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摘要

癌细胞通过不同的膜突出物(包括质膜泡)进行迁移。由于肌动球蛋白收缩引起的细胞质压力增加，当质膜从下层皮层分层时，就会形成泡疱，这导致水和胞质液通过水通道流入分离的膜，导致其增大。在本研究中，我们结合分子生物学和显微镜技术检测了水通道蛋白1 (aquaporin 1, AQP1)在泡形成中的作用，并首次报道了sirna介导的AQP1的下调抑制了嵌入3D基质中的HT1080和ACHN细胞系中的泡形成。在HT1080细胞中，sirna转染48小时后水泡重新出现，Western blotting显示这与AQP1蛋白的表达相一致。通过使用共聚焦和相位对比延时显微镜来跟踪泡的动态，我们证明，与野生型泡相比，由于扩张、稳定和收缩时间更长，重新出现的泡具有更长的寿命。此外，过表达gfp标记的AQP1显著增加了泡的大小，也通过赋予细胞更短和更快的泡收缩时间来缩短泡的寿命。为了揭示aqp1促进气泡收缩的机制，我们的数据显示需要钠-氢交换器(Na⁺/小时⁺)活性，因为对泵活性的抑制减弱了气泡的缩回。同样重要的是，我们证明GFP-AQP1过表达在非起泡MDA-MB-231细胞系中充分诱导起泡表型。因此，AQP1在对抗癌细胞迁移方面是一个潜在的治疗靶点。

关键字

水通道蛋白1，泡，皮层，收缩性，膜

简介

泡是由肌动球蛋白介导的收缩作用形成的球形突出物，导致质膜从下层皮层剥离[1］．一旦启动，气泡会在短时间内根据细胞内静水压力的变化动态扩张和收缩，其生命周期包括扩张、稳定和收缩三个阶段[2，3.］．开始时，随着水和液体从胞质通过泡颈流入泡内，细胞泡生长和膨胀。膨胀阶段通常持续5-30秒，膨胀的泡泡最初不含肌动蛋白细胞骨架[4，5］．当水和胞质液的流量不足以维持稳定增长时，气泡的膨胀逐渐消退，并达到短暂的稳定阶段[6］．此时，当肌动蛋白成核因子、膜皮层连接蛋白(如ERM (ezrin、radixin和moesin)和马达蛋白(特别是肌球蛋白II)被招募到泡膜时，气泡开始收缩[2，5］．收缩阶段是最长的，可能持续120秒[7］．膜泡发生在不同的生物和病理生理过程中，包括凋亡[8，胞质分裂[9，10，细胞扩散[11 - 13]，病毒性微胞病[14]，胚胎发生[15]和转移性肿瘤细胞[16，17］．当基质蛋白水解受到抑制时，癌细胞通过使用膜泡挤压细胞外基质(ECM)的小孔进行迁移[18］．

水通道(AQPs)是完整的跨膜通道(28-30 kDa)，允许水或水和其他物质(如甘油和尿素)通过质膜运输，以响应由盐和离子的主动运输产生的渗透梯度[19，20.］．在不同的哺乳动物组织中已鉴定出13种水通道蛋白异构体(AQP0-AQP12) [21］．尽管AQP12的转运功能未知，正统的水通道蛋白(AQP0, AQP1, AQP2, AQP4, AQP5, AQP6和AQP8)专门运输水，而水甘油oporins (AQP3, AQP7, AQP9和AQP10)运输水和小溶质如甘油和尿素[22日至25日］．有趣的是，人们发现AQP11是水和甘油的转运体[26］．在所有的aqp中，对AQP1进行了广泛的研究，它是在各种人体组织中特征最好、表达最广泛的水通道蛋白[即］．表达AQP1的组织，AQP1也是门控离子通道[34，35，显示出很大的透水性[36］．除了跨膜水运输外，AQP1还与一些病理情况有关，包括尿浓度缺陷[37， nociception [38，增强血管生成[39，40]，以及癌细胞迁移[28，36，41］．尽管有报道称AQP1参与癌细胞迁移，但尚未研究其在ECM中癌细胞膜泡形成中的作用。

在目前的研究中，我们利用三维矩阵矩阵作为正常人体ECM的模拟模型来解决这个问题。我们证明了AQP1在调节癌细胞泡变中发挥的新作用，它通过促进泡变的收缩来实现，这一机制需要Na的活性⁺/小时⁺换热器。smartpool siRNA敲除AQP1抑制了3D基质培养的人纤维肉瘤HT1080和肾腺癌ACHN细胞的膜泡形成。结果发现，在HT1080细胞中，sirna转染48 h后AQP1蛋白重新出现，并在该细胞系中同时出现膜泡。活细胞成像和延时显微镜显示，与野生型细胞相比，再生泡的寿命相对较长。过表达gfp标记的AQP1增加了气泡的大小，同时减少了气泡的数量。对这些水泡的详细分析显示，AQP1显著地加快了水泡的收缩，而对扩张期没有任何显著影响。此外，AQP1过表达在非起泡细胞中充分诱导了气泡的形成。最后，为了阐明aqp1促进气泡收缩的机制，本研究论证了Na的要求⁺/小时⁺由于已知抑制剂乙基异丙基阿米洛利(EIPA)对泵活性的抑制作用，可消融扩大的气泡的回缩。我们的发现对AQP1如何积极调节气泡形成提出了新的见解。因此，开发抗aqp1药物将是一种有前途的治疗策略，以对抗不同的人类癌症。

