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摘要GydF4y2Ba

本文提出了一种分子方法来测量从石榴汁（PGJ），功能性发酵的Sobya（FS），富含潜在益生菌的富含潜在益生菌后，测量从健康人类成人的粪便粪便中分离的表达的表达的大小。乳杆菌或它们的组合。在三周的饮食干预之前和之后，从25个志愿者的粪便中分离出总小RNA。使用96个孔板RT评估88个miRNA基因的表达GydF4y2Ba^2.GydF4y2Bamicrorna qPCR数组。使用平行坐标图，几乎没有对基因表达(Cq)值进行分离，在控制错误发现率后，没有一个mirna显示出显著的统计表达。然而，在PCR扩增过程中产生的熔化温度谱发现了7个显著的基因(miR-184, miR-203, miR-373, miR-124, miR-96, miR-373和miR-301a)，这些基因分离了候选mirna，这些候选mirna可能作为氧化应激和富含多酚(PP)的摄入的免疫球蛋白功能相关的新生物标志物。富含乳酸杆菌(FS)的功能性发酵食品，或其组合。GydF4y2Ba

关键字GydF4y2Ba

生物标记物，发酵大豆，石榴，PCRGydF4y2Ba

介绍GydF4y2Ba

营养调节疾病GydF4y2Ba

谁在2011年预测到2030年，心血管疾病将仍然是死亡的主要原因，影响全世界约2360万人[1]。高胆固醇血症代表动脉粥样硬化的第一阶段，慢性心脏病（CHD）的危险因素[2]。慢性，退行性疾病的患病率全部或部分地归因于饮食模式是对公共卫生最严重的威胁[3]。此外，研究表明，大约三分之一的癌症死亡可归因于营养不良，身体不活动和超重或肥胖;这些风险因素可能占大型肠，乳腺癌和前列腺癌的80％。可能导致这些疾病的发展和进展的常见因素是慢性炎症[4]，其可以通过饮食引起和改性。GydF4y2Ba

石榴汁（PGJ）及其衍生产品是多酚化合物最丰富的天然来源之一，对血脂谱（即TC、LDL-C和TG）具有积极意义[5]。此外，花青素和鞣花色素（主要是紫荆花色素）的存在抑制了胆固醇代谢中两种关键酶3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶和甾醇O-酰基转移酶的活性[6]。由于益生菌胆盐水解酶（BSH）活性介导的拟议机制，益生菌也有助于降低血浆高胆固醇血症。这种益生菌酶将糖脱氧胆酸和牛磺脱氧胆酸结合物水解成水解产物，从而抑制胆固醇的吸收和胆汁酸的再吸收[7]。GydF4y2Ba

结肠菌群是膳食PP代谢和益生菌定植的中心部位。用该物种的益生菌菌株进行膳食干预研究GydF4y2Ba乳杆菌嗜酸乳杆菌GydF4y2Ba,GydF4y2Bal .干酪乳杆菌GydF4y2Ba和GydF4y2BaL. rhamosusGydF4y2Ba给健康成年人服用的结果显示，细菌的摄入导致了数百到数千个基因的差异表达GydF4y2Ba在活的有机体内GydF4y2Ba在人类黏膜中，阐明健康人的肠道黏膜如何感知不同的益生菌，为合理设计的临床应用试验提供途径。PP与肠道菌群的相互作用影响了选定的人类基因(即营养转录组学)的表达，这介导了有益健康效应[9]的机制。类似的GydF4y2Ba在活的有机体内GydF4y2Ba当成年人给予益生菌时，也报告了粘膜转录组结果GydF4y2Ba乳杆菌植物蘑菇GydF4y2Ba，阐明了益生菌如何调节人类细胞通路，并揭示了与获得的特定生物活性分子和药物[8]反应谱的显著相似性。GydF4y2Ba

基因表达及其对miRNAS的控制GydF4y2Ba

细胞的基因表达谱决定了其对外部刺激的函数，表型和细胞的反应，因此有助于阐明细胞功能，生物化学途径和调节机制[10]。在过去几年中，RNA水平的几种基因表达分析方法已经出现并成功应用于癌症研究。微阵列的分析允许使用单个RNA制备同时从多个样品中平行量化数千个基因，并且具有变得重要的是，因为微阵列方便使用，并且不需要大规模的DNA测序，提供细胞的生理状态的清晰图像，并且似乎是癌症表征分子的综合方法，如结肠癌的研究所见[10]。GydF4y2Ba

