and internal quality control (IQC). In addition to the details presented in this document, it is necessary to consider the suitability of the method for use in clinical practice.

星展银行卡

为了避免卡之间的可变性问题，校准器和控制材料必须使用与患者样本相同类型/制造商的DBS收集卡。如果使用几种类型/卡片制造商，则需要使用比较方法来确定比较卡的稳定性、提取和媒体效果[130]。

血细胞比容的影响

如前所述，全血滴的物理行为受各种参数的影响，如;红细胞压积水平，溶血程度和抗凝剂类型(如果使用)。目前，血细胞比容被认为是影响血斑特征(干燥时间、扩散和均匀性)和分析的重现性的最重要参数。红细胞压积的影响在不分析整个DBS样本，而是分析从现场切下的椎间盘时更为显著。因此，开发DBS样品应用的验证方法还应包括研究红细胞压积变化对测量和分析结果的影响[131]。

内部标准的应用

在DBS样品的处理中包括一个内部标准(ISTD)是一个重要的步骤，理想情况下应该在过程的早期阶段进行。1)在使用血液前，可准备经ISTD预处理的收集卡。这确保了ISTD和分析物都受到相同的载体和提取效果。然而，这种方法在逻辑上不可能在多个研究中可行。2)通常，手动提取方法在DBS溶液制备洗脱/萃取阶段使用ISTD集成方法。在这种情况下，ISTD与目标分析物一起被提取。3)在提取/制备阶段加入ISTD是另一种简单的选择。然而，由于ISTD不完全与载体相互作用，洗脱的变化没有被考虑在内。4)在自动模式下使用DBS样品制备技术时，使用触摸喷雾技术在提取前将ISTD喷到血迹上[132-134]。

样品污染

样品的污染是DBS-MS分析的一个重要问题。污染可以有不同的来源，包括:物理接触“卡-卡”存储期间;通过切割圆盘的设备或在随后通过移液器或分析柱制备样品时接触“斑点斑点”)[129]。为了避免这个问题，建议采用纯化步骤或样品之间的空映射[135]。

内部质量控制

与液相生物样品相比，DBS分析用内部质量控制（IQC）样品的制备需要特殊建议。内部质量控制的主要问题是，载体与应用患者血滴的载体一致[130]。理想情况下，应选择新鲜全血样本，无溶血迹象，且研究组的红细胞压积水平非常匹配，以制备IQC样本[136]。样品应与患者样品一起使用和洗脱。

外部质量控制

外部质量评估(EQA)被认为是评估分析程序可靠性以及监测实验室指标质量的重要工具。英国国家外部质量评估服务(UK- neqas)、欧洲遗传代谢疾病筛查、诊断和治疗评估和改进研究网络(ERNDIM)和美国疾病控制和预防中心(NSQAP)为新生儿筛查提供了DBS检测的各种方案。然而，没有额外的EQA项目来确保与新生儿筛查无关的DBS分析的准确性。因此，对于大多数DBS分析，没有专家的实验室特性评估。

结论

现代成功的代谢组学研究需要简化样品制备，以制备工艺精良的样品，这将提供高质量的数据。对于代谢组学分析，DBS分析使用直接质谱的应用现在被广泛应用。DBS作为一种侵入性较小的采样方法，采集方案简单，易于存储和传输样本。使用DBS方法分析个体的血液代谢组为实时健康状态监测提供了一种有价值的方法，这在精准医疗时代至关重要。然而，在样品制备方面仍有许多设想中的挑战。在代谢组学研究中，样品制备的标准化至关重要，这使我们能够增加测量和注释化合物的数量。此外，方案中的质量控制是必要的，以允许跨实验室的比较。