材料与方法

细胞培养

所使用的细胞系，人纤维肉瘤HT1080、肾腺癌ACHN和乳腺腺癌MBA-MB-231细胞从英国索尔兹伯里的HPA培养集合中获得。细胞在添加10% (v/v)胎牛血清、1% (2 mM) l -谷氨酰胺、1%(100µg/ml)链霉素、1%(100单位/ml)青霉素的杜尔贝科改良Eagle培养基(DMEM)中培养，培养时间为37^ºC加湿5% (v/v) CO₂大气的空气。每48小时对细胞进行维护和传代。Smartpool人类AQP1、AQP3、AQP4和AQP5 sirna从英国拉夫堡的Fisher Scientific购买。所有抗体-抗aqp1(猫。no: ab65837)， anti-AQP3 (cat。no: ab125219)， anti-AQP4 (cat。no: ab46182)和anti-AQP5 (cat。no: ab85905)用于免疫细胞化学和Western blotting的抗体来自英国剑桥Abcam Plc。Batimastat (BB-94)、PIC set VI(蛋白酶抑制剂鸡尾酒VI)和Y27632购自英国诺丁汉Calbiochem。乙基异丙基阿米洛(EIPA)购自英国布里斯托的Tocris Bioscience公司。除PIC在超纯水中重构外，其余抑制剂均溶解于DMSO中。

核转染

HT1080和ACHN细胞系的转染使用DharmaFECT转染试剂组4 (T-2004-02)，按照先前描述的制造商说明进行[6］．简单地说，细胞以2 x 10的密度播种在6孔板上⁵细胞/孔，37孵育^ºC加5% CO₂转染前24小时。从20 μ M的siRNA原液中，用1 × siRNA缓冲液(20 mM KCl, 6 mM HEPES (pH 7.5)和0.2 mM MgCl制备5 μ M siRNA溶液₂)，其本身由5倍siRNA缓冲液(300 mM KCl, 30 mM HEPES (pH7.5)， 1.0 mM MgCl制备₂)和无rnase水的比例为1:4。架设了两根管子。在第一管和第二管分别引入适量的5µM siRNA溶液和dharafect转染试剂。将只添加l -谷氨酰胺(无抗生素和无血清培养基)的培养基引入每个试管，两个试管在罩中孵育5分钟。孵育后，将第一管中的内容物添加到第二管中，并将得到的混合物重新悬浮，让其混合20分钟，然后向混合物中添加无抗生素的培养基。取出6孔板中细胞的培养基，每孔中加入总转染培养基2ml，孵育24和48 h。最终siRNA浓度为25 nM, Western blotting证实蛋白敲除。

转染gfp标记的AQP1

AQP1-GFP转染细胞使用Fugene转染试剂，按照制造商的说明进行。简单地说，在实验开始前，将细胞以1.5 x 10的密度播种在6孔板中⁵细胞/孔，37℃孵育过夜^ºC加5% CO₂供应。将无血清培养基引入eppendorf管，并将优化体积的Fugene转染试剂直接添加到无血清培养基中，通过轻轻“轻弹”混合。内容物在罩中孵育5分钟，然后向管中加入优化数量的AQP1-GFP，轻轻混合。内容物再孵育15分钟。在6孔板中从细胞中取出培养基，DNA-Fugene复合物以滴状方式均匀引入。然后细胞在37℃孵育^ºC孵育24小时或48小时，以便DNA的吸收和表达。

起泡化验

起泡试验是在我们的实验室中设计的，如前所述[6］．简单地说，生长因子减少基质(BD Biosciences, UK)在夜间4点解冻^ºC并保持在冰上。针尖、移液器、盘子、玻璃盖、µ-dish和管在-20冷却^º融合细胞用PBS冲洗，胰蛋白酶化，然后在无血清的冷培养基中重悬。将细胞悬浮液以等量的比例小心地加入到基质中，并适当混合。将200µl的细胞基质悬浮液分别镀于6孔板和35mm玻璃底盘的玻璃盖上，37孵育^º静置30分钟，使基质凝固。加入完全细胞培养基，在caspase抑制剂组VI(10µM)的存在下，通过阻断基质金属蛋白酶(MMPs)和蛋白酶(BB-94(1µM)和PIC(1:100)的蛋白水解活性，诱导细胞形成泡沫，从而抑制凋亡泡沫的形成。然后培养皿在37℃孵育^ºC加热18小时。