地中海饮食中丰富的抗氧化多酚对基因表达的影响被分子生物学技术所揭示，揭示了我们对环境变化的适应[11]GydF4y2Ba．GydF4y2Ba表征人转录组的努力主要应用于组织，血液和尿液（即通常是无菌材料），以及粪便（非无菌介质）。已经报道了使用市售试剂的提取方案，以获得来自人粪便在对结肠癌进行的人粪便中进行的高产量的逆可转录的RNA [10,12]。GydF4y2Ba

Micro（MI）RNA作为生物标志物，以及它们在疾病过程中的作用GydF4y2Ba

生物标记物是一种被客观测量和评估为正常生物过程、致病过程或对治疗干预的药理学反应的指标的特征。相反，临床终点是从受试者的角度代表受试者健康的变量。目前存在多种生物标记物作为替代物，用于评估疾病的临床结果、预测个体健康或改进药物开发。理想的生物标志物应该是安全的，易于测量，具有成本效益的随访，可随治疗而改变，并且在性别和种族群体之间保持一致。由于我们从未完全了解影响个体健康的所有过程，作为替代终点的生物标志物需要不断重新评估替代终点和真正临床终点之间的关系[13]。在里面GydF4y2BaT.GydF4y2Ba在他目前的研究中，我们使用microrna作为摄入富含pp或发酵食品的生物标志物。GydF4y2Ba

基因表达及其miRNA调控GydF4y2Ba

细胞的基因表达谱决定了其对外部刺激的函数，表型和细胞的反应。因此，基因表达谱可以帮助阐明细胞功能，生物化学途径和调节机制。在过去的几年中，RNA水平的几种基因表达分析方法已经出现并已成功应用于癌症研究[10,12]。GydF4y2Ba

miRNA分子是一种小的非编码RNA分子(18-24 nt长)，通过抑制基因翻译参与基因表达的转录和转录后调控。MiRNAs通过抑制mRNA转化为蛋白质或促进mRNA降解来沉默基因表达。自1993年首次在文献中报道[14]以来，2014年6月鉴定出的miRNA数量为14.0版本，最新miRBase release (v20)[15]包含来自206个物种的24,521个miRNA位点，加工产生30,424个成熟miRNA产物。mirna经过RNA聚合酶II的处理，形成一个前体步骤，即一个较长的初级转录本。prim - mir通过两种酶的顺序切割转化为miRNA，这两种酶属于RNA III内切酶，Drosha和Dicer酶。Drosha将长一级转录本转化为约70 nt长一级miRNA (pri-miR)，然后通过Exportin 5输出到细胞质，通过Dicer[16]转化为成熟miRNA(~22净)。每个miRNA可能控制多个基因，一个或多个miRNA调控很大一部分人类蛋白编码基因，而每个单个基因可能受多个miRNA[17]调控。mirna通过与携带互补序列[18]的靶mrna的3个非翻译区(3 utr)相互作用抑制基因表达。GydF4y2Ba

材料和方法GydF4y2Ba

参与者GydF4y2Ba

研究对象为25名健康成人，年龄在20 - 34岁之间，无代谢性疾病，最近6周未使用任何药物，对任何食物或摄入的物质无过敏或超敏反应迹象。根据日常接触评估，所有受试者对补充的依从性均令人满意。在研究期间，所有的受试者都继续他们的饮食习惯。研究方案获得了机构审查委员会的批准，所有受试者在参与研究之前提供了书面的知情同意。GydF4y2Ba

研究设计GydF4y2Ba

图1显示了随机对照试验（RCT）的设计。在参加试验前一周，通过3次重复的食物记录评估估计的饮食摄入量。通过“nutrisurvey”软件程序，将食物的平均消耗量和营养成分数据值结合起来，评估平均每日能量和营养摄入。表1列出了参与研究的自愿受试者的特征、平均每日能量摄入以及选定的大量营养素。GydF4y2Ba

