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摘要

虽然HSV-1与面瘫有牵连很长时间了，HSV的检测和治疗并不是常规的。缺乏HSV-1如何导致面瘫的有意义的演示限制了这一领域的进展。在这里，我们证明唇部HSV-1感染的深度定义了疾病的过程，更深的皮下感染允许病毒进入面神经并导致面瘫。HSV-1皮下接种可引起棉鼠大面积面瘫Sigmodon hispidus而通过皮肤表面磨损在唇部同一区域接种的病毒则没有这种效果。沿面神经脱髓鞘(CN VII)伴有皮下HSV-1感染，并被确定为可能的潜在机制的疾病。鉴于与SARS-CoV-2感染以及SARS-CoV-2和流感疫苗相关的面瘫疫情增加，这种因果关系的证明尤其重要。

关键字

面瘫，贝尔氏麻痹，HSV-1，脱髓鞘，皮下，棉鼠

缩写

1:单纯疱疹病毒1

简介

不能确定病因的急性单侧面瘫称为[1]型贝尔氏麻痹。1972年提出的一种假说认为，HSV可能是贝尔氏麻痹[2]的大部分病例的原因。目前，大约三分之一的贝尔瘫痪病例被认为是由HSV-1[3]引起的。然而，HSV-1在引起面瘫中的作用还没有被普遍接受，因为HSV-1感染在嘴唇(最常见的途径)和面瘫之间的联系从未被最终证实。小鼠和Wistar大鼠模型表明，HSV-1接种耳廓可导致面神经麻痹[4-6]。然而，耳廓感染并不是人类感染HSV-1的常见途径，问题在于HSV-1如何以及是否会在更常见的情况下(如唇部HSV-1感染)导致面神经麻痹。因此，当患者出现面瘫时，通常不进行HSV的常规检测，评估HSV的最佳样本和检测的敏感性和特异性尚不清楚，最好的治疗方法也尚未确定。

我们最近证明，棉鼠唇部HSV-1感染，如果通过抓打唇部表面(擦伤)，会导致病毒通过三叉神经通路进入中枢神经系统(CNS)，并出现与脑干/小脑损伤(例如，头部倾斜，平衡受损)和脑干、小脑和前脑[7]多局脱髓鞘相关的症状。令人惊讶的是，在随后的研究中，我们观察到相同数量的病毒感染在嘴唇的相同区域，但传递更深(皮下)，而不是通过浅表擦伤，导致类似贝尔麻痹的发现。

材料和方法

细胞和病毒:HSV-1(17株)(由哈佛医学院的Priscilla Shaffer提供)在Vero细胞上生长，储存在-80⁰C，浓度为~10⁸空斑形成单位/毫升。病毒在感染后1小时内用pH 7.4的PBS稀释至适当浓度，冷藏保存。

动物:天生的Sigmodon hispidus（美国hispidus)棉鼠取自Sigmovir生物系统公司维持的一个种群。研究对象为四到五周大的雌雄动物。这些动物被安置在聚碳酸酯制成的大笼子里，并以标准的啮齿类食物和水为食。监测菌落对外来呼吸道病毒和其他常见啮齿动物病原体的抗体，未发现抗体。所有的研究都是在适用的法律和指导方针下进行的，并得到了Sigmovir生物系统公司机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。

动物实验:棉花大鼠用氯胺酮/xylazine麻醉，每100 g体重肌注氯胺酮50 mg和xylazine 3.3 mg的混合物。采用300 L注射器，在右唇上红唇缘皮下注射50 (50)L HSV-1液。对照组动物用相同数量的HSV-1在唇部相同部位进行磨损接种，将20µl的病毒滴于右上唇部的朱红色边缘，然后用尖头针重复磨损该部位。在感染后的不同时间，研究人员检查了动物的以下症状:头部倾斜、丧失眨眼反射、胡须触碰反应和面部不对称。用注射器向左眼和右眼吹气，记录左眼和右眼眨眼的成功或不成功。须触碰反应评估的方法是用棉花头涂抹器触摸须的左右两侧并监测抽搐。每侧评价眨眼反射和触须反应3次，观察头部倾斜和面部不对称情况。记录症状的出现和恢复情况。唾液样本用PBS浸湿的棉签采集。拭子尖端放入装有200µl PBS的试管中，液氮速冻，转移至-80ºC保存，用于后续的DNA提取。 At various times after infection, animals were sacrificed by CO₂收集窒息和样本进行病毒定量和/或基因表达分析。采集右侧三叉神经节、右侧膝状神经节及前脑、小脑、脑干各脑段，按[20]提取RNA并进行逆转录。用于组织病理学分析的脑组织浸泡在10%缓冲福尔马林中，按照前面描述的[7]切片。h&e染色的BST/桥脑和小脑对应的冠状节段变化最明显。脱髓鞘病变的存在被记录和显微摄影。