细胞活力测定(MTT法)

用起泡剂处理后的细胞的活力是通过将黄色四唑盐，3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)通过代谢活性细胞还原为细胞内的紫色福马赞，然后用分光光度法溶解和定量。简单地说，ACHN和HT1080细胞(5 x 10⁴细胞/孔)接种于添加10%胎牛血清、1%谷氨酰胺和青霉素/链霉素的无酚红培养基的24孔板上，37孵育24 h^oC代表细胞粘附在极板上。在caspase inhibitor set VI(10µM)的存在下，用BB-94(1µM)和PIC (1:10 M)挑战细胞，然后再孵育18 h。用500µl的预热培养基取代培养基。加入MTT原液(5 mg/ml)(1:10稀释)至最终浓度为0.5 mg/ml。细胞用铝箔包好，37℃孵育3小时^oC在加5% CO的潮湿大气条件下₂供应。加入550µl的增溶缓冲液，室温混合均匀后转入eppendorf管，旋涡混合。样品在室温下孵育10分钟，然后再次通过涡流混合。空白(背景)和测试样品的吸光度值分别在690 nm和570 nm处用詹威分光光度计(Stone, stfordshire, UK)记录。

气泡大小的测定

气泡大小的测定以前有过描述[6］．简单地说，用ImageJ的“多边形”工具在单元格上每个气泡的整个圆周上手工画了一条细线。然后是“analyze > measure”，从下拉结果列表中，记录像素单位的周长值。像素值通过与0.11µm的预校准因子(该因子对应1像素，用光栅校准40倍物镜时得到)相乘归一化。

气泡细胞百分比的定量

起泡细胞百分比的定量先前有过描述[6］．在蔡司A1倒置显微镜的位相对比台上适当安装平板和µ-盘片，用x40物镜观察细胞总数(有泡细胞和无泡细胞)，并人工计数。用起泡细胞数除以起泡细胞数与非起泡细胞数之和得到起泡细胞百分比。然后将商乘以100。

气泡速度的测定

为了确定气泡的速度，在ImageJ中打开图像，使用“直线”工具在每个气泡的中心从一端到另一端画一条直线。这被称为“气泡距离”。类似地，每个气泡膨胀和收缩所需的时间是通过手动跟踪膨胀和收缩过程中的帧数来量化的，然后乘以2，因为每帧2秒生成电影(即从观察到气泡膨胀或收缩的第一帧到膨胀或收缩停止的最后一帧之间的时间)。用距离除以时间得到气泡速度。

气泡动力学分析

在37℃预热的TiE200显微镜下，对三维基质培养皿中培养的气泡诱导细胞进行动态分析^ºC加5% CO₂供应。使用40倍物镜，以每2秒1帧的速度生成气泡细胞延时电影，实验时间为10分钟。延时电影在imageJ中打开，通过控制电影的“前进”和“后退”按钮手动播放。随着电影的发展，气泡膨胀、稳定和收缩所需的帧数被仔细监控和记录，然后乘以2(因为电影是2秒/帧生成的)。用气泡膨胀、稳定和收缩的总和来计算气泡寿命。

免疫细胞化学

细胞被播种在6孔板的盖玻片上，37孵育^ºC在5% CO的大气条件下₂供细胞24小时粘附在封面上。在用4% (v/v)多聚甲醛固定20分钟之前，用预冷的PBS冲洗细胞两次。细胞用PBS冲洗两次(每个10分钟)，然后用0.2% (v/v) triton x-100在室温下渗透15分钟。用10% (v/v)山羊血清(Sigma)在PBS中阻塞细胞30分钟，然后用1% (v/v)山羊血清中的人抗aqp1抗体(1:200稀释)室温孵育1小时。去除一级抗体，用预冷的PBS冲洗3次(每次10分钟)，再用Alexa fluor 488偶联的二抗(1:500)孵育1小时。盖片转移到显微镜载片上，细胞用Vectashield/DAPI安装介质反染色，静置后进行共聚焦显微镜观察。

西方墨点法

HT1080和ACHN细胞系被植入6孔板上过夜，并转染人AQP1 sirna。为了测定蛋白质表达，细胞被培养到6孔板融合。在蛋白酶抑制剂鸡尾酒(1:100)存在的情况下，收集细胞并在放射免疫沉淀试验(RIPA)缓冲液中裂解。蛋白质电泳在15%的聚丙烯酰胺凝胶上，然后转移到PVDF膜上，用5%的脱脂牛奶在0.1% tbs -吐温中阻隔。膜在4点孵育过夜^ºC含有人抗aqp1、AQP3、AQP4和AQP5抗体(1:1000)。二抗为抗小鼠和抗兔IgG-HRP(1:2000)。以抗微管蛋白抗体作为负荷对照。膜用增强化学发光(ECL)试剂A和B处理，然后用ImageQuant LAS 4000机器(GE医疗保健生命科学)开发。

