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摘要

焦糖染料IV (C-IV)是一种人工合成的有机产品，不存在营养、经氧或工艺因素，但会产生活性氧(ROS)。这种方式可能导致广泛的分子损伤，导致癌症、心血管和神经退行性疾病的发展。我们旨在验证不同剂量的C-IV染料对雄性瑞士CF-1小鼠肝脏和肾脏氧化应激标志物的影响，将其分为四个实验组:对照组;C-IV 0.3 g/kg;C-IV 1 g/kg和C-IV 3 g/kg。我们发现，主要是3 g/Kg的C-IV染料促进肝脏和肾脏匀浆的氧化损伤，表现为脂质过氧化增加，游离SH组减少，ROS生成增加。结果，检测到超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和乙酰胆碱酯酶活性增加，这是对氧化应激产生增加的反应。通过组织学图像证实了这些损伤。由于本研究中使用的小鼠剂量比人类日剂量低30倍，这些结果表明，日剂量可能会引起大量氧化应激损伤，并可能导致慢性疾病的发展。

关键字

肝，肾，氧化应激，焦糖IV染料，毒理学

介绍

染料是食品中常用的成分，通常对消费者没有营养、经氧性或技术重要性，用于食品美学目的[1]。在允许作为食品添加剂的染料中，(C-IV)在染料中有着特殊的地位，因为它是食品工业中最古老、最常用的染料，广泛应用于食品中[2]，被归类为有机合成产品[3]。

该添加剂是通过亚硫酸盐-氨法生产的;在生产过程中还可以添加一些酸和碱[4]，如硫酸或柠檬酸、磷酸、乙酸和/或碳酸;碱，如氢氧化物或钠、钾和/或钙的混合物;和盐，如碳酸盐，碳酸氢，硫酸盐和铵，磷酸钠，钾或钙。还可以添加一些铵类化合物，如碳酸盐和碳酸氢铵[5]。在这一过程中，氨的相互作用导致糖的还原，产生4-甲基咪唑(4-MEI)生成等副产物，这些副产物可能具有很高的毒性作用，如神经和癌症病理[6]，这导致加州将其归类为“致癌化学物质”[5]。根据食品添加剂专家委员会(JECFA)确定焦糖IV染料的每日可接受摄入量为每公斤300毫克[5]。

摄入有毒物质可出现体征和症状，这些体征和症状显示有毒物质与生物体相互作用产生的不平衡[7]。这种失衡可能是由于自由基过量产生，如果超过抗氧化防御，就会导致一种称为氧化应激的病理过程[8]。氧化应激对包括脂质、蛋白质和核酸在内的多种分子造成损伤，可能导致癌症、心血管和神经退行性疾病等疾病的发生[9]。

因此，对C-IV染料可能的毒性作用进行调查具有重要意义，因为它包含在许多食品和饮料中，并且由于缺乏对其有害作用和毒性的确切机制的了解，因此在世界范围内每天都在消费。因此，本研究旨在验证不同剂量焦糖IV染料对小鼠肝脏和肾脏氧化应激标志物的影响。

材料与方法

动物

从我们自己的繁殖群体中获得36只雄性瑞士CF-1雄性小鼠(30-40 g) g，饲养在受控环境条件下(光-暗循环12:12 h，光照期开始于7:00,25±1°C，相对湿度55%)，随意进食标准食物和水，每笼最多5只。小鼠在开始任何程序前适应7天。所有实验均遵循国家和国际立法:巴西动物实验学院(COBEA)和美国公共卫生服务关于人类护理和使用实验动物的政策- phs政策，并获得当地伦理委员会(#013/2017)的批准。

随机分为4组，分别给予单次和单次生理盐水或胃内管焦糖IV染色，置于单水笼中饲养。

试验协议

焦糖IV (C-IV)购自巴西圣保罗Prime Foods s(批号120117C)，溶解于生理盐水中，通过胃内灌胃(ig)给药。实验动物禁食12小时，随机分为4组，每组9只:(a)对照组生理盐水;(B) C-IV 0.3 g/kg;(c) c - iv 1 g/kg;(d) C-IV 3 g/kg。这些剂量是基于推荐膳食允许量(RDA)(人类每天300 mg/kg)[10]。因此，本研究中使用的最高剂量相当于摄入焦糖IV染料3,000 mg/kg/天，比RDA高10倍。为了研究C-IV的效果，选择了ig给药途径，因为这是世界上最常用的方式，这种染料被消耗。

给药4 h后，分别用氯胺酮和噻嗪麻醉，经心脏穿刺取血浆、分离血浆，颈椎脱位安乐死。肝脏和肾脏被立即取出并分离。实验设计如图1所示。

图1所示。本研究使用的实验方案描述

氧化应激标志物

脂质过氧化测定:脂质过氧化通过定量硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)来估计，在532 nm处测量，使用丙二醛(MDA)标准曲线[11]。

ROS生成测定:用2 ' 7 '二氯二氢荧光素(H . 7)测定肝脏匀浆中ROS的生成₂DCF-DA) (1mm)[12]。氧化二氯荧光素(DCF)采用标准曲线测定[13]。

非蛋白硫醇测定(NPSH):为了估计谷胱甘肽含量，根据Ellman[14]，我们用光谱法测定了NPSH含量。LYSKO, 1979)。

抗氧化防御酶

过氧化氢酶活性(CAT)和超氧化物歧化酶活性(SOD):根据Aebi[15]提出的方法测定CAT酶的活性。H后开始CAT的动力学分析₂O₂并在240 nm处测定显色反应。(AEBI, 1984)。