表1GydF4y2Ba. 补编的组成GydF4y2Ba

范围GydF4y2Ba	单位GydF4y2Ba	膳食补充剂GydF4y2Ba
		控制GydF4y2Ba (服务部分)GydF4y2Ba	FS.GydF4y2Ba (服务部分)GydF4y2Ba	PGJGydF4y2Ba (服务部分)GydF4y2Ba	FS + PGJGydF4y2Ba (服务部分)GydF4y2Ba
分量大小GydF4y2Ba	GGydF4y2Ba	–GydF4y2Ba	170GydF4y2Ba	250GydF4y2Ba	150 + 10GydF4y2Ba
总固体GydF4y2Ba	GGydF4y2Ba	–GydF4y2Ba	40.01GydF4y2Ba	17.75GydF4y2Ba	48GydF4y2Ba
碳水化合物GydF4y2Ba	GGydF4y2Ba	–GydF4y2Ba	51.1GydF4y2Ba	32.75GydF4y2Ba	59GydF4y2Ba
膳食纤维GydF4y2Ba	GGydF4y2Ba	–GydF4y2Ba	54GydF4y2Ba	0.25GydF4y2Ba	48.6GydF4y2Ba
能源GydF4y2Ba	千卡GydF4y2Ba	–GydF4y2Ba	263GydF4y2Ba	135GydF4y2Ba	290GydF4y2Ba
乳酸菌GydF4y2Ba	多样化的cfu /用量GydF4y2Ba	–GydF4y2Ba	–GydF4y2Ba	5.1×10GydF4y2Ba9GydF4y2Ba	4.5×10GydF4y2Ba9GydF4y2Ba
酵母GydF4y2Ba	cfu /用量GydF4y2Ba	–GydF4y2Ba	–GydF4y2Ba	2.77×10GydF4y2Ba10GydF4y2Ba	2.44×10GydF4y2Ba10GydF4y2Ba
总页GydF4y2Ba	毫克GydF4y2Ba*GydF4y2Bag /部分GydF4y2Ba	–GydF4y2Ba	–GydF4y2Ba	519.1±8.75.GydF4y2Ba	207.65±3.5GydF4y2Ba
抗氧化性活动GydF4y2Ba	(AEAC)GydF4y2BaArunachal Pradesh，GydF4y2Ba	–GydF4y2Ba	7.74±1.33.GydF4y2Ba	11.35±2.2GydF4y2Ba	11.37±2.2GydF4y2Ba

^*GydF4y2BaMg Galic acid等同（GAE），FS：功能性发酵肺叶;PGJ：石榴汁GydF4y2Ba

^{Arunachal Pradesh，GydF4y2Ba}Mmol抗坏血酸等效抗氧化活性。GydF4y2Ba

从参考文献5 Gouda修改GydF4y2Ba等等。GydF4y2Ba[5].GydF4y2Ba

图1。GydF4y2Ba说明随机对照研究设计的图表GydF4y2Ba

补充GydF4y2Ba

石榴是在埃及开罗的Obour公共市场批量购买的。对石榴果实进行剥皮，并使用实验室中试压力机(德国布劳恩)获得果汁。果汁以100克或250克等量分配在密封的、不透光的聚乙烯瓶中，并在−20℃保存。在此贮藏条件下，石榴多酚完全稳定。酸大豆，一种发酵的粥，每周从零售市场购买两次，并保存在冰箱里。豆豉是每克含有3 ×107 cfu多种乳酸菌(LAB)和1×107 cfu酵母菌的发酵大米。其他配料:加入牛奶、糖、椰丝。表2显示了尿多酚、血浆和尿抗氧化活性、尿硫代巴比妥酸反应产物(TBARS)和红细胞谷胱甘肽- s -转移酶(GST)的近似初始和最终平均值。GydF4y2Ba

表2GydF4y2Ba. 初始和最终平均尿多酚、血浆和尿抗氧化活性、尿TBAR和红细胞GSTGydF4y2Ba

X±SE:平均值±标准误差，GydF4y2Ba^*GydF4y2Bammol抗坏血酸当量抗氧化能力/mg肌酐；GAE：没食子酸当量，如果P值小于0,05，则平均值显著不同（P<0.05）。修改自参考文献5 GoudaGydF4y2Ba等GydF4y2Ba. [5]GydF4y2Ba