统计分析

3个或3个以上变量经过Tukey的事后多重比较后，通过单因素方差分析进行统计显著性，而对2个变量进行未配对的双尾学生t检验。使用GraphPad prism 5软件(GraphPad软件，圣地亚哥，加州)进行所有比较。所有数据来自至少3个独立实验(n=3)， P值< 0.05被认为有统计学意义。

结果

癌细胞中的气泡诱导

在正常、不受抑制的状态下，包括人纤维肉瘤HT1080和肾腺癌ACHN细胞系在内的癌细胞，在基质和胶原蛋白等3D水凝胶中培养，利用层状足和丝状足作为拉长的间充质细胞迁移，并降解表达基质金属蛋白酶(MMPs)的ECM [42］．我们最近通过抑制基质蛋白水解来诱导癌细胞在基质基质中起泡[6]，这是在先前报道的技术基础上改进而来的[18］．在caspase抑制剂集VI(10µM)存在的情况下，用蛋白酶抑制剂混合物PIC(1:10)阻断MMP与一般MMP抑制剂、batimastat BB-94(1µM)和其他表面蛋白酶的活性，筛选6种不同的人癌细胞系- A172(胶质母细胞瘤)、A549(肺癌)、ACHN(肾腺癌)、HT1080(纤维肉瘤)、MDA-MB-231(乳腺癌)和pan -1(胰腺癌)在Matrigel中形成气泡的能力。如图1a所示，抑制基质降解后，只有ACHN和HT1080细胞系中形成了膜泡。由于细胞膜泡也可由凋亡诱导的细胞死亡引起，我们采用MTT法来测定泡泡细胞的活力，如图1b所示，诱导泡剂的处理不影响细胞的活力，这表明HT1080和ACHN细胞中的膜泡是不凋亡的。此外，我们还询问这些气泡是否处于ROCK信号通路之下，据报道该信号通路控制着健康和不健康细胞中气泡的形成[5，43］．使用5 μ M的ROCK抑制剂，Y27632可以有效地消融细胞的气泡(图1c和d)，这表明这些细胞和其他细胞一样具有正常的气泡。

图1。癌细胞中的气泡诱导。(A)在caspase inhibitor set VI(10µM)的存在下，BB-94(1µM)和PIC (1:10 M)阻断基质蛋白水解，诱导癌细胞在ECM中产生气泡。数据是三个独立实验的均值±SEM的代表，其中125个细胞为每个细胞系评分;(B)用MTT (0.5mg/ml)测定BB-94和pic处理的ACHN和HT1080细胞系在黑暗中37年的活力^o在用增溶缓冲液增溶前浸泡3小时。充分再悬浮后，在RT下孵育10分钟，旋涡后用分光光度计测定吸光度值;(C) Y27632抑制ROCK信号;(D)抑制ROCK信号后的气泡数量;

肿瘤细胞AQPs表达水平的检测

接下来，我们评估了多个AQPs的表达水平，这些AQPs先前被证明与大量气泡HT1080细胞系中的癌症有关。如图2a所示，人抗AQP1、AQP3、AQP4和AQP5抗体免疫印迹显示，AQP3和AQP4表达极低或不表达，而AQP1和AQP5表达较高。同样，已知参与不同人类癌症的AQP1的表达水平(28)对所有6个癌细胞系进行了评估。如图2b所示，该蛋白在所有6个测试细胞系中都有表达。

图2。肿瘤细胞AQPs表达水平的检测。(A)大量起泡HT1080细胞系中AQP1、AQP3、AQP4、AQP5的表达水平;(B) Western blotting检测不同人癌细胞系中AQP1的表达水平。在这两种情况下，微管蛋白都被用作加载控制。数据为3个重复的3个独立实验的均值±SEM (n=3)。***:P<0.001，采用Tukey多重比较检验后的单因素方差分析。

sirna介导的AQP1的敲除可抑制气泡的形成

由于AQP1是最具特征的，并且已被报道参与不同人类癌症细胞的基于板瓣的迁移(28，36，44)，我们研究了水通道在HT1080和ACHN细胞中膜泡形成中的潜在作用，使用智能池sirna敲低该蛋白。通过Western blotting，我们证实两种细胞系的蛋白敲除都发生在24小时(图3a和b)，并且这种敲除在转染后的ACHN细胞系中持续了48小时(图3b)。正如预期的那样，AQP1的敲除抑制了两种细胞系中膜泡的形成(图3d和e)。