确认

该工作由2013 - 2012年第2013 - 2012年国家院校基本研究计划提供资金。

参考文献

1. Schnackenberg LK（2007）全球代谢谱及其在系统生物学中的作用，以推进21世纪的个性化医疗。专家Rev Mol Diagn7: 247 - 259。
2. Dunn WB, Broadhurst DI, Atherton HJ, Goodacre R, Griffin JL(2011)哺乳动物代谢组的系统水平研究:质谱和核磁共振波谱的作用。化学Soc牧师40: 387 - 426。
3. Barrett D(2012)代谢谱研究进展。生物分析法4：643-644。
4. Schnackenberg LK，BEGER RD（2006）监测全球代谢分析和系统生物学对疾病的健康。药物基因组学7: 1077 - 1086。
5. Lokhov PG, Lisitsa AV, Archakov AI (2017) [Metabolomic blood test: purpose, implementation and interpretation of data]。生物群落63: 232 - 240。[crossref]
6. Prakash AS, Pereira TN, Reilly PE, Seawright AA(1999)人类饮食中的吡咯里西啶生物碱。变异基因443: 53 - 67。[crossref]
7. Borchers A, Teuber SS, Keen CL, Gershwin ME(2010)食品安全。临床过敏免疫反应39: 95 - 141。[crossref]
8. Ferguson LR, Philpott M(2008)营养与突变。为减轻28日:313 - 329。[crossref]
9. Crinnion MJ（2000）环境医学，第2部分，无处不在的空气溶剂暴露对健康的影响和防护。地中海交错的牧师5: 133 - 143。
10. Nielsen Gd，Larsen St，Olsen O，Løvikm，Poulsen Lk等。（2007）室内化学品促进气道过敏的发展吗？室内空气17: 236 - 255。
11. Wallace LA, Pellizzari ED, Hartwell TD, Sparacino CM, Sheldon LS, et al.(1967)在新泽西州测量了355人的个人暴露、室内外关系和呼吸有毒空气污染物水平。大气环境19：1651-1661。
12. Hill RH, Ashley DL, Head SL, Needham LL, Pirkle JL(1995)美国1000名成年人的二氯苯接触情况。拱环境卫生50：277-280。
13. EPA（2012）FY82国家人类脂肪组织测量标本的广泛扫描分析。美国环保署办公室有毒物质。
14. Ruhl RA, Chang CC, Halpern GM, Gershwin ME(1993)病态建筑综合症。2室内空气质量的评估与调节。J哮喘30: 297 - 308。
15. Divehring C（1993）EPA摊位和行业吊带，而消费者仍然存在风险，知情同意1：6-32。
16. Whitemore RW, Immerman FW, Camann DE, Bond AE, Lewis RG, et al.(1994)美国两个城市居民非职业接触农药情况。Arch环境污染毒物26:47-59。
17. Lokhov PG, Maslov DL, Trifonova OP, Balashova EE, Archakov AI(2014)血低分子组分质谱分析作为统一治疗药物监测的方法。生物化学(莫斯科)补充系列B:生物医学化学8: 1 - 10。
18. Trifonova OP, Lokhov PG, Archakov AI(2013)人类血液代谢分析。生物化学(莫斯科)补充系列B:生物医学化学7:179-186。
19. Trifonova o，Lokhov P，Archakov A（2013）后明瘤诊断：代谢组学人类血液分析方法。组学17: 550 - 559。
20. Dunn WB, Broadhurst DI, Atherton HJ, Goodacre R, Grifn JL(2011)哺乳动物代谢组的系统水平研究:质谱和核磁共振波谱的作用。化学Soc牧师40: 387 - 426。
21. (2011)人血清代谢组的研究。普罗斯一体6: e16957。[crossref]
22. (2010)直接输液质谱法还是液相色谱质谱法用于人体代谢组学?肾癌的血清代谢组学研究。分析师135: 2970 - 2978。
23. 基于质谱的代谢组学。质量范围转速26：51-78。
