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摘要

表观遗传细胞改变是一种环境诱导的表观遗传，可导致肿瘤的发生。因此，我们认为，在尼日利亚等面临严重环境挑战的地区，其评估具有极其重要的意义。取24例乳腺良性肿瘤患者、25例乳腺恶性肿瘤患者和50例健康对照者空腹血进行游离DNA提取。对DNA进行表观基因组学测试，使用酶联免疫分析法(比色法)确定甲基化模式(Epigentek USA)。肿瘤与去甲基化(脱氧核糖核酸低甲基化和脱氧核糖核酸未甲基化)之间存在显著相关性(X2= P=0.000);肿瘤与高甲基化之间也存在显著相关性(X2= P=0.014)。在50例明显健康的对照组中，多达10例(20%)被去甲基化。在乳腺恶性肿瘤晚期观察到异常DNA甲基化表达增加。表观基因组细胞改变被认为是影响乳腺肿瘤发生的一个重要危险因素，并且在该位点显著增加。因此，作为一种异常的基因组发育，在明显健康的受试者中检测到它是一种内在基因组改变的指标，如果没有发生肿瘤，则可作为肿瘤微环境发育的标志，从而可以比乳房物理检查更早发现肿瘤发生。

关键字

DNA甲基化模式，乳腺肿瘤，健康受试者，表观遗传细胞改变，肿瘤发生

简介

表观遗传学是指基因组在功能上的相关修饰，而不涉及核苷酸序列的改变。这些修饰包括调节基因组转录的化学标记[1,2]。现在有证据表明，环境事件可以直接改变基因组的表观遗传状态。因此，对啮齿动物模型的研究表明，在早期发育和成年时期，环境信号可以激活细胞内通路，直接重塑“表观基因组”，导致基因表达和神经功能的变化。这些研究为环境信号和基因组在调节个体行为、认知和生理差异方面的相互作用奠定了生物学基础。这使得表观遗传学的研究在环境挑战突出的领域非常重要。

乳腺肿瘤可以分为具有遗传风险因素的两类，一种是父母遗传给后代的种系突变，另一种是没有遗传易感性，但在一生中遇到表观突变的肿瘤。前者仅占乳腺癌总病例的10%左右，后者则占乳腺癌总病例的90%以上[3]。大多数乳腺癌是散发性的，原因更复杂，如有丝分裂信号通路的激活和肿瘤抑制因子表达的表观遗传学缺失等，[4]。

DNA甲基化是表观遗传机制的一种，涉及到甲基基添加到未修饰的DNA上，它被描述为由环境影响引起的表观遗传变化，因为它是DNA的化学修饰，而不是由DNA突变[5]带来的变化。正常的DNA甲基化会标记DNA，并能启动或关闭基因。因此，如果肿瘤抑制基因的表观基因组改变持续存在，该基因的表达可能被改变，细胞可能失去DNA指令的正常解释模式。已经很好地证明，全球DNA甲基化(去甲基化)的减少是癌症[6]最重要的特征之一。正常DNA甲基化的改变可导致非甲基化、低甲基化和高甲基化[7]。因此，肿瘤细胞和正常细胞中5-mC含量或全局甲基化的定量分析为乳腺肿瘤的检测和分析及其发病提供了非常有用的信息。