病毒滴定和PCR:TG和GG匀浆检测是否存在传染性HSV-1，方法是采用早前[7]描述的空斑分析法在Vero细胞上滴度测定匀浆。PCR法定量HSV-1，从唾液样本中提取DNA，采用以下引物qPCR法定量HSV-1聚合酶水平:正向:5 ' AGAGGGACATCCAGGACTTTGT 3 ';反向:5 ' CAGGCGCTTGTTGGTGTAC 3 '。同样的引物被用来分析TG、GG和BST制备的RNA中HSV-1 mRNA的表达，使用前面描述的[8]方法。利用Gussow et al. 2006[9]的方法对潜在转录本的表达进行量化。简而言之，隐性转录本表达量被定义为拼接后的LAT (b和b ')(引物检测内含子拼接后的转录本)与5 ' LAT外显子(a和a ')(引物检测未拼接的初级转录本或拼接后的转录本)[9]的比值。使用以下引物[9]对拼接后的LAT进行定量:正向:5 ' CAACAAAGACGCCGCGTTT 3 ';反向:5 ' CCGCTTCCGCCTCCTC 3 ';5 ' LAT外显子使用以下引物进行定量:正向:5 ' GGCTCCATCGCCTTTCCT 3 ';反向:5 ' aagggagggtactg 3 '。 Expression of myelin basic protein (MBP) in forebrain, cerebellum, and brainstem samples was quantified using the following primers: forward: 5’ ACTTCTTCAAGAACATTGTGAC 3’; reverse: 5’ CCCTTGAATCCCTTGTGAGCCG 3’.

统计分析:学生进行了比较t其次是Tukey事后测试。

结果

棉花的老鼠美国hispidus在唇部上红唇缘接种HSV-1后一周内，皮下出现面部不对称、眨眼缺陷和触须缺陷反应(图1，表1)。在雄性和雌性大鼠中发现相似，且在17-19天所有动物都恢复时是短暂的。所有缺陷均累及与感染部位同侧的右侧面部，一些动物在感染的同侧也有干眼(数据未显示)，并伴有其他症状。其中1只动物出现自发性面瘫复发。在第一次发作消退后约3周，该动物再次出现面瘫，并在一周内自行消退。样本无法确定复发是否与HSV-1再活化有关。

图1所示。唇部皮下感染HSV-1的棉鼠面瘫的研究。对照(未感染)和2只面部不对称的hsv -1感染棉鼠的面部。动物感染10⁵右上唇皮下PFU HSV-1 (s.c.)，感染后第6天拍摄(p.i.)。受感染的大鼠面部明显畸形，右上唇拉长，右脸下垂，鼻子转向左边