粪便收集和储存GydF4y2Ba

从25名健康成人中获取粪便，分别在饮食干预后第0天和第3周收集2次粪便。所有与无菌收集粪便,一次性木刮刀从清洁容器,大便后刚通过,然后放置储存到耐尔根螺旋盖瓶(热费希尔科学,Inc .,帕洛阿尔托,CA,美国),每个都包含2毫升的防腐剂RNA后(美国应用生物系统公司/ Ambion、奥斯汀、TX),防止脆性mRNA[10]的破碎，并将小瓶保存在- 70°C直到分析。所有冷冻样本准备好后，一次性提取包含miRNA的总小RNA，不需要从总RNA中分离包含小miRNA的mRNA，因为小总RNA适合制作ss miRNA c-DNA。GydF4y2Ba

总小RNA的提取GydF4y2Ba

我们使用RNeasy分离试剂盒附带的胍基缓冲液从粪便中提取少量总RNAGydF4y2Ba^®GydF4y2Ba我们的早期工作已经证明，在dna酶切后，RNA产量或对RT-PCR的影响没有差异。25份冷冻粪便样品同时纯化水RNA的时间为~ 3小时。使用Nano-Drop分光光度计(Themo-Fischer Scientific)在λ 260 nm、280 nm和230 nm处分光光度计测量小RNA浓度。总RNA的完整性由安捷伦2100生物分析仪(安捷伦技术公司，Palo Alto, CA, USA)利用RNA 6000纳米LabChip进行测定GydF4y2Ba^®GydF4y2Ba．使用提供的软件计算每个样本的RNA完整性数(RIN)。GydF4y2Ba

用于分子分析的ss-cDNA的制备GydF4y2Ba

RTGydF4y2Ba^2.GydF4y2BamiRNA第一链试剂盒GydF4y2Ba^®GydF4y2Ba从Sabiosciences Corporation（Frederick，MD，USA）进行用于在10.0μL逆转录（RT）反应中进行SS-DNA的副本，对于无菌PCR管中的每个RNA样品，含有100ng总RNA，1.0μlmiRNA RT引物和ERC混合物，2.0 /μL5XmiRNA RT缓冲液，1.0μLmiRNA RT酶混合物，1.0μL核苷酸混合物和无RNase-H.GydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba最终体积为10.0µl。每个样本使用相同数量的总RNA。内容物用移液器轻轻混合，然后进行短暂离心。所有试管37°孵育2小时，95°加热5分钟，降解RNA，灭活逆转录酶。所有试管冷冻5分钟，90µl无rnase HGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba在每根试管中加入O。完成的miRNA第一链cDNA合成反应随后在-20°下储存过夜。GydF4y2Ba

使用癌症RTGydF4y2Ba^2.GydF4y2BamiRNA PCR芯片96孔板研究miRNA的表达GydF4y2Ba

我们使用了SABiosciences RTGydF4y2Ba^2.GydF4y2BaMiRNA QPCR阵列板系统用于人（QIAGEN），使用实时，逆转录PCR（RT-QPCR）分析miRNA表达，作为miRNA表达分析的非常敏感和可靠的定量方法。阵列利用SYBR绿色实时PCR检测系统，该检测系统已被优化以同时分析许多成熟MIRNA的表达。每个96孔阵列板包含88个相关的miRNA聚焦途径的引物组（每个miRNA序列的一个通用底漆和一个基因特异性底漆），加上四个家庭基因（人雪东48,47和44，和U6）和两个RNA和两个PCR质量控制。复制RT对照（RTC）以测试miRNA Rt反应的效率，用引物组检测从内置MiRNA外部RNA对照（ERC）合成的模板。有重复的RT控制（RTC）以测试MiRNA逆转录过程的效率，引物组以检测从试剂盒内置miRNA外部RNA控制（ERC）合成的模板。还使用每分配的人造DNA序列和检测其的引物组来测试PCR工艺效率的重复的阳性PCR控制（PPC）。两组重复的控制孔（RTC和PPC）也测试井间，板内的一致性。人体RT.GydF4y2Ba^2.GydF4y2BamiRNA PCR阵列反映Sanger miRBase Release 14注释的miRNA序列。MAH-102F阵列的布局如图2所示。GydF4y2Ba