癌症研究人员所使用的环境因素，指的是任何非遗传的原因。因此，环境一词不仅指空气、水和土壤，还指家庭和工作场所的物质和条件，包括饮食、吸烟、酒精、毒品、接触化学品、阳光、电离辐射、电磁场、传染因子等。生活方式、经济和行为因素都是我们环境的方方面面。”因此，如果这些环境刺激持续存在于一个明显健康的个体的生活中，那么即使在明显健康的个体中，正常的表观基因组过程也可能因任何异常的DNA甲基化模式[5]的表达而受到干扰，这是至关重要的，因此可能对高度污染环境中的个体构成严重的表观遗传和临床特征。因此，我们提出，这种异常表达可以作为伴随变化的指标，伴随伴随变化的异常。阿南布拉州高度工业化。环境污染和水资源污染正在成为阿南布拉州部分地区的共同威胁[9]。由于工业设施和人类日常活动的不断增加，每天都有物理、化学和生物物质被排放到地下和地表水环境中。这可能造成人力、物质和财政资源的损失。每年都有大量的这些污染物/污染物通过自然和人类活动产生，例如工业活动、农业生产、废物处理系统、土壤和沟壑侵蚀[9]。 No safe disposal environments have yet been found for waste products that have long half-lives. High-level, medium-level and low-level waste in solid, liquid and gaseous forms are released into the environment of Anambra state at discrete intervals or at a continuous basis. They may have short or long half-lives in the environment, the consequences are health hazards [9,10]. Because of improper handling and disposal of the harmful wastes materials, we are worried about the health implications and possible influences on epigenetic Mechanisms. Thus the need to access the epigenetic status of even supposed healthy individuals. Air and water pollutions are on the fastest increase in the area [10,11].

乳腺癌是世界范围内最常见的女性癌症。在尼日利亚的其他癌症病例中，它是妇女死亡的主要原因[13]。在过去的几十年里，对乳腺癌生物学的了解已经取得了巨大的进展，然而，乳腺癌的生长和进展伴随着侵袭性和转移性表型的获得和治疗耐药性的机制仍然没有完全了解[14,15]。关键是要了解这些散发性乳腺癌是如何以及为什么发生和发展的，以便制定针对这一毁灭性疾病的预防策略，而不是依靠以治疗为名的乳房切除。

DNA甲基化在炎症基因调控中起重要作用。基因启动子区域的高甲基化通常与转录沉默相关，而低甲基化则阻碍基因[16]的表达。有了其他研究人员发现的环境污染的证据，我们决定在该地区患有乳腺癌的受试者和看起来健康的受试者中检查DNA甲基化不同模式的状态。本研究中提到的环境污染物表明，如果不避免这些污染物的存在，可能会继续促进毒素、微生物抗原、农药残留和其他生物和化学有害物质在系统中的持久性，这可能会扰乱正常的表观基因组过程。

材料和方法

受试者被分成三组。他们包括24例良性乳腺肿瘤女性受试者(良性受试者)，25例恶性乳腺肿瘤女性受试者(癌症受试者)和50例无乳腺肿瘤女性受试者(对照受试者)。良恶性乳腺肿瘤受试者在阿南布拉州Nnamdi Azikiwe大学Nnewi教学医院(NAUTH)的外科诊所就诊。50名健康女性对照者经医生证实无乳腺肿瘤。乳腺肿瘤的诊断主要通过活检组织病理检查和癌相关抗原15-3 (ca15 -3)检测。根据美国癌症联合委员会(TNM分类)进行癌症分期。在研究之前，所有受试者都没有接受过乳腺肿瘤化疗或手术。所有受试者都进行了临床和生化筛选，以排除人类免疫缺陷病毒。该研究获得了Nnamdi Azikiwe大学教学医院伦理委员会的批准，编号为NAUTH/CS/66/vol.6/026。受试者在参与研究前获得知情同意。 All the subjects were administered questionnaire to obtain medical history and demographic information.

入选标准

患有良性或恶性乳腺肿瘤但未接受化疗和乳腺手术的女性受试者。无肿瘤且未服用细胞毒性药物或任何抗免疫治疗(如自身免疫性疾病)的女性受试者。

排除标准

免疫缺陷患者或HIV感染患者，未患癌症但服用细胞毒性药物的女性受试者。

样本采集

通过静脉穿刺从所有参与者中充分抽取高达5ml的空腹血液样本。充分的血液样本采集标准被认为适合本研究中需要检测的各种参数。血液样本被放入普通真空管中。血液样本在室温下凝结30分钟。在室温下离心(Sorvall RC5C HS-4转子在1500 x g下离心15分钟)去除收缩的凝块，仔细分离形成的血清并放入另一管中。立即从血清中提取DNA，并在-20℃下保存^°C，并在储存一周内进行分析。