24. Lokhov PG，Archakov AI（2008）[代谢组学中的质谱法]。生物群落54: 497 - 511。[crossref]
25. Bowling FG, Thomas M(2014)分析代谢组。方法杂志1168: 31 - 45岁。[crossref]
26. 尼科尔森JK，林顿JC（2008）系统生物学：代谢组学。自然455: 1054-1056.[crossref]
27. 基于质谱的代谢组分析在系统生物学中的优势和缺陷。Int J Mol Sci17：E632。
28. Rhee EP（2015）《代谢组学与肾脏疾病》。肾凝血剂24: 371 - 379。[crossref]
29. (in 2015)复方丹参滴丸对大鼠心肌缺血的尿代谢组学评价。J Pharm Biomed Anal112: 98 - 105。
30. 毛细管电迁移技术在食品分析中的应用研究进展电泳35: 147 - 169。
31. Freemark M（2015）营养研究中的代谢组学：预测严重急性营养不良儿童死亡率的生物标志物。食物减轻牛36: 88 - 92。
32. Dunn WB, Broadhurst D, Begley P, Zelena E, Francis-McIntyre S, et al.(2011)人血清代谢组。使用气相色谱和液相色谱-质谱联用技术对血清和血浆进行大规模代谢分析的程序。Nat Protoc6: 1060 - 1083。
33. Guthrie KJR（1997）《北大的故事：一场反对精神发育迟滞的运动》，美国帕萨迪纳。
34. (1)苯丙氨酸检测新生儿苯丙酮尿的简易方法。儿科32: 338 - 343。
35. Grüner N, Stambouli O, Ross RS(2015)干血斑——用于免疫分析和分子技术的制备和处理。J Vis实验．[crossref]
36. 张特，Watson DG（2015）液相色谱质谱法基于代谢组织技术对人类尿液分析的简要述评。分析师140: 2907 - 2915。
37. Johnson SR, Lange BM(2015)天然产物研究的开放获取代谢组学数据库:当前能力和未来潜力。前生物科技Bioeng》3: 22。
38. Mirnaghi FS，Caudy AA（2014）通过单一分析方法分析不同类代谢物的挑战。生物分析法6: 3393 - 3416。
39. 韩敏，施军，宋申，朴HD，朴库，等。超高效液相色谱/串联质谱法测定异染性白质营养不良患者干血斑中的磺酸盐，快速社区。大众Spectrom28日:587 - 594。
40. Manicke NE，Abu Rabie P，Spooner N，Ouyang Z，Cooks RG（2011）纸喷雾质谱法定量分析干血斑样本中的治疗药物：治疗药物监测的途径。J Am Soc质谱22：1501-1507。
41. [李强，曹东，黄艳，徐华，余超，等。(2013)干血斑上他克莫司的高效液相色谱-质谱联用检测方法的建立与验证。]仿生色谱仪27日:327 - 334。[crossref]
42. (2015)超高效液相色谱串联质谱法测定干血斑中他莫昔芬、n -去甲基他莫昔芬、4-羟基他莫昔芬和内毒素芬的含量——显影法。乳腺癌辅助治疗的验证和临床应用。Talanta132: 775-784.
43. 用串联质谱法筛查新生儿:积累经验。中国化学47: 1937 - 1938。[crossref]
44. Wagner M, Tonoli D, Varesio E, Hopfgartner G(2016)使用质谱分析干血斑。质量范围转速35: 361 - 438。[crossref]
45. Nishio H, Kodama S，横山S, Matsuo T, Mio T，等(1986)用滤纸上干燥的血点诊断肾上腺脑白质营养不良的简易方法。我们共同Chimica学报159：77-82。
46. Millington DS, Kodo N, Norwood DL, Roe CR(1990)串联质谱:一种酰基肉碱分析的新方法，可用于新生儿先天性代谢错误的筛查。遗传性代谢疾病杂志CHINESE13: 321 - 324。
47. (1996)液相色谱-大气压化学电离串联质谱法分析干血斑中的苯甲酰ecgonine。分析毒理学杂志20: 179-184.
48. Burnett JE(2011)干血点取样:临床前研究的实际考虑和建议。生物分析法3: 1099 - 1107。
49. Zakaria R, Allen KJ, Koplin JJ, roche1p, Greaves RF(2016)在整个检测过程中使用质谱分析干血斑的优势和挑战。EJIFCC27日:288 - 317。
50. (2009)干血点取样在全国社会生活、健康与老龄化项目中的应用。J Gerontol B Psitycol SCI SOC SCI64：131-136。