图2。GydF4y2Ba说明随机对照试验设计的图表GydF4y2Ba

实时定量pcr (qPCR)GydF4y2Ba

我们使用RTGydF4y2Ba^2.GydF4y2BaSYBR Green qPCR Master Mix (SBA Biosciences)用于从我们的PCR阵列获得准确的结果。我们将以下成分混合在一个15毫升96孔板的试管中:1275µl的2X RTGydF4y2Ba^2.GydF4y2BaSYBR Green PCR主混合物，100μL稀释的第一股反应，1175μLDDHGydF4y2Ba_2.GydF4y2BaO(总体积2550µl, 96次反应需要2400µl，每孔25µl，剩余鸡尾酒150µl。GydF4y2Ba

我们雇佣了Roche LightCycler 480GydF4y2Ba^®GydF4y2Ba96孔封闭PCR仪(罗氏，曼海姆，德国)。准备好后，我们从密封的袋子中取出所需的miRNA qPCR阵列，每个miRNA qPCR阵列包裹在铝箔中，每孔添加25µl相同的鸡尾酒，调整斜坡速率为1°C/秒。我们在程序中使用了45个周期，以允许使用二阶导数最大方法，可与LightCycler 480一起使用GydF4y2Ba^®GydF4y2Ba数据分析软件[19]。我们第一次加热10分钟96好板的95°C激活HotStart DNA聚合酶,然后,我们使用一个三步循环程序(一个15秒加热在95°独立的双链DNA, 60°30秒退一步来检测并记录SYBR绿色荧光在每个在每个周期,最后一步在72°下加热30秒)。在运行后，每个板都被目视检查，以寻找井中蒸发的迹象。资料采用2-ΔΔCt方法[20]进行分析。所有井的阈值循环值被导出到空白的Excel表格中进行数据分析。我们也GydF4y2Ba

在[21]循环程序之后运行解离(熔体)曲线程序，并使用Lightcycler的方法为板中的每个孔生成一阶导数解离曲线GydF4y2Ba^®GydF4y2Ba软件GydF4y2Ba

统计分析GydF4y2Ba

通过将苯二旋转48值除以使用原始熔化温度来标准化基因表达。使用软件R（3.1.3）进行分析，包裹质量[22]。对于每个标准化基因和每个熔化温度，使用一种方式ANOVA获得A.GydF4y2BaP.GydF4y2Ba-价值。有四个级别的解释变量：控制，Sobya，POM和两者。平行坐标图（R）[23]用于可视化每个基因和每个熔化温度的数据。使用尺寸的坐标命令GydF4y2BaP.GydF4y2Ba-价值。两种样品T检验用于基因表达，以比较对Sobya的控制并控制到（用var.equal = false中的r中的t.test命令）。GydF4y2BaPGydF4y2Ba-值被调整以控制错误发现率。[24] Benjamini和Yekutieli (GydF4y2BaP.GydF4y2Ba.使用方法class='BY'）调整R中的命令。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

在基线，所有参与者在试验中排出尿的全多酚;然而，各种变化相当高（4.89-12.59mg gae / 100ml尿液）。GydF4y2Ba

为志愿者提供的三种补品(FS、PGJ和FS + PGJ)的组成见GydF4y2Ba表1GydF4y2Ba. 初始和最终平均尿多酚、血浆和尿抗氧化活性、尿TBAR和红细胞GST。表2中列出了PGJ的每日部分提供21 mg PP/天，PGJ–FS的组合为9 mg PP/天。GydF4y2Ba

图3是RT的布局图GydF4y2Ba^2.GydF4y2BamiRNA PCR Array Human Cancer microRNA (MAH-102A)。图4为所研究的miRNA基因的熔融温度曲线分析的平行坐标图形表示。这些基因是用GydF4y2BaP.GydF4y2Ba- 基于组的单向ANOVA的值。最小的基因GydF4y2Bap -GydF4y2Ba首先是值。GydF4y2Ba