方法

血清DNA[18]的提取

过程:该过程由制造商(Epigentek，美国)描述。简单地说，在消化粉中加入1 ml消化液。管子被旋动，直到溶液清澈为止。先取500μl的DNA分离缓冲液，然后在500μl的血清样品中加入20μl的混合溶液(消化液/消化粉)，混匀。混合物在65°C孵育10分钟。同时，将旋转柱放入2ml的收集管中。将最大500μl的混合物转移到柱中，以12,000转/分离心30秒。丢弃通过的流体，将色谱柱更换到收集管中，将剩余的混合液转移到色谱柱中，再次以12,000转/分离心30秒。通过的流量再次被丢弃，柱更换到收集管。

在旋转柱中加入300μl的70%乙醇，以12000转/分钟(rpm)的转速离心20秒。通过的流量被丢弃，柱更换到收集管。在柱中加入200μl的90%乙醇，以12,000转/分离心20秒。通过的流量被丢弃，柱更换到收集管。另加200μl 90%乙醇，以12000 rpm离心40秒。现在将色谱柱放入一个新的1.5ml小瓶中，将100μl DNA洗脱液直接加入柱过滤器中，以12,000 rpm离心20秒洗脱DNA。DNA现在已经可以使用了。洗脱后的DNA保存在-20°C直到使用。

甲基化DNA定量(比色法)[18]

试验过程:该程序是由制造商(Epigentek，美国)指导的

DNA结合:每孔加入80微升(80μl)的结合液进行DNA结合。再加阴性对照1μl，稀释阳性对照1μl，取分离DNA样品20 μl (100ng)。通过在实验台上摇晃几次平板来混合溶液，确保溶液均匀地覆盖井底。用板封覆盖条形板，37°C孵育90分钟。从每个孔中取出结合反应液，用150μl稀释的洗涤缓冲液洗涤三次。

甲基化DNA截图:捕获抗体以1:1000稀释)与稀释的洗涤缓冲液。每孔加50μl捕获抗体稀释液，盖上盖子，室温孵育60 min。60 min后，从每孔中取出捕获抗体稀释液。用150μl稀释缓冲液冲洗三次。用稀释后的洗涤液以1:2000稀释检测抗体)，然后每孔加50μl稀释后的检测抗体，盖上盖子室温孵育30分钟，取稀释后的检测抗体液出孔，用150μl稀释后的洗涤液冲洗4次。用稀释的洗涤液以1:5000稀释增强剂溶液。每孔加50μl稀释增强剂溶液。盖好孔，在室温下孵育30分钟。每孔取稀释的增强剂溶液，用150μl稀释的洗涤缓冲液洗涤5次。

信号检测:每孔加100μl显影液，室温避光孵育10分钟。对样品井和对照井的颜色变化进行监测。阳性对照孔颜色变为中蓝色时，每孔加100μl停止液停止酶反应。将溶液轻轻摇动在长凳上的框架，等待2分钟，使颜色反应完全停止。加入停止溶液后颜色变为黄色，在450nm波长下2 ~ 15min内用微板读取吸光度。

