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收到日期：2017年11月22日
接受日期：2017年12月22日
发布日期：2017年12月26日
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©2017 Shiba Y.这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名许可协议的条款发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。
引文
Shiba Y，（2017）Arfgaps;耗尽或过度表达？RES Rev Insights 1：DOI：10.15761 / RRI.1000123
日本岩手大学理工科学院胞内交通实验室
DOI：10.15761 / RRI.1000123
ARF蛋白是小GTP结合蛋白，其调节细胞内交通，肌动蛋白重塑和脂质代谢。在GTP结合状态下，ARF被认为是可以与细胞膜和许多效应器结合的活性形式。在GDP键的状态下的ARF被认为是一种无活性形式并释放到细胞溶胶。ARF GTP酶激活蛋白质（ARFGAPS）水解ARF•GTP到ARF·GTP。因为间隙“失活”小GTP酶，所以差距的研究通常通过关注过表达的生物后果的空白的过度表达来完成。然而，关于Copi涂覆的囊泡形成中的ArfGAP1的数十年已经导致分子模型，Arfgap1在货物分类的保真度中起作用。该模型意味着删除实验将适当地分析Arfgap家族蛋白的功能，而不是过度表达。在这里，我简要描述了Arfgap1在Copi涂覆囊泡形成中的作用，并讨论了Arfgaps耗尽的生物学后果。
ADP-核糖基化因子（ARF）;ARF GTPase-活化蛋白（ARFGAP）;小GTP酶，COPI，Clathrin，排序
在哺乳动物细胞中，细胞内交通在调节细胞功能方面发挥着重要作用。当细胞内的交通受损时，细胞内蛋白质和脂质都会出现错误的目的地，这导致细胞器功能障碍通常与癌症的人类疾病相关，包括癌症[1]，神经变性障碍[2]，糖尿病[1]和免疫紊乱[2]。因此，了解细胞内交通的机制具有对理解人类疾病的主要重要性，以及细胞的生物学功能。
在内质网（ER）中合成分泌蛋白，跨膜蛋白和溶酶体酶，然后将其转运到GOLGI装置。在Golgi中，它们通过糖基化或其他修饰来修饰，然后将其分化为其目的地，包括溶酶体，分泌颗粒和质膜。另一方面，细胞还从外部内化蛋白质。这些内吞蛋白被运输到早期的胚胎，然后将其分类到其目的地，包括溶酶体通过溶酶体消化蛋白质的溶酶体。这些运输过程由通常涂覆的外壳蛋白涂覆的运输囊泡介导。外套蛋白质，COPI，COPII和Clathrin有三种主要类。Copii涂层囊泡介导ER-GOLGI运输，COPI涂层囊泡在GOLGI堆叠之间介导，或从GOLGI到ER运输，并克拉肽涂层囊泡介导后GOLGI交通和内吞作用[3]。这些涂层蛋白可以与“货物”蛋白质结合，将包装成涂覆的囊泡。因此，已经认为货物和外套蛋白质之间的结合介导货物分选，该方法选择合适的尸体进入涂覆的囊泡。
ARF / SAR Family GTP结合蛋白是募集外壳膜的必需蛋白质，以细胞器膜[4,5]。哺乳动物细胞具有6个ARFS，ARF1至ARF6。人类缺乏ARF2，因此人类有5个ARF。SAR1是这个家庭中唯一的蛋白质。其GTP结合状态下的ARF主要被认为是活性形式，并通过其肌细胞酰化的N-末端区域[5]以及包括涂层蛋白的各种ARF效应器[5,6]。其GDP结合状态下的ARF是无活性形式，并且存在于细胞溶胶中。ARF上的GTP和GDP结合状态受ARF鸟嘌呤核苷酸交换因子（ArfGeFS）和ARF GTP酶活化蛋白（ARFGAPS）的调节（图1）。arfgefs介导ARF•GDP转换为ARF•GTP [7]，而Arfgaps水解ARF•GTP进入ARF•GDP和从膜中释放ARF到细胞溶质[8]。在传统模型中，ARFGAPS终止ARF信号传导，因此已经认为ARFGAPS抑制囊泡形成。然而，数十年的研究导致了ARFGAPS是实际确定涂层与其特定货物蛋白质之间的相互作用的关键因素，这是囊泡形成完成前的货物分类的关键步骤。 Because ArfGAPs had been thought to be negative regulators of Arf, overexpression of ArfGAPs might had been thought to be the appropriate approach to inhibit Arf and investigate the phenotype of inhibition of transport. However, the decades of research have shown that ArfGAP1 play a role in fidelity of cargo sorting, and that implicates the downregulation of ArfGAPs as an appropriate approach to investigate the biological function of ArfGAPs.