皮下感染与擦伤感染动物的脑组织病理学比较显示出明显的差异。擦伤感染的动物在感觉三叉神经(ST)区域(对应三叉神经核和束)有较大的病变，而皮下感染的动物在ST区域有较小的病变，但在面神经有更明显的脱髓鞘病变(图2)。虽然这里只展示了苏木素和伊红(H&E)图像，但之前的工作表明，H&E显示的脱髓鞘病变与Luxol Fast Blue染色[7]切片观察到的相似。擦伤感染动物的小脑也有损伤，但皮下感染动物的小脑没有损伤(表2)。这些结果表明，与擦伤相比，皮下注射HSV-1会影响不同的神经解剖结构，面神经脱髓鞘是针对皮下感染的。目前这项技术的局限性(每个脑干样本一个切片)使我们无法看到脱髓鞘面神经所处的所有平面，但预计其效果可能比图2所示的更为广泛。对感染后TG和GG病毒载量的分析发现，两种感染途径有重要的差异:擦伤感染的动物TG中HSV-1检测较多，而皮下感染后GG中病毒检测较多(图3A)。与擦伤感染的动物相比，皮下感染的动物GG中HSV-1溶解和潜伏转录本的表达更高(图3B)。GG中HSV-1潜伏转录本的检测与既往临床研究[10]一致。在面瘫棉鼠的唾液中也检测到HSV-1(数据未显示)，类似于对有症状的贝尔氏麻痹患者的描述[3,11-13]。感染hsv -1的棉花大鼠BST在感染后第10天检测到髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein, MBP)表达增加(参与重鞘化过程)，并在第17天消退(图3C)，这是大多数动物从面瘫中恢复的时间，提示重鞘化可能有助于面瘫的恢复。

	动物#	BST /脑桥				小脑
		圣(CN V) 病变	Inflam。	CN七世 病变		病变	病灶总数#
有限元法 上。	119845	+	+	-		+	4
	119847	+	+	-		+	3.
	119849	+	++	-		+	2
	119850	+	-	-		-	-
男性 上。	119859	+	-	-		+	1
	119862	+	+	-		+	2
	119864	+	-	-		+	3.
有限元法 南卡罗来纳州。	119901	+	+	+		-	-
	119904	+	+	-		-	-
	119918	+	+	-		-	-
	119927	-	++	+		-	-
男性 南卡罗来纳州。	119915	+	-	-		-	-
	119916	-	++	+		-	-
	119938	-	++	-		-	-
	119939	+	++	+		-	-
	119940	-	+++	-		-	-

表2。用abr感染HSV-1型棉大鼠雌性(Fem)和雄性(雄性)BST/桥脑及小脑的组织病理学改变。或者是s.c.，感染后10-11天死亡

图2。棉花大鼠唇部皮下感染HSV-1 (s.c.)或擦伤(abr.)的脑病理学。感染10⁵通过abr检测PFU HSV-1。(a,b)或s.c (c,d)。(a,c)在被abr感染的动物中，三叉神经(CN V)核和束(细箭头)对应的感觉三叉神经(ST)区可看到病变。(a)或s.c. (c).面神经(CN VII)区病变(粗箭头)仅在动物感染s.c. (c). H&E染色，20X。(b,d) ST (b)和CN VII (d)病变内纤维的不同组织。他走时污点,400 x

讨论

这些结果总体上表明，如果病毒进入皮下组织(例如，通过一个很深的皮肤切口)，急性唇部HSV-1感染可导致面瘫，而HSV-1感染(以及相关的炎症)导致的面神经脱髓鞘可能是该疾病的潜在原因。这一假设与CN V的感觉神经末梢的浅表位置和CN VII的运动神经末梢的更深的位置在嘴唇的同一区域(图4)和我们的发现是一致的，脱髓鞘沿着CN V或CN VII通路在大脑中的发现。这也与棉花大鼠唇部HSV-1疾病的症状一致，通过磨损引起的感染与脑干/小脑相关的症状(例如，头部倾斜，平衡受损)，而皮下感染导致面瘫(例如，嘴下垂，眨眼反应缺陷)，面瘫同时累及同侧脸的上下部分。HSV-1皮下感染和感染侧干眼症后不久出现的眨眼反应缺陷提示，HSV-1通过唇部颊支或颧支进入面神经后不久，可进入其他CN VII分支，包括参与眨眼反射的颞支及其支配泪、下颌下、和舌下腺(图4)。这一假设与唾液样本中HSV-1的检测和眼部症状的发展一致。也符合事实,髓鞘脱失棉花老鼠伴随着出现症状的面部麻痹,和恢复正值remyelination面神经BST。