5-mC (DNA甲基化发生的胞嘧啶环的5碳)的计算和相对关系

量化。为了确定两个不同DNA样品的相对甲基化状态，使用以下公式计算5-mC占总DNA的百分比(Jin et al.， 2010)。

5-mC% =(样品OD -ME3 OD)÷100 X 100

ME4OD -ME3OD × 2 ÷ 5

2*:是阳性对照中5-mC归一化为100%的因子，因为阳性对照中只有50%的5-mC。

S=输入样品DNA在ng中的量= 100ng

P= ng中正控制的输入量= 5ng

阳性对照是含有50% 5-甲基胞嘧啶的甲基化多核苷酸

阴性对照是含有50%胞嘧啶的未甲基化多核苷酸

结果

乳腺肿瘤受试者和对照组DNA甲基化的模式

检测了24例良性肿瘤患者、25例恶性肿瘤患者和50例对照组患者的DNA甲基化模式。乳腺良性肿瘤患者DNA低甲基化发生率7(29.2%);恶性乳腺肿瘤12例(48%)，对照组5例(10%)，差异有统计学意义P=0.000。乳腺良性肿瘤2组(8.3%)和恶性肿瘤4组(16%)的DNA高甲基化发生率有统计学意义P=0.014。良性乳腺肿瘤中未甲基化DNA的发生9例(37.5%);恶性乳腺肿瘤8例(32%)，对照组5例(10%)，差异有统计学意义P=0.000。在良性乳腺肿瘤受试者中检测到正常的甲基化DNA 6(25%);恶性乳腺肿瘤1例(4%)，对照组40例(80%)，差异有统计学意义P=0.000(表1)。

表1。乳腺肿瘤患者和对照组DNA甲基化的模式

	良性的 N = 24	恶性 N = 25	控制 N = 50	假定值
Hypomethylated	7 (29.2%)	12 (48%)	5 (10%)	0.000
Unmethylated	9 (37.5%)	8 (38%)	5 (10%)	0.000
超甲基化	2 (8%)	4 (16%)	0 (0%)	0.014
正常的甲基化	6 (25%)	1 (4%)	40 (80%)	0.000

肿瘤和去甲基化(低甲基化DNA和未甲基化DNA)之间的显著关联(X²= P = 0.000);肿瘤与高甲基化之间存在显著相关性(X²= P = 0.014);健康对照组与正常甲基化之间存在显著相关性(X²= P = 0.000)。P值有统计学意义P=<0.05

在恶性肿瘤受试者中，低甲基化发生率为12(48%);4甲基化(16%);未甲基化8例(38%)和正常甲基化1例(4%)，差异显著P=0.000。在良性肿瘤受试者中，低甲基化发生率为7(29.2%);甲基2 (8%);未甲基化8(37.5%)和正常甲基化6(25%)，差异显著P=0.000。此外，在对照组中，低甲基化的发生率5(10%);未甲基化5(10%)和正常甲基化40(80%)，差异显著P=0.000。对照组未检测到DNA甲基化移位的高甲基化模式(表1)。

表2。恶性乳腺肿瘤患者的分期及其DNA甲基化模式

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	阶段2 b N = 5	阶段3 b N = 9	Stage3c N = 7	Stage4 N = 4
Hypomethylated	1 (20%)	6 (66%)	4 (57%)	1 (25%)
Unmethylated	3 (60%)	1 (11%)	2 (28%)	2 (50%)
正常的甲基化	1 (20%)	0	0	0
Hypermethylated	0	2 (22%)	1 (14%)	1 (26%)

乳腺恶性肿瘤分期DNA甲基化衰减表达增加

恶性乳腺肿瘤患者的分期及其DNA甲基化模式

恶性肿瘤分期根据美国癌症联合委员会(2010)进行。25例恶性肿瘤患者中5例(20%)处于2b期，9例(36%)处于3b期，7例(28%)处于3c期，4例(16%)处于4期。2b期5例受试者中，1例(20%)检测到DNA低甲基化，3例(60%)检测到DNA未甲基化，1例(20%)检测到DNA正常甲基化，0例(0%)检测到DNA高甲基化。在3b期的9例受试者中，6例(66.7%)检测到DNA低甲基化，1例(11.1%)检测到DNA未甲基化，0例(0%)检测到DNA正常甲基化，2例(22.2%)检测到DNA高甲基化。在3c期7例患者中，检测到DNA低甲基化4例(57.1%)，未甲基化2例(28.6%)，正常甲基化0例(0%)，高甲基化1例(14.3%)。在4期的4例受试者中，1例(25%)检测到DNA低甲基化，2例(50%)检测到DNA未甲基化，0例(0%)检测到DNA正常甲基化，1例(25%)检测到DNA高甲基化(表2)。