图1。ARF调节的分子开关模型。ARF·GTP由ARF鸟嘌呤核苷酸交换因子（ARFGEF）转换，ARF•GTP通过ARF GTP酶活化蛋白（ARFGAPS）水解。在此模型中，ARFGAPS在停用ARF•GTP中发挥作用。
Arfgaps如何参与Copi囊泡形成一直是争议的主题[9-11]。Coatomer是用于在GOLGI装置的COPI涂覆的囊泡的外套蛋白质，并通过ARF募集到高尔基膜•GTP。在传统模型中，涂层聚物与货物结合，然后聚合成COPI以使膜产生COPI涂覆的囊泡[12]。在该模型中，ARF•GTP留在COPI囊泡中，预测ARF的水解•GTP在CPOI涂覆的囊泡中形成以与囊泡一起释放ARF。在该模型中，预计ARFGAPS将参与未涂层。然而，已经报道了ARF的水解•实际上是碳掺入到COPI涂覆的囊泡中所需的[13-16]。通过添加GTPs，GTP的不可水解模拟，或通过注入不能水解GTP的ARF1Q71L突变体，抑制了碳掺入至COPI囊泡。随着思想在完成囊泡形成之前发生货物分类，这些数据预测了在形成Copi涂覆的囊泡之前需要ARF的GTP水解。
在本综述中，我不会描述已经开发了Copi涂层囊泡形成的分子模型的细节。相反，读者可以在其他地方找到它[17]。我刚介绍了我为ArfGap1提出的模型（图2）;Coatomer通过ARF募集到高尔基膜•GTP和COPI与其货物结合。在COPI和货物的存在下，ARFGAP1的间隙活性增加和水解ARF•GTP [18]。ARF•GDP从膜中释放，ARFGAP1促进COPI的聚合以产生COPI涂覆的囊泡[19]。在该模型中，需要GTP水解来确定COPI和其特定货物之间的相互作用是否正在发生（图2步骤4和5）。GTP水解是未涂覆的先决条件，但与传统模型相比，在我们的模型中，在我们的模型中进行了GTP水解，在货物与涂布器结合的步骤中进行。该模型预测COPI在GTP水解后残留在ARF上。存在具有实验数据，即ARF1的膜解离率比活细胞中的涂布器更快的快速[20]，表明在GTP水解对ARF1上的膜上残留在膜上。 Furthermore, recent studies involving structural analyses have suggested that the binding site of -COP to Arf1•GTP might be transmitted to KDEL cargo receptor after GTP hydrolysis on Arf1 [21]. These studies support the model by which GTP hydrolysis on Arf is related to cargo sorting.