图3。GydF4y2Ba人类癌症RT的阵列布置GydF4y2Ba^2.GydF4y2BamiRNA QPCR板阵列（MAH-102A）GydF4y2Ba

图4A显示控制基因（Snord48，Snord47，Snord44，RNU6-2。Mirtc1，Mirtc2和PPC1，PPC2）。在图4B中，五个miRNA基因显示出分离。基因miR-184具有与对照基因的最高分离。miR-203基因在肌菌中很难扩增，而在石榴中高度表达。对于miR-373基因，对照组与其他三个治疗组不同。对于miR-124，miR-96和miR-378，石榴与其他三组很好。在图4C中，对于基因miR-301a，对照与其他三组分离。没有显示额外的miRNA基因，因为它们GydF4y2BaP.GydF4y2Ba-数值较大（不太显著），并且图表未显示任何有意义的分隔。GydF4y2Ba

图4。GydF4y2Ba研究miRNA基因的平行图坐标的图示。这些基因是用GydF4y2BaP.GydF4y2Ba- 基于组的单向ANOVA的值。最小的基因GydF4y2Bap -GydF4y2Ba首先是值。图4a为对照基因。图4b中，5个miRNA基因显示分离GydF4y2Ba

讨论GydF4y2Ba

粪便作为培养基开发敏感分子生物标记物筛选的适宜性GydF4y2Ba

粪便是一个具有挑战性的环境，因为它包含许多在PCR中可能无法持续去除的物质，此外还存在某些抑制剂，为了成功的PCR反应，所有这些都需要去除。我们的研究结果[10,25]和其他人[12,26]表明，粪便中细菌DNA、非转化RNA等物质的存在并不影响miRNA表达的测定，特别是在使用合适的PCR引物进行定量测定时。此外，粪便结肠细胞中含有的miRNA和mRNA比自由循环(如血浆[27])中含有的更多，便于测量。GydF4y2Ba

PCR扩增和抑制物质的影响GydF4y2Ba

PCR具有极高的敏感性，常用于遗传标记的鉴定。然而，这种方法可能会导致错误，因为抑制物质的存在，代表不同性质和作用机制的化合物，这些化合物通过直接与DNA相互作用，将被放大，或通过干扰所使用的耐热DNA聚合酶[28]来发挥其作用。镁是一个关键的辅助因子，以及降低Mg2的药剂GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba或干扰Mg2的结合GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba对DNA聚合酶有抑制作用。钙离子是另一种无机抑制物质，尽管大多数PCR抑制剂是有机化合物(如胆盐、十二烷基硫酸钠、尿素、苯酚、乙醇、多糖)，以及蛋白质(如胶原蛋白、血红蛋白、免疫球蛋白G和蛋白酶)[30]。粪便中多糖的存在会降低沉淀RNA的重悬能力或通过模拟核酸的结构破坏酶促反应。PCR的DNA模板可以被核酸酶抑制，与DNA模板结合的引物可以被抑制剂[31]干扰。已经提出了去除粪便中抑制剂的补救策略，如额外的提取步骤，sephadex G-200色谱，PCR前的热处理，氯仿提取，活性炭处理，添加BSA，或稀释样品[32]。在我们的研究中，我们发现用市售的[33]稀释剂将提取的核糖核酸(RNA)在反应混合物中稀释是最实用的防止PCR抑制的方法。GydF4y2Ba

mirna在营养疾病和治疗中的作用GydF4y2Ba

miRNA函数似乎调节发育[34]和细胞凋亡[35]。正如MiRNA参与真核细胞的正常功能一样，因此MiRNA的失调与许多疾病有关GydF4y2Ba例如各种癌症[36]，心脏病[37]，肾病[38]。神经系统疾病[39]、酒精中毒[40]、肥胖[41]、听觉疾病[42]、眼病[43]、骨骼生长缺陷[44]，以及在病毒性疾病的宿主-病毒发病机制中的关键作用[45]。在许多疾病中，相互作用的组织特异性与miRNA之间存在负相关，miRNA保护与疾病之间存在关联，并且发现与同一疾病相关的miRNA倾向于成为预定义的miRNA组，将共同允许在miRNA水平上识别新的疾病生物标记物[46]。特异性miRNA在肿瘤发生中起着关键作用[47]，可有效地对固体肿瘤[48]和液体肿瘤[49]进行分类，并作为癌基因或肿瘤抑制基因[50]。MiRNA基因通常位于脆性位点，以及杂合性丢失的最小区域，或常见断点区域的扩增，表明它们参与了癌症的发生[51]。miRNA有望作为癌症诊断、预后和/或治疗反应的生物标志物[52,53]。正常组织和肿瘤类型之间的miRNA表达谱不同，证据表明，miRNA表达谱可以比蛋白质编码信使（m）RNA基因的表达谱更准确地将类似的肿瘤类型聚集在一起[54]。此外，小miRNA（~18-22 nt长）是比脆弱mRNA更稳定的分子[25]。GydF4y2Ba