51. 一滴血的作用:将干燥的血点作为一种微创方法，将生物标志物整合到基于人群的研究中。人口统计学44: 899 - 925。
52. 彭世生，塞居拉J，法瑞M，德拉托瑞X(2000)用滤纸干燥血点睾酮葡萄糖糖化法测定口服睾酮。临床化学46: 515 - 522。
53. Tretzel L, Thomas A, Geyer H, Gmeiner G, Forsdahl G, et al. (2014)J Pharm Biomed Anal96: 21 - 30。
54. Cox HD, Rampton J, Eichner D(2013)测定运动中生长激素滥用的干血斑中的胰岛素样生长因子-1。肛门Bioanal化学405: 1949 - 1958。
55. Castro-Puyana M, Herrero M(2013)基于质谱的代谢组学方法用于食品安全、质量和可追溯性。分析化学趋势52: 74 - 87。
56. Fernández-Peralbo M, de Castro ML，用于非靶向代谢组质谱分析前尿液样本的制备。分析化学趋势41: 75-85,
57. Deda O, Gika HG, Wilson ID, Theodoridis GA(2015)全球代谢分析的粪便样本制备概述。J Pharm Biomed Anal10: 137 - 150。
58. NSQHS（2018）《患者识别和程序匹配安全和质量改进指南》，新南威尔士州达林赫斯特：澳大利亚健康护理安全和质量委员会，第页。28
59. 世卫组织（2010年）《抽血指南：静脉切开术、毛细血管取样的最佳实践》，世界卫生组织。
60. Hannon WH (2013) NBS01-A6:新生儿筛查用滤纸采血，批准标准第六版[批准指南]，临床和实验室标准协会。
61. CDC(1993)实验室质量保证和标准化项目。装运干血斑标本指南，美国:疾病控制和预防中心，第4页。
62. 联合国儿童基金会（2009）（2009）从患有艾滋病毒DNA PCR试验的婴儿血液，标准操作程序，国家卫生实验室服务，联合国儿童基金会，De Beers Fund P。25。
63. 世卫组织(2005年)艾滋病毒快速检测培训包:参与者手册《血液采集和处理- DBS》，世界卫生组织第13页。
64. 莱曼S，Delaby C，VialaretĴ，DUCOSĴ，HIRTZ C（2013）当前和未来使用“干燥血点”的分析在临床化学。Clin Chem Lab Med51: 1897 - 1909。
65. (2014)纤维素纸对干血点的影响及其应用，中国造纸科学，29(1):1 - 5。John Wiley & Sons, Inc . pp: 332-343。
66. Mei JV, Zobel SD, Hall EM, De Jesus VR, Adam BW，等(2010)全血采集滤纸设备的性能特性。生物分析法2: 1397 - 1403。
67. Ren X, Paehler T, Zimmer M, Guo Z, Zane P, et al.(2010)不同因素对DBS论文中放射性分布的影响。生物分析法2：1469-1475。
68. LC-MS/MS法测定干血斑中莫西沙星含量及其对红细胞压积和血容量的影响。J Chromatogr B分析技术生物密9879: 1063 - 1070。
69. [彭敏，刘玲，彭玲(2012)影响干血点琥珀酰丙酮分析准确性的因素评价。]Clin Chim Acta413: 1265 - 1269。[crossref]
70. Holub M, Tuschl K, Ratschmann R, Strnadova KA, Muhl A, et al.(2006)用串联质谱测量干燥血斑的红细胞压积和punch定位对氨基酸和酰基肉碱水平的影响。我们共同chimica学报第27 - 31 373:。
71. Parker SP, Cubitt WD(1999)干血点样本在流行病学研究中的应用。中国中草药52: 633 - 639。
72. Resnick L，Veren K，Salahuddin SZ，Tondreau S，Markham PD（1986）临床和实验室环境下HTLV-III/LAV的稳定性和失活。《美国医学会杂志》255: 1887 - 1891。
73. 应用干血点法测定血液中吗啡和6-乙酰吗啡。其他药物Monit30: 733 - 739。[crossref]
74. 王鹏飞，范志强，王志强，等。Bruenner，(2011)全自动连续采血和干血斑技术在小鼠药动学研究中的应用。医药和生物医学分析杂志56: 604 - 608,