图3。sirna介导的AQP1的敲除可抑制气泡的形成。细胞在75 cm烧瓶中培养，使用DharmaFECT转染试剂4转染人AQP1 siRNA 24 h至48 h。使用RIPA缓冲液在蛋白酶抑制剂鸡尾酒PIC(1:100稀释)存在下裂解细胞。蛋白在15% SDS凝胶上分解，用人抗aqp1抗体(1:1000稀释)免疫印迹。微管蛋白被用作加载控制。(A) HT1080细胞AQP1敲除的免疫印迹;(B) ACHN细胞AQP1敲除免疫印迹;(C)归一化至微管蛋白加载控制后HT1080和ACHN细胞系中AQP1水平的密度定量;(D)将转染AQP1 siRNA的HT1080和ACHN细胞嵌入3D基质中，在10µM caspase inhibitor set VI的存在下，用1µM BB-94和PIC(1:100稀释)挑战HT1080和ACHN细胞，分别在24 h和48 h时，AQP1 siRNA抑制膜泡的形成(底部);(E)膜泡数量的量化;(F)转染aqp1 siRNA 48小时后HT1080细胞膜泡复发。 Data is a representative of the mean ± SEM of three independent experiments performed in triplicate in which 120 cells were scored for each treatment. ***:P<0.001, using one-way ANOVA after Tukey’s multiple comparison test.

干扰AQP1活性可延长泡泡寿命

在HT1080细胞系中，尽管AQP1在24小时的时间点被证实敲除，伴随气泡形成的消融(图3d和e)，但该蛋白的表达确实在48小时重新出现(图3a)，并且在该时间点膜泡再次出现(图3f)。因此，有必要对野生型细胞和转染sirna 48 h细胞中的气泡生命周期进行比较分析。通过跟踪活泡细胞的延时电影，对泡的动力学进行详细分析，发现aqp1受损细胞中的泡的扩张、稳定和收缩要比野生型细胞中的泡的扩张、稳定和收缩慢得多(分别为9.7、3.9和14.3秒)(分别为7.0、3.0和10.3秒)(图4a、b和c)。由于细胞泡的寿命包括扩张、稳定和收缩，与野生型细胞相比，这些数据的净效应是AQP1活性受到干扰的细胞中气泡的寿命更长(28.1秒)(图4D)。综上所述，这些数据表明AQP1活性对癌细胞中质膜泡的形成至关重要。

图4。干扰AQP1活性可延长泡泡寿命。在HT1080细胞中，48 h AQP1的损伤显著增加了以下时间:(A)泡的膨胀;(B)气泡稳定，(C)气泡收缩;(D) AQP1活性受损使泡泡寿命延长。数据代表在三个重复中进行的三个独立实验的平均值±SEM，其中每个治疗对120个细胞进行评分。***:P<0.001，采用双尾未配对学生t检验。

AQP1-GFP过表达对气泡形态的影响

为了进一步研究AQP1在质膜泡形成中的作用，通过AQP1- gfp转染该蛋白在细胞中过表达。过表达后，发现更多的AQP1定位于泡泡膜，而不是其余的细胞质膜(图5a)。沿着滤泡和细胞膜的AQP1- gfp荧光强度的定量显示，膜滤泡中的AQP1水平比细胞膜其他部分的AQP1水平高出两倍以上(图5b)。接下来，我们通过定量研究AQP1-GFP过表达引起的形态学改变，并比较AQP1-GFP转染细胞与野生型细胞中气泡的大小和数量。研究发现，在HT1080和ACHN细胞系中，AQP1-GFP过表达诱导的膜泡大小增加了近两倍(图5c和d)。然而，AQP1-GFP过表达后，膜泡数量显著减少(图5e)。

由于AQP1-GFP过表达导致HT1080和ACHN细胞系中气泡尺寸增大，我们推测AQP1-GFP也可以在非气泡细胞系中诱导气泡形成。这一假设在转移性人乳腺腺癌细胞系MDA-MB-231中得到了验证，尽管其内源性AQP1水平表达较高，但在3D基质中并未形成膜泡(图2b)。该细胞系仅显示出微小的穗状结构(图5f，上面板)。然而，如图5f(底板)所示，AQP1-GFP过表达充分诱导MDA-MB-23细胞中气泡的形成。

图5。AQP1-GFP过表达的影响。(A) AQP1-GFP在ACHN(上图)和HT1080(下图)中的过表达表明，相比细胞膜的其他部分，AQP1-GFP在泡泡膜上的定位更明显;(B)泡泡和细胞膜中AQP1-GFP表达的荧光强度定量;(C) AQP1-GFP过表达细胞中气泡形态的相位对比图;(D和E) HT080和ACHN细胞系中气泡大小(周长)和数量的量化;(F) AQP1-GFP过表达诱导MDA-MB-231细胞泡变表型。数据是三个独立实验的代表，在三个重复(n = 3)中120个细胞被评分。^＊＊＊:P < 0.001，采用双尾无配对学生t检验，Tukey多重比较检验后采用单因素方差分析。