讨论

本研究探讨了在乳腺良性肿瘤、恶性肿瘤和健康女性受试者中甲基化模式的全球DNA甲基化特征。这项研究表明，75% - 96%的乳腺肿瘤/癌症可能在个体的一生中发生，并可归因于表观遗传细胞的改变。约75%的良性肿瘤患者存在表观基因组畸变或不规则(DNA甲基化)，而96%的恶性肿瘤患者存在表观基因组畸变。这与报告一致，只有5-10%的癌症是由于遗传自父母的基因异常，约90-95%的病例归因于表观遗传因素，一般生活的“磨损”[3]。DNA甲基化在发育过程中至关重要，异常的DNA甲基化，包括高甲基化和去甲基化，都与衰老、癌症和其他疾病有关。因此，研究DNA甲基化的方法是生物学研究的重要工具。DNA甲基化转移似乎是乳腺肿瘤发生过程中一个重要的表观遗传事件，通过使用全局甲基化分析，有可能识别这些标记物，用于乳腺癌的诊断和治疗目的。

肿瘤节点转移(TNM)是一种衡量癌症分期的指标，已被用于衡量癌症的扩散和预后[20]，是临床常用的方法。分期从0到IV, 0期为原位癌，I期为早期浸润性癌，IV期为最晚期。体积较大、淋巴结扩散、转移的肿瘤分期较多，预后较差。0期是癌前病变或标记性病变，可以是导管原位癌(DCIS)或小叶原位癌(LCIS)。1-3期发生在乳腺或区域淋巴结内。4期是“转移性”癌症，预后较差[20]。在此基础上，本研究揭示了乳腺癌的4个不同阶段，即2b、3b、3c和4。这表明，大多数乳腺癌病例在早期阶段没有接受治疗。恶性乳腺肿瘤患者中去甲基化的普遍性质可能是淋巴结扩散和进展的证据来源，因为在3b、3c和2b阶段发现了更多的低甲基化/未甲基化。因此，就表观遗传细胞改变所表现出的生理变化而言，该地区乳腺癌最关键的阶段似乎是3b和3c阶段。

癌细胞中的DNA甲基化变化包括正常甲基化序列的甲基化丢失(低甲基化)和通常未甲基化(高甲基化)[22]位点的甲基化序列的增加。在本研究中，正常的DNA甲基化在乳腺肿瘤受试者中表现较低，而在恶性和良性乳腺肿瘤受试者中，低甲基化、非甲基化和高甲基化等DNA甲基化转移显著较高。Szyf, 2012年报道，在脊椎动物中，几乎每个CpG位点都被甲基化[23]，除了那些发生转录的CpG岛，特别是在人类基因组中，近80%的CpG位点被甲基化．然而，在癌细胞中，表观遗传图谱经常发生戏剧性和相反的变化，这些变化包括DNA的全局低甲基化和CpG岛相关启动子的局部高甲基化。值得注意的是，高甲基化的表现可能不是CpG岛相关启动子区域所特有的，因为这项工作使用全局甲基化试验揭示了乳腺肿瘤受试者中高水平的低甲基化和低水平的高甲基化。更早的时候，Tan等人的工作。[24]虽然是胰腺癌，但使用全局甲基化谱分析检测到了高甲基化和低甲基化。

特别是在肿瘤受试者中，DNA甲基化的变化更深刻，只有4%的恶性乳腺肿瘤和25%的良性乳腺肿瘤受试者具有正常的DNA甲基化，而对照组有80%的DNA甲基化正常。良性和恶性肿瘤患者(66.6%)和恶性肿瘤患者(80%)普遍存在去甲基化(未甲基化和低甲基化)，恶性和良性肿瘤患者无甲基化发生，值得关注。

DNA低甲基化可引起休眠重复元件的不良激活，并导致相关基因的表达改变。DNA低甲基化可导致基因组不稳定，并可能导致突变和染色体重组[22]。DNA去甲基化在癌症中起着重要的作用，它通过激活前转移基因的表达，比如肝素酶基因，MMP2(它编码基质金属蛋白酶-2)和uPA(编码尿激酶纤溶酶原激活物)[23]。去甲基化在癌症转移中的因果作用是由以下事实支持的:用去甲基化剂治疗非转移性乳腺癌细胞可增加其侵袭性[25]，而用逆转非甲基化剂治疗侵袭性乳腺癌和肝癌细胞系可抑制侵袭性和转移性[26]。