75. Heath Ak，Williamson EJ，Ebeling Pr，Kvaskoff D，Eyles DW等。（2014）在存档干燥血液中的25-羟基vitamind浓度的测量是可靠的，准确地反映等离子体中的浓度。临床内分泌和新陈代谢杂志99：3319-3324。
76. Prentice P, Turner C, Wong MC, Dalton RN(2013)不同温度下储存2年的干血斑代谢产物的稳定性。生物分析法5: 1507 - 1514。
77. Michopoulos F, Theodoridis G, Smith CJ, Wilson ID(2011)使用UPLC结合正交加速ToF-MS进行代谢组学研究的干血斑代谢物谱:不同论文和样品存储稳定性的影响。生物分析法3：2757年至2767年。
78. Hollegaard MV, Grauholm J, Borglum A, Nyegaard M, Norgaard-Pedersen B，等(2009)使用归档的新生儿干血斑样本进行全基因组扫描。BMC基因组学10：297。
79. D'Arienzo CJ，JI QC，Discenza L，Cornelius G，Hynes J，等。（2010）DBS取样可用于稳定药物发现啮齿动物研究中的前药，而不加入酯酶抑制剂。生物分析法2：1415-1422。
80. Liu G, Ji QC, Jemal M, Tymiak AA, Arnold ME(2011)在干燥过程中评估干血斑样品的稳定性，并通过快速卡片上的pH值修改发现处理卡片以保持分析物的稳定性。肛门化学83: 9033 - 9038。
81. Elbin CS，Olivova P，Marashio Ca，Cooper Sk，Cullen E，等。（2011）干燥血液斑点对五种溶酶体酶活性的效果。我们共同Chimica学报412：1207-1212。
82. O'Mara M，Hudson-Curtis B，Olson K，Yueh Y，Dunn J，等。（2011）血细胞比容和冲床位置对干血斑样品的定量生物分析期间测定偏差的影响。生物分析法3: 2335 - 2347。
83. Youhnovski N，Bergeron A，Furtado M，Garofolo F（2011）预切干血点（PCDBS）：一种替代干血点（DBS）技术以克服红细胞压积影响的方法。快速COMMUN。大众Spectrom25：2951-2958。
84. 李飞，朱尔科斯基(2011)穿孔干燥血点:一种新的精确微采样方法。生物分析法3: 2321 - 2333。
85. Li F，Ploch S，Fast D，Michael S（2012）穿孔干血液点精确微采样：概念及其在毒制样品收集中的应用。质谱学杂志47: 655 - 667。
86. (2015) UHPLC-MS/ MS对人干血点样品中阿哌沙班的生物分析。J Chromatogr B分析技术生物密9988：66-74。
87. 王鹏(2012)利用膜过滤装置形成干燥的血浆斑点用于全血中胍法辛的定量测定。大众Spectrom26：1208-1212。
88. Shimadzu S（2016）Noviplex卡：Shimadzu大洋洲
89. Odoardi S, Anzillotti L, Strano-Rossi S(2014)简化样品前处理:将干血斑(DBS)方法应用于血液样本，包括死后，用于滥用药物的UHPLC-MS/MS分析。法医科学Int243: 61 - 67。
90. Nirogi R，Kandikere V，Komarneni P，Aleti R，Padala N等人。（2012）探索干血液点采样技术同时抗反转录病毒药物定量:拉米夫定、司他夫定和奈韦拉平在啮齿动物药动学研究中的应用生物医学。Chromatogr26日:1472 - 1481。
91. 引用本文:王志强，王志强，王志强，等。D.(2012)建立干燥血斑上抗生素厄他培南的UPLC-MS/ MS测定方法。J Pharm Biomed Anal61：108-113。
92. Koseki N, Nakashima A, Nagae Y, Masuda N(2006)采用快速样品处理方法，液相色谱/质谱法同时测定人血中环孢素A及其三种主要代谢物AM1, AM4N和AM9。快速共产质谱20: 733-740.
93. 李勇，海宁，雅培，王鹏(2012)半自动化直接洗脱法测定人血中胍法辛含量。生物分析法4: 1445 - 1456。
94. Deglon J，Thomas A，Daali Y，Lauer E，Samer C等人。（2011）将干燥血斑的在线解吸的自动化系统应用于氟氯芬及其代谢物的LC / MS / MS / MS药代动力学研究。J Pharm Biomed Anal54: 359 - 367。