AQP1-GFP过表达有利于气泡的收缩阶段

由于AQP1过表达导致泡的大小增加，我们首先试图了解这些泡的动态，以及它们是否像野生型细胞中的泡一样。因此，我们生成了滤泡aqp1过表达HT1080细胞的相位对比延时电影，并跟踪了细胞滤泡生命周期的不同阶段。详细分析显示，AQP1-GFP过表达细胞和野生型细胞中气泡的膨胀时间没有显著差异(图6a)。泡泡稳定时间也得到了类似的结果(图6b)。然而，我们发现过表达AQP1-GFP的细胞比野生型细胞中的泡在相对较短的时间内(更快)收回它们的泡(图6c)，这使得前者的泡的寿命更短(图6d)。此外，我们跟踪了气泡膨胀和收缩的速度(气泡距离/周长与时间的比值)，并发现野生型细胞中无显著差异(图6e)。然而，有趣且重要的是，AQP1过表达显著增加了气泡的收缩速度，而不是膨胀速度(图6e)。综上所述，这些数据表明AQP1通过促进气泡缩回阶段来调节膜泡的形成。

图6。AQP1-GFP过表达有利于气泡的收缩阶段。转染AQP1-GFP的HT1080细胞在基质中培养，用水泡诱导剂处理，37孵育^o(A)野生型和过表达aqp1的HT1080细胞中的气泡膨胀时间没有显著差异;(B)野生型和过表达aqp1的HT1080细胞中气泡稳定时间无显著差异;(C)过表达aqp1的细胞比野生型细胞更快地收回水泡;(D)过表达aqp1的细胞泡泡寿命比野生型细胞短;(E)尽管野生型HT1080细胞中气泡的扩张和收缩速度没有显著差异，但AQP1-GFP过表达显著增加了气泡的收缩速度，而不是气泡的扩张速度。数据表示三次重复的独立实验的均值±SEM。^＊＊＊:P < 0.001，采用双尾无配对学生t检验，Tukey多重比较检验后采用单因素方差分析。

aqp1促进的气泡收缩需要Na⁺/小时⁺换热器的活动

最近的研究表明，当肿瘤细胞被限制在微通道中时，它们建立了水通道蛋白和钠的极化分布⁺/小时⁺交换器，水的净流入和净流出分别通过前缘和尾缘，这推动细胞从一点迁移到另一点[45］．因此，我们假设aqp1促进的气泡收缩可能部分是由于Na的流入⁺由于钠的质子挤压，细胞内碱化或细胞外酸化⁺/小时⁺泵。为了验证这一假设，在ACHN和HT1080细胞中，钠阻断泵的通道活性15分钟⁺/小时⁺泵抑制剂乙基异丙基阿米洛利(EIPA)，由于质子和钠的作用，会导致细胞内酸化和细胞外碱化⁺分别积累。如图7a和b(下图)所示，用100 μ M EIPA预处理过表达AQP1-GFP的细胞可以抑制气泡的收缩。膜泡只扩大，没有任何可见的收缩，这导致与对照细胞相比，泡的大小增加了4倍多(图7c)。有了这一观察，人们认为气泡的收缩可能会减慢，更长的时间可以观察到气泡的收缩。Na的抑制⁺/小时⁺在HT1080细胞株中浸泡30、60和90分钟对泡的大小没有显著影响(图7d)。然而，在ACHN细胞系中，细胞的大小发生了逐渐的、时间依赖性的增加，在90分钟的时间点，细胞的大小差异变得显著(图7d)。在这两种细胞系中，气泡只是扩大而没有任何可观察到的退缩，这表明aqp1促进的气泡退缩需要Na⁺/小时⁺泵的活动。

图7。aqp1促进的气泡收缩增加需要Na⁺/小时⁺泵的活动。将过表达AQP1-GFP的HT1080和ACHN细胞株培养于3D基质中，然后在caspase抑制剂设置VI(10µM)的存在下用BB-94(1µM)和PIC (1:10 M)挑战。用epa(100µM)预处理细胞。(A)和(B) EIPA分别阻止HT1080和ACHN细胞中的气泡退缩(底部面板);(C)细胞epa处理后气泡大小的定量;(D)细胞epa处理时间历程。数据是三个独立实验的平均值±SEM的代表，在三个重复中120个细胞被评分。^＊＊＊:P < 0.001，采用Tukey多重比较检验后的单因素方差分析。