图3。三叉神经节(TG)和膝曲神经节(GG) HSV-1及髓鞘碱性蛋白(MBP)表达变化的检测。(A) TG和GG分别于感染hsv -1后第3天和第5天(分别为D3和D5)取自感染hsv -1的动物。用空斑法定量检测Vero细胞上HSV-1病毒载量。*与未感染对照相比p<0.05。(B)在感染后14天处死动物，通过定量PCR分析TG、GG或脑干(BST)中裂解(HSV-1聚合酶)或潜伏(剪接LAT)转录本的表达。每个abr 3只动物的样本池。或s.c.组，所有反应重复进行。(C) MBP mRNA表达在脑干(BST)最大重鞘化时增加。用HSV-1皮下感染动物，于感染后第10天和第17天(pi)采集前脑(FB)、小脑(Cer)和BST，用qPCR分析MBP基因表达。*与未感染对照组相比p<0.05 (Ctrl)

图4。提出深唇HSV-1感染诱发面瘫的机制。当HSV-1通过皮肤深度切口进入唇的皮下组织，病毒到达面神经CN VII的运动神经末梢(右上图)时，就会出现面瘫。与皮下感染不同的是，唇部同一区域的浅表感染(abr.)导致HSV-1被支配唇部同一区域的三叉神经CN V(上颌支)的更浅表的感觉神经末梢感染

这种HSV-1感染模式可导致面神经麻痹的证明是朝着更好地理解面神经麻痹迈出的重要一步，因为它解决了一种新的疾病机制和面神经麻痹。在我们的研究中，年轻的棉花大鼠在皮下感染时比年老的动物更容易发生面瘫(数据未显示)。这表明，当HSV-1引起面瘫的倾向可能很高时，神经发育的窗口很窄。因此，通过嘴唇上的深切口感染HSV-1的急性感染很可能发生在naïve青少年或年轻人在亲吻/接触HSV-1阳性的个体时，当时该人正在脱落病毒。在有病毒病变的日子，超过8个日志₁₀HSV-1拷贝/ml可在受感染个体[14]的口腔黏膜中检测到。因此，在自然界中，深切口和初始高剂量的HSV-1病毒的结合是可以实现的，我们的研究似乎是在模拟它。个体一旦被这种模式感染，膝状神经节内就会携带病毒，并在应激或其他因素的条件下重新激活并重复发作。重要的是，该模型可用于测试新的治疗干预贝尔氏麻痹。目前推荐的贝尔氏麻痹的治疗方法包括皮质类固醇和抗病毒药物[15]的联合治疗。然而，在某些情况下仍可看到不完全恢复，并可能对生活质量产生负面影响。因为脱髓鞘被确认为该病的主要特征之一,由于脱髓鞘发生时患者可能会寻求医疗帮助,促进remyelination可能确保更快更完整的方法从疾病中康复。

该模型还可用于评估某些呼吸道病毒感染、疫苗和贝尔氏麻痹之间的可能联系。2000-2001年瑞士使用的鼻内灭活流感疫苗使贝尔氏麻痹的发病率增加了19倍，后来停止使用[17]。虽然美国现有的肠外灭活流感疫苗通常是非常安全的，但在接种流感疫苗的个人中也有HSV-1和HSV-2的单独报道[18-19]。已经注意到在COVID-19 SARS-CoV-2暴发期间面瘫的发生率较高。这可能是由于SARS-CoV-2(或其单个蛋白)的直接神经病变作用，或由于在COVID - 19大流行的高压环境下HSV-1的重新激活而产生的间接作用。在mRNA SARS-CoV-2疫苗试验[21]期间也报告了贝尔氏麻痹病例。虽然这些病例很少，似乎没有超过一般人群中预期的比例，但评估SARS-CoV-2、神经病变、应激、HSV-1感染/再激活和面瘫之间的相互作用仍然很重要。

作者和contributorship

EM和DL进行实验，MB构思实验设计，MB和JB用BH的输入写论文。投稿前，所有作者阅读稿件，反馈意见并通过审核。

确认

我们感谢查尔斯·史密斯、玛莎·马拉奇和安娜·里维拉对动物的帮助，感谢洛恩·凯斯特鲁科夫博士对结果的有益讨论。

资金信息

这项工作得到了NIAID基金AI091246和Sigmovir生物系统公司的部分资助。

相互竞争的利益

没有竞争利益要申报。

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