95. J.HT.Miller，Poston Pa，Karnes HT（2011）通过直接解吸与高分辨率色谱和质谱法直接分析干血斑，用于定量枫糖浆尿疾病生物标志物亮氨酸和异亮氨酸。肛门Bioanal化学400: 237 - 244。
96. Clark GT, Haynes JJ (2011) DBS在药物发现中的应用:一个简单的2D-LC-MS/MS系统，以最小化FTA中的血液和纸基矩阵效应eluteâ”①DBS。生物分析法3: 1253 - 1270。
97. Shokati T，Bodenberger N，Gadpaille H，Schniedewind B，Vinks Aa，等。（2015）使用LC-MS / MS定量干燥血液斑点的免疫抑制剂标准蛋白。J Vis实验105: e52424。
98. van Berkel GJ，Kertesz V，King RC（2009）高通量模式液体微结表面采样探头。分析化学81: 7096 - 7101。
99. Van Berkel GJ, Kertesz V(2013)在线连接高效液相色谱/质谱用于小分子和蛋白质空间解析分析的连续流动液体微结表面取样探针，Rapid Commun。大众Spectrom27日:1329 - 1334。
100. Edwards RL, Creese AJ, Baumert M, Griffiths P, Bunch J，等(2011)通过干燥血斑表面直接取样结合高分辨率质谱分析血红蛋白变异。分析化学83：2265-2270。
101. Gaissmaier T，Siebenhaar M，Todorova V，Hullen V，Hopf C（2016）使用液体微型表面采样和高分辨率质谱法在干血斑中治疗药物监测。分析师141: 892 - 901。
102. Kertesz V，Van Berkel GJ（2010）使用芯片的机器人纳米电气喷雾平台全自动自动化液体提取的表面采样和电离。JMS45: 252 - 260。
103. Ingels AS, Lambert WE, Stove CP(2010)用直接“现场”衍生化的简单气相色谱-质谱法测定干血斑中的-羟基丁酸。肛门Bioanal化学398: 2173 - 2182。[crossref]
104. Mess JN, Taillon MP, Côté C, Garofolo F(2012)干血斑卡片衍生化:一种替代形式的样品处理，以克服硫孤儿在生物基质中的不稳定性。仿生色谱仪26日:1617 - 1624。[crossref]
105. Rhoden L, Antunes MV, Hidalgo P， Álvares da Silva C, Linden R(2014)气相色谱-质谱法测定干血斑中丙戊酸的简易方法。J Pharm Biomed Anal96: 207 - 212。[crossref]
106. Déglon J, Lauer E, Thomas A, Mangin P, Staub C(2010)结合快速气相色谱和负离子化学电离串联质谱的干血点取样过程的使用:氟西汀、去氟西汀、瑞波西汀和帕罗西汀分析的应用。肛门Bioanal化学396：2523-2532。[crossref]
107. (2011)基于气相色谱/质谱的代谢组学分析。肛门化学83: 4314 - 4318。[crossref]
108. Pitt JJ(2009)液相色谱-质谱联用技术在临床生物化学中的原理与应用。Clin Biochem Rev.30：19-34。
109. Miller JM(2009)色谱-质谱检测(GC/MS和LC/MS)在:色谱1:309-329。
110. Xu RN，Fan L，Rieser MJ，El-Shourbagy Ta（2007）LC-MS / MS的高通量定量生物分析最近的进展。J Pharm Biomed Anal44：342-355。[crossref]
111. Meesters RJ, Hooff GP(2013)最先进的干血斑分析:最新进展和未来趋势概述。生物分析法5：2187-2208。[crossref]
112. Shushan B（2010）液相色谱 - 串联质谱临床诊断应用综述。质量范围转速29：930-944。[crossref]
113. 李芳，李芳，李芳，等(2011)基于二维scx /RPLC的LC-MS/MS灵敏度增强方法及其在克隆定血药动力学评价中的应用。生物分析法3: 1577 - 1586。[crossref]
114. Oliveira RV, Henion J, Wickremsinhe E(2014)基于二维液相色谱-高分辨率四极杆飞行时间质谱的全自动在线干血斑提取和生物分析方法。肛门化学86: 1246 - 1253。[crossref]