讨论

一些病理情况被归因于水通道蛋白功能的受损。尤其令人感兴趣的是，发现AQP1水通道不仅促进水的通过，而且参与血管生成、细胞增殖、细胞迁移、细胞粘附和致癌[28，39，40，46］．因此，有必要对其在癌症转移和其他病理条件中的作用进行批判性评估。然而，尽管AQP1参与了基于板瓣的细胞迁移和肿瘤发生，但它在ECM中肿瘤细胞泡形成和泡化中的作用尚未被研究。

因此，本研究通过筛选6种不同的人类癌细胞系，即A172(胶质母细胞瘤)、A549(肺癌)、ACHN(肾腺癌)、HT1080(纤维肉瘤)、MDA-MB-231(乳腺腺癌)和pan -1(胰腺癌)在ECM中的起泡能力，开始了质膜泡形成的研究。通过抑制mmp和其他表面蛋白酶的蛋白水解活性进行筛选，发现只有ACHN和HT1080细胞系在基质降解抑制后起泡(图1a)。这些气泡是非凋亡的，因为已知执行程序性细胞死亡的caspases的活性被抑制了。此外，细胞膜泡在细胞内积极动态地扩张和收缩。我们进一步证实，细胞在水泡诱导剂中存活，通过MTT法测定细胞活力，HT1080和ACHN细胞的活力分别为91.53%和93.98%(图1b)。此外，必须确定这些泡是否符合并受rhor - rock信号通路的影响，该信号通路已被广泛报道为控制健康细胞和凋亡细胞中的泡的形成[43］．用已知的抑制剂Y27632抑制ROCK，可有效阻止两种细胞系中气泡的形成(图1c)。在确认了细胞的活性和Rho-ROCK信号在泡形成中的要求后，我们继续研究AQP1在嵌入ECM的癌细胞中膜泡形成中的作用。

最初，我们研究了AQP1、AQP3、AQP4和AQP5的表达水平，这些蛋白之前在不同的癌症中都有涉及[28，47-51]，并在大量起泡的HT1080细胞中检测到AQP1和AQP5的表达(图2a)。此外，通过Western blotting，我们发现AQP1是所有已知AQP亚型中特征最好的，它在其他5种不同的癌细胞系中都有表达，其中无气泡的MDA-MB-231和A549细胞系表现出最高的内源性AQP1表达水平(图2b)，这表明AQP1的表达水平并不一定会使细胞具有气泡能力。AQP水通道主要定位于质膜，尽管它们也定位于细胞质腔室，它们确实在激素和激酶激活的响应下转移到质膜[52］．例如，在卵母细胞中已经报道了pka依赖性的AQP1磷酸化和质膜易位[53]，在星形胶质细胞中，低张力诱导的AQP1易位已被证明[54］．同样，据报道，在HEK293细胞中，AQP1通过pkc依赖的机制转运到质膜[55］．因此，不起泡的MDA-MB-231和A549细胞中的大部分AQP1可能定位在细胞质上，这些细胞起泡可能需要质膜易位机制。事实上，人抗AQP1抗体免疫细胞化学染色显示，AQP1在ACHN和HT1080细胞的质膜上均有表达，而该蛋白主要表达在MDA-MB-231细胞系的胞质腔室中(数据未显示)。此外，也可能是只有AQP1的表达不足以使这些细胞起泡，其他调控因子是必需的，但可能在这些细胞系中不存在。

通过sirna介导的基因敲除，研究AQP1在质膜泡形成中的作用，结果显示AQP1促进了HT1080和ACHN细胞中的膜泡形成，因为在两种细胞系(sirna转染24小时后)中敲除该蛋白会抑制泡的形成(图3a, b和d)。重要的是，在HT1080细胞中，我们发现在sirna转染48小时后，泡开始重新出现(图3f)。该事件与AQP1蛋白在同一时间点的表达平行(图3a)。对aqp1 siRNA转染后48 h和野生型HT1080细胞中气泡再出现的动态进行了研究，详细分析了气泡的生命周期，包括膨胀、稳定和收缩阶段[56］．研究发现，由于野生型细胞的气泡膨胀、稳定和收缩膜需要更长的时间，因此再生的气泡比野生型细胞中的气泡寿命更长(图4a、b和c)。对这一观察结果的一个可能的解释可能是，尽管在转染AQP1 siRNA后48小时，气泡再次出现，但siRNA处理对AQP1活性产生了负面影响，导致水运输机制缺陷，阻碍了水在质膜中的快速流动。这导致了胞质液体进入生长泡的延迟。由于肌动蛋白的再聚合和皮层-膜连接蛋白的募集是介导泡囊收缩的已知因素[5]，我们可以推测，AQP1活性受损也可能阻碍肌动蛋白的再聚合以及皮层-膜连接蛋白(如ERM蛋白)的募集。这一发现的一个重要意义是，滤泡细胞中AQP1活性的损害将导致泡泡周期的完成时间变长，因此，这些细胞将经历缓慢和异常的泡泡迁移，而在水和液体通过速度更快的野生型细胞中，泡泡周期将在相对较短的时间内完成，因此，细胞不仅迁移更快，而且变得更具侵略性和侵袭性。