图2。COPI涂层囊泡形成模型。Arfgap1在涂布器结合其货物时介导GTP水解。在该模型中，如果外套和货物的耦合是正确的，则Arfgap1在传感器中起作用。
我们的模型意味着ARF1和ARFGAP1更像传感器，例如EF-TU，一种控制核糖体上蛋白质翻译的细菌翻译GTP酶，而不是作为RAS蛋白如RAS蛋白的分子开关[22,23]。在EF-TU的情况下，mRNA-Codon和TRNA-Antinodon之间的正确配对导致核糖体的结构变化，以在EF-TU上激活GTP水解。然后预期从核糖体中解离核糖体和进一步的结构变化，以便将氨基酰基TRNA的容纳到肽基转移酶中心中。Codon-Antecon配对的保真度需要在EF-TU上进行GTP水解，而不是需要GTP结合的EF-TU的信号所需的保真度。ARF1 / ARFGAP1在COPI涂层囊泡形成中的作用可能相当于EF-TU，这提出了许多问题;Coatomer是否与ARFGAP1作为ARF1的间隙发挥作用，作为核糖体的类比作为EF-TU的间隙？如果是这样，货物是否会诱导涂层器的结构变化以激活Arfgap1的间隙活性？在ARFGAP1的ARF1上的GTP水解后对涂层物的影响是什么？这些问题的答案仍然难以捉摸。将来需要大量的生化和结构分析。
我描述了ARF1 / ARFGAP1在COPI涂层囊泡形成中发挥货物排序的保真品作用的假设。它也适用于其他运输途径吗？关于COPII和Clathrin / AP-1涂层囊泡的报告符合该假设。Forster等人。分析了SAR1P的膜周转率，COPII募集到ER膜所需的GTP结合蛋白，以及SEC23P / SEC24P，COPII涂层的亚基和SAR1P的间隙，在生物细胞的ER出口位点[24]。SAR1P的周转率比SEC23P / 24P更快。减少分泌货物量减缓了SAR1P的营业额，并加快了SEC23 / 24P的营业额。他们得出结论，在SAR1P上的GTP水解后，Copii综合体仍然在ER膜上，并且货物的存在在ER膜上的SAR1P保持比SAR1P更多的COPII。结果与在完成Copii涂覆的囊泡形成之前发生货物分类的GTP水解的想法一致。
AP-1是由Arf•GTP招募到高尔基/内体膜的网格蛋白适配器复合物。Zhu等人的生化分析表明，在1M Tris提取[25]后，更多的AP-1保留在高尔基膜上，没有其载物。当分泌量减少时，COPII的周转更加迅速，AP-1的结果似乎与COPII相反。然而，即使在细胞中通常不存在GTP的情况下，1M Tris也能提取AP-1。他们提出AP-1与高尔基膜结合有两种状态;其中一种状态与高尔基膜有很高的亲和力，1M Tris无法提取。这种状态发生在GTPS存在时。另一方面，另一种状态亲和力低，可以通过1M Tris进行生物化学提取。然而，在细胞中，在GTP存在的情况下，AP-1的这种低亲和力状态也应该在细胞膜上。即使在GTP存在的情况下，耗尽AP-1的货物仍能保持AP-1与高尔基膜的高亲和状态。 They suggested that the affinity state of AP-1 is changed from high to low by GTP hydrolysis in the presence of cargo. In the absence of cargo, the change in the affinity state of AP-1 does not occur. Therefore AP-1 is retained in the high affinity binding state on the Golgi membrane. The low affinity state of AP-1 could be equivalent to the membrane-bound Sec23/24p after GTP hydrolysis of Sar1p. These reports imply that structural change of coat proteins could occur after GTP hydrolysis, and coat proteins are retained on organelle membrane for further vesicle formation, which suggests that the molecular model of COPI coated vesicle formation could apply to other transport pathways.