115. Saint-Marcoux F, Sauvage FL, Marquet P (2007) LC-MS在治疗药物监测中的作用。肛门Bioanal化学388: 1327 - 1349。[crossref]
116. 吴安华，黄志强，张晓东，等。(2012)液相色谱-高分辨率质谱联用技术在临床毒理学研究中的应用。临床毒理学（PHILA）: 733 - 742。[crossref]
117. 泰勒PJ，邰CH，富兰克林ME，Pillans PI（2011）的液相色谱 - 串联质谱法的治疗药物监测免疫抑制剂和抗逆转录病毒药物的电流的作用。中国生物化学44: 14到20。[crossref]
118. Keevil BG(2011)干血点样品的液相色谱串联质谱分析。中国生物化学44: 110 - 118。[crossref]
119. Crawford E, Gordon J, Wu JT, Musselman B, Liu R, et al.(2011)直接实时分析结合干燥点采样用于药物发现环境中的生物分析。生物分析法3: 1217-1226.[crossref]
120. Cody RB, Dane AJ(2006)实时离子源的直接分析，载于《分析化学百科全书》。[crossref]
121. 王聪，朱H，蔡Z，宋F，刘Z，等。（2013）采用直接实时分析（DART）质谱法筛查新生儿苯丙酮尿症。肛门Bioanal化学405: 3159 - 3164。
122. 利用电喷雾电离质谱法快速鉴定血红蛋白变异。血细胞Mol Dis27日:691 - 704。
123. Takáts Z, Wiseman JM, Gologan B, Cooks RG(2004)环境条件下解吸电喷雾电离质谱采样。科学306: 471 - 473。[crossref]
124. Wiseman JM, Kennedy JH(2014)使用DESI质谱分析干血点。方法杂志1198: 291 - 297。[crossref]
125. Wiseman JM, Evans CA, Bowen CL, Kennedy JH(2010)利用解吸电喷雾电离(DESI)质谱直接分析干血斑。分析师135: 720 - 725。
126. RANC V，哈夫利切克V，比德纳P，LEMR K（2008）纳米解吸电及在药物人全血样品中的手性分析动力学方法。Eur J质谱(奇切斯特)14: 411 - 417。[crossref]
127. Dénes J, Katona M, Hosszú A, Czuczy N, Takáts Z(2009)直接结合固相萃取-解吸电喷雾质谱分析生物流体。肛门化学81：1669-1675。[crossref]
128. Beecher CWW(2003)代谢谱:在生物标志物发现和基因功能分析中的作用。施普林格，纽约，页311-319。
129. Timmerman P, White S, Globig S, Lüdtke S, Brunet L，等(2011)EBF对干血斑生物分析方法验证的建议。生物分析法3: 1567 - 1575。(Crossrref)
130. 阿伯特，斯麦拉利亚，怀特，吕特克，布鲁内等(2010)干血点连接策略。生物分析法2：1809-1816。[crossref]
131. Timmerman P, White S, Cobb Z, Woods K, de Vries R，等(2014)欧洲生物分析论坛继续计划支持液体微采样。生物分析法6: 1897 - 1900。[crossref]
132. Abu-Rabie P, Denniff P, Spooner N, Brynjolffssen J, Galluzzo P, et al.(2011)干燥基质斑点样品应用内标法进行生物定量分析。肛门化学83: 8779 - 8786。[crossref]
133. Meesters R，Hooff G，Van Huizen N，Druders R，Luider T（2011）内标添加对生物分析方法发育的干血斑分析的影响。生物分析法3: 2357 - 2364。[crossref]
134. Zimmer D, Hassler S, Betschart B, Sack S, Fankhauser C(2013)喷雾干燥血斑的内部标准应用:内部标准分布调查。生物分析法5：711-719。[crossref]
135. Heinig K，Bucheli F，Hartenbach R，Gajate Perez A（2010）人血浆、超滤液、血液、DBS和干血浆斑点中麦考酚酸及其苯基葡萄糖醛酸的测定。生物分析法2: 1423 - 1435。[crossref]
136. 李伟，谢福林(2010)结合LC-MS/MS对小分子的定量分析。仿生色谱仪24: 49 - 65。[crossref]