在本研究中发现，DNA低甲基化是一个逐渐发展的过程，从少数健康受试者到更多的肿瘤/癌症受试者。早前有报道称，任何细胞的表观遗传特征都提供了有关其细胞状态、发育潜力和整体健康状况的宝贵信息。在本研究中，在健康受试者中检测到甲基化转移被认为是DNA甲基化可能是女性乳腺肿瘤发展的早期指标。考虑到这样一个事实，当乳房物理检查发现乳房肿块时，血清检测甲基化状态，最重要的是去甲基化(未甲基化或低甲基化)可以在肿块出现之前提供更早的警报。然而，值得注意的是，这可能是由于其他形式的肿瘤发展。异常甲基化可以在肿瘤发展的早期就开始，并介导癌症发展中的大多数重要途径异常，包括细胞周期控制的丧失、转录因子功能的改变、受体功能的改变、正常细胞-细胞和细胞-基质相互作用的中断、信号转导通路的失活、凋亡信号的丢失和遗传不稳定性[28]。因此，在本研究中使用循环DNA (cfDNA)或液体活检可能会增加早期肿瘤检测的重要性，从而增加早期DNA甲基化畸变检测的价值，因为只有当肿瘤必须发展为[29]时才可能使用固体活检。Guo等人使用甲基化单倍型，证明了59例肺癌或结直肠癌患者循环无细胞DNA中肿瘤负荷和起源组织定位的定量估计。因此，我们报告血液检测可以用于早期肿瘤，甚至在肿瘤发展之前就可以检测到肿瘤前基因组畸变。循环肿瘤DNA (CtDNA)可以通过存在与肿瘤中发现的基因组畸变相对应的基因组畸变来区别于健康细胞的循环DNA，如肿瘤特异性突变或甲基化[31]。

全球DNA低甲基化与癌症发生早期阶段或肿瘤进展的关联将提供在临床非常有用的癌症标记物[32,33]。此外，转移基因被低甲基化激活的知识对于开发基于分子的个性化治疗方案是必要的。DNA甲基化分析高通量和高分辨率方法的最新发展将促进研究成果转化为临床应用[34]。此外，由于DNA甲基化受环境影响，在其分析中包括微生物剂和其他污染物的流行情况将是有益的，但要视地点而定。

到目前为止，对组织/个体之间DNA甲基化的精确空间分布模式的功能含义知之甚少。单个CpG二核苷酸的功能分析有助于更好地理解正常的细胞生理学、DNA甲基化的个体间变异、疾病的发病机制以及优化癌症生物标志物的鲁棒性和准确性。

结论

良性肿瘤中约75%的甲基化转移和恶性肿瘤中约96%的甲基化转移表明，在这个有文献证据的高度环境污染的地区，甲基化转移远未增加。

去甲基化(低甲基化和未甲基化)可用于肿瘤发生的早期检测，甚至比乳房物理检查更早。

DNA甲基化转移，如非甲基化和低甲基化可以发生在表面健康的受试者。

建议

采用常规实验室血液样本DNA甲基化检测(常规)，可以作为一种最新的创新方法，甚至在肿瘤形成之前就可以检测早期肿瘤发展。这样可以很好地预防癌症的发展

确认

我们要感谢南迪·阿齐基威大学教学医院化学病理学和艾滋病部门的工作人员，感谢他们在研究过程中的理解和配合

作者的贡献:Michael Chukwudi Ezeani构思了这项研究。Michael chukwidi Ezeani, Charles Chinedum Onyenekwe和Samuel Chukwuemeka Meludu设计了这项研究。Michael Chukwudi Ezeani Ujuamala Uloma Ezeani和Daniel Chukwuemeka Anyiam进行了实验并获得了数据。Michael chukwadi Ezeani, Grace Amilo, Chiemelu Dickson Emegakpor和Gabriel Chianakwanam分析了这些数据。Michael Chukwudi Ezeani和Ujuamala Uloma Ezeani撰写了手稿。所有作者编辑并批准了手稿。

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