熔化曲线分析在阐明miRNA优先表达中的作用GydF4y2Ba

熔融曲线分析是在加热过程中对DS DNA的解离特性进行评估。使用DNA结合染料作为SYBR GREEN I，其在两条DNA的次要凹槽中更强烈地荧光100000倍，通过显着的荧光降低来测量加热过程中DNA的解离。结果，可以生成熔体曲线曲线，以及作为Roche LightCycler 480的专业PCR系统GydF4y2Ba^®GydF4y2Ba本研究使用SYBR Green I记录与ds DNA结合产生的总荧光随温度变化，并实时绘制荧光图，作为温度[55]的函数。这张图的一阶导数(dF/dT)是反应中荧光的变化率，随着ds PCR产物的熔化，荧光发生显著变化。在-df/dT与温度的关系图中将这些荧光变化显示为明显的峰，并通过形成的峰更容易精确地指出解离温度(定义为50%解离)。每个产品的熔化温度(Tm)被定义为相应的峰值出现的温度。该分析确认了所选引物的特异性，并揭示了引物二聚体的存在，由于其体积小，通常会在比所需产品更低的温度下熔化，它们的存在严重降低了目标基因的扩增效率，因为它们在扩增过程中争夺反应组分，最终影响数据的准确性。在最低的DNA浓度下观察到最大的影响，这最终损害了动态范围。此外，非特异性扩增可能导致PCR产物在高于或低于所需产品的温度下熔化。优化反应组分(Mg2+、洗涤剂、SYBR Green I浓度)和退火温度有助于降低非特异性产物的形成，但适当的产品设计是避免非特异性产物的最佳方法。包括阴性对照将确定是否存在共扩增基因组DNA[55,56]。高分辨率熔化(HRM)是一种通过更先进的软件实现的识别核酸序列变异的通用技术的进步，而且比基于探针的基因分型方法更便宜，可以快速准确地识别变异[57]。 This method has been widely used for detection of bacteria [58,59] viruses [60], mutations [61] and translocations [62]。在我们的研究中，我们发现融化曲线分析是一种有用和信息性的方法，我们认为调查人员对不显示其mRNA或miRNA中的表达差异的样品进行这种分析，是调查人员的要求。GydF4y2Ba

上述数据的临床意义在于，使用熔融温度分析营养基因数据是一种很有希望的新方法，用于识别与富含多酚、益生菌乳酸杆菌或两种代谢产物组合的代谢产物相关的关键调节性miRNA基因。熔融曲线分析是一种强大的新方法，因为在对我们的miRNA样本进行统计分析后产生了负面结果，对同一样本进行熔融曲线分析后，在高灵敏度聚焦PCR阵列（约8%的基因）上印迹的88个miRNA基因中，有7个（约8%）显著。因此，我们认为研究人员有必要对性质温和的营养样本进行这种“融化曲线”分析，并且许多样本在所研究的miRNA基因的表达上没有显示出显著差异。同样的分析也可以设想信使RNA扩增，使用mRNA阵列。我们还计划利用PP、FS及其组合进行更多的观察，并进行更多的miRNA表达研究，所得结果将充分证明这种分析营养基因数据的强大系统分子方法的敏感性/特异性。GydF4y2Ba

致谢GydF4y2Ba

我们对那些通过完成膳食调查问卷进行了参与这项研究的志愿者来表达深入感谢，并为该研究提供尿液，血液和粪便样本。GydF4y2Ba

作者声明在进行这项研究或准备发表这篇文章没有利益冲突。GydF4y2Ba

工具书类GydF4y2Ba

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