Arfgaps家族在人类中有31个基因[26]。他们怎么能分析？在传统模型中，ARFGAPS函数作为ARF信令的终结器，并且可以认为ARFGAPS应该过表达以水解更多ARF•GTP以抑制细胞内交通，然后分析它们的表型。实际上，在Rab蛋白的情况下，还有其他小GTP结合蛋白，并且兔子的研究通常通过兔的过表达进行了[27-30]。但这是分析Arfgaps的正确方法吗？
发现GCS1，酵母Arfgap1同源物是ARF功能损失的抑制因子[31]。作者表明GCS1的生物学作用是ARF的下游效应器，而不是下降调节器。在哺乳动物细胞中，ARFGAP1的过表达产生更多的囊泡，而不是抑制转运[19]。ACAP3的耗竭，ARF6的ARFGAP，导致神经突越来越多的抑制[32]。虽然ARF6•GTP水平耗尽ACAP3，但ARF6的shRNA也降低了神经突的出现。作为ARF6的快速循环突变体，T157A拯救了ACAP3敲低的表型，但不是ARF6，Q67L和T44N的GDP和GTP锁定突变体，MIURA等。结论是神经沸石过多需要ARF6的循环。尽管在ARF方面消耗ARFGAPS的后果•应仔细解决GTP水平，但累积证据显示[33-40]表明ARFGAPS能够积极调节生物过程。
siRNA筛选arfgap，但不过度表达，已用于分析细胞内交通。通过6个arfgap的sirna的筛选，确定AGAP2是志贺毒素B亚基(STxB)从早期核内体运输到高尔基体[41]的正调控因子。通过对25个arf缝隙sirna的筛选，确定ArfGAP3是甘露糖6-磷酸受体(MPR)从早期核内体向晚期核内体[42]运输所必需的。在这种情况下，ArfGAP3的GAP活性被发现是MPR运输所必需的，组织蛋白酶D脉冲追逐实验证实了ArfGAP3耗尽抑制了MPR运输。人们可能仍然认为arfgap的耗尽会增加细胞中的Arf•GTP水平，因此细胞内的交通应该会加速。实际上，我经常看到几个不同arfgap的耗尽导致感兴趣的传输途径的增加([41]数据未显示)。这些现象可以解释为细胞中Arf•GTP水平普遍升高。但这是针对货物的吗?简单地增加Arf•GTP水平可以保持包被蛋白(如AP-1)与膜的高亲和性结合状态。但是有可能制造囊泡吗? Let’s consider the AP-1 pathway. If the particular ArfGAP that regulates the AP-1 pathway is depleted, AP-1 might not be transmitted from the high affinity binding state to the low affinity binding state, which may result in the inhibition of transport. AP-1 remaining on the membrane could be released by other ArfGAPs slowly that are not specific to AP-1 and its cargo, as there are 31 genes of ArfGAPs in human. These possibilities need to be addressed in each coat and ArfGAPs; however, the molecular model in which ArfGAP1 plays a role in fidelity of cargo sorting suggests that depletion experiments should be considered to be appropriate for analyses of other ArfGAPs, rather than overexpression.
最近Shin Jhh等人。据报道，其中一个rabGaps TBC1D23，在GOLGI下与Golgin-97/245结合，并与内体衍生的囊泡的洗涤复合物连接[43]。TBC1D23缺乏精氨酸和谷氨酰胺残留物，对于Rabgap活性是必不可少的。它们使用CRISPR-CAS9系统在Hela细胞中产生TBC1D23的空突变体。他们建议TBC1D23在囊泡融合到目标细胞器的特异性中起作用。这项工作意味着通常应该考虑耗尽实验来分析小GTP酶的间隙的作用。
谢谢Paul Langman，Ph.D.有助于使用科学英语。
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Shiba Y，（2017）Arfgaps;耗尽或过度表达？RES Rev Insights 1：DOI：10.15761 / RRI.1000123
图1。ARF调节的分子开关模型。ARF·GTP由ARF鸟嘌呤核苷酸交换因子（ARFGEF）转换，ARF•GTP通过ARF GTP酶活化蛋白（ARFGAPS）水解。在此模型中，ARFGAPS在停用ARF•GTP中发挥作用。
图2。COPI涂层囊泡形成模型。Arfgap1在涂布器结合其货物时介导GTP水解。在该模型中，如果外套和货物的耦合是正确的，则Arfgap1在传感器中起作用。