为了进一步了解AQP1在癌细胞中膜泡形成中的作用，在起泡的ACHN和HT1080细胞系中都过表达了gfp标记的AQP1，结果发现，在这两种细胞系中，AQP1定位于膜泡(图5a)。AQP1- gfp荧光强度的定量显示，泡泡膜中AQP1的浓度是其余细胞膜的两倍以上(图5b)。根据之前的报道，AQP1也可能是细胞质的[52]，在HT1080细胞系中也观察到AQP1在细胞内的大量存储(图5a，下图)。AQP1过表达曾被报道与细胞肿胀和体积增加有关[54，57]，因此，我们预期AQP1过表达可能调节我们细胞系中的气泡形态。事实上，活细胞成像评估AQP1- gfp过表达后的形态学改变显示，AQP1过表达显著增加了水泡的大小(图5c和d)，同时减少了两个细胞系中水泡的数量(图5e)。AQP1过表达对HT1080细胞中泡大小的影响更深远，因为这些泡明显大于ACHN细胞系中的泡(图5c)。HT1080细胞是否比ACHN细胞表达更多的水通道尚不清楚，但本研究的western blotting数据显示，两种细胞系中AQP1的表达水平无显著差异(图2b)。接下来，我们利用AQP1过表达后气泡大小的形态增加来研究该蛋白在无气泡侵袭性人乳腺腺癌MDA-MB-231细胞系中过表达的影响。令人惊讶的是，AQP1过表达有效地诱导了该细胞系中气泡的形成(图5f)，进一步证实了AQP1在不同细胞系中正向调节气泡的形成。然而，AQP1对非起泡细胞中气泡形成的诱导是否与细胞类型特异性还有待研究。

对AQP1-GFP过表达细胞和野生型HT1080细胞中气泡的动态分析显示，在气泡的扩展和稳定方面没有显著差异(图6a和b)。然而，aqp1过表达细胞的气泡收缩速度(6.2秒)比野生型细胞(10.3秒)快得多(图6c)，这使得aqp1过表达细胞的气泡寿命更短(图6d)。此外，对气泡扩张和收缩速度的跟踪显示，野生型细胞之间没有显著差异。然而，当AQP1- gfp过表达时，气泡的收缩速度明显高于膨胀速度(图6e)，这表明AQP1通过促进膜泡的收缩阶段来调节膜泡的形成。这个新发现非常有趣，因为它表明，传统的观点和信念，即气泡收缩是由肌动蛋白的再聚合和皮层-膜连接蛋白的募集介导的，可能并不总是如此，因为AQP1和其他AQPs可能可以独立或协同作用，允许液体快速流出细胞泡，导致收缩。

为了阐明AQP1促进气泡收缩的机制，我们研究了Na的可能参与⁺/小时⁺泵，它与肿瘤细胞中的aqp一起呈现极化分布，调节水和离子通量穿过膜，从而促进细胞迁移[45］．通常情况下,钠⁺通过这个泵进入细胞的过程中，预计会伴随着通过AQP1的强制性水的流入，这可能会导致细胞质压力的增加，从而驱动气泡的膨胀。令人惊讶的是，目前的研究发现了Na的需求⁺/小时⁺泵在aqp1促进气泡收缩，作为Na的封锁⁺在HT1080和ACHN细胞系中，通过抑制其已知抑制剂EIPA的反转运蛋白活性，完全阻止了泡缩和新泡的形成(图7a和b)。细胞只发现扩张，长达90分钟(最大前孵育时间)，没有任何可见的泡缩。因此，我们提出Na⁺/小时⁺-介导的胞外酸中毒可能通过质膜酸感应离子通道(ASICs)激活酸信号，刺激水从膨胀的泡中快速流出，从而通过AQP1水通道促进泡的收缩。然而，需要进一步的研究来确定Na的具体亚型⁺/小时⁺需要明确描述这种泵是如何帮助aqp1促进的泡泡收缩的细胞内碱化和细胞外酸中毒。

总之，我们的数据首次证明了AQP1在HT1080和ACHN细胞中调节膜泡形成的新作用。具体来说，我们已经证明AQP1通过一种需要Na的机制加速了细胞泡的收缩阶段⁺/小时⁺泵的活动。由于不同的癌细胞利用质膜泡通过细胞外基质传播，AQP1在抑制癌症转移方面提供了一个潜在的治疗靶点。

确认

作者感谢Matthew connor博士(英国谢菲尔德哈勒姆大学)提供gfp标记的AQP1, Sam Boateng博士和Mike Fry博士(英国雷丁大学)提供的建议，以及Henry Collins-Hooper博士(英国雷丁大学)在显微镜检查方面的帮助。

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