超氧化物歧化酶活性(SOD):SOD酶活性测定方法参照Misra和Fridovich[16]提出的方法。加入肾上腺素后开始对SOD进行动力学分析，用分光光度计在480 nm处测量显色反应[17]。

乙酰胆碱酯酶:乙酰胆碱酯酶活性采用Ellman法[18]，以乙酰硫代碘化胆碱(ATC)为底物，依托丙嗪为丁酰胆碱酯酶(BChE)抑制剂[19]。

肾、肝组织病理学分析

安乐死后快速提取肝脏和一个肾脏，4%多聚甲醛固定24小时，石蜡包埋进行组织病理学分析[20]。样品包埋于石蜡中，切片机切片(切片厚5mm)。为了进行组织病理学评估，根据标准程序对交替切片进行分离、再水化，最后用苏木精-伊红染色[21]。然后用光学显微镜观察切片，最终放大倍数为400倍(Olympus, Germany)。

统计分析

使用GraphPad Prism 6进行统计分析^®程序，采用单因素方差分析(ANOVA)，随后进行Tukey后验，p值<0.05为显著性。

结果

氧化损伤标志物

脂质过氧化和ROS生成:图2A显示，与对照组和C-IV 0.3 g/kg组相比，C-IV 1 g/kg组和C-IV 3 g/kg组肝脏中TBARS水平升高(p=0.0027)。在肾脏中，与对照组相比，C-IV 3 g/kg增加了TBARS水平(p=0.0239)。

图2．焦糖IV对脂质过氧化(TBARS)水平的影响(一)和活性氧生成(B)小鼠肝脏(左列)和肾脏(右列)。数据用mean±S.E.M表示(n=9, p<0.05)。上标没有大写字母的变量的表示

图2B显示，与对照水平相比，C-IV 1 g/kg和C-IV 3 g/kg组ROS产量增加(p=0.0142)。此外，与肾脏中所有其他组相比，C-IV 3 g/kg组的ROS生成增加(p=0.0049)。

非蛋白硫醇测定(NPSH):图3显示各组间肝脏无明显变化。然而，与C-IV 1 g/kg组相比，C-IV 3 g/kg组小鼠肾脏上的NPSH水平降低(p=0.0279)。

图3。焦糖IV对小鼠肝脏(左列)和肾脏(右列)NPSH水平的影响。数据用mean±S.E.M表示(n=9, p<0.05)。上标没有大写字母的变量的表示

抗氧化防御酶

图4A显示，与对照组和0、3 g/kg组相比，C-IV 3 g/kg组肝组织中CAT活性增加(p=0.0189)。此外，与其他组相比，C-IV 3 g/kg组肾脏CAT活性增加(p=0.0267)。

图4。焦糖IV对小鼠肝脏(左列)和肾脏(右列)抗氧化酶CAT (A)、SOD (B)和AChE (C)活性的影响。数据用mean±SEM表示(n=9, p<0.05)。上标没有大写字母的变量的表示

图4B显示，与对照组和0、3 g/kg组相比，C-IV 3 g/kg组肝脏SOD活性增加(p=0.0054)，与对照组相比，C-IV 3 g/kg组肾脏SOD活性增加(p=0.0294)。

图4C显示，与肝脏对照组相比，所有C-IV剂量均诱导AChE活性增加(p<0.0001)。肾脏上，C-IV 3 g/kg组与对照组和0、3 g/kg组相比，乙酰胆碱酯酶活性升高(p<0.0057)。

组织学分析

在对照组、0.3 g/kg和1 g/kg C- iv组中，肝脏(分别为A、B和C组)和肾脏(分别为E、F和g组)均未观察到组织病理学变化(图5)。然而，D图显示C-IV 3 g/kg组引起肝脏弥漫性轻度中央旁积水变性。同样，H组显示C-IV 3 g/kg给药引起肾小球肾炎、中度多灶性增生膜和肾小球计数低。

图5。小鼠肝脏(A-D组)和肾脏(E-H组)的HE显微照片(最终放大倍数为400倍)。对照组(A、E组)、0.3 g/kg组(B、F组)、1 g/kg组(C、g组)小鼠肝脏和肾脏切片，C- iv组分别显示肝细胞和肾小球、肾小管结构正常。C-IV 3 g/kg (D组)显示肝脏弥漫性轻度中央旁积水变性。C-IV 3 g/kg组肾切片(H组)，肾小球肾炎，中度多灶性增生性膜，肾小球计数低

讨论

在本研究中，我们证明了1 g/kg和3 g/kg的C-IV促进了小鼠组织氧化应激损伤的发展，表现为肝脏脂质过氧化增加，NPSH组减少，活性物质产生增加以及肝脏和肾脏的组织学改变。此外，我们证明了C-IV负责激活抗氧化防御系统，表现为过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和乙酰胆碱酯酶在小鼠肝脏和肾脏上的活性增加。

C-IV染料生产过程的特点是在其制造化学反应中存在氮和硫，其生产导致高分子量成分(HMW)的形成(负责颜色分化)和低分子量成分(LMW)的形成(负责4-甲基咪唑(4-MEI)等非故意物质)[5]。C-IV给药后的氧化损伤作用可能与4-MEI有关，4-MEI也被国际癌症研究机构列为人类致癌物和最强神经毒性物质[22]。

由此可见，4-MEI剂量分别为100、130和160 g/kg的小鼠，在4-MEI暴露12小时和24小时后，染色体突变率更高，表明4-MEI对小鼠具有细胞毒性[23]。此外，研究表明，经C-IV治疗的啮齿动物的新生儿死亡率增加，满月肿瘤的形成[6]，组织色素沉着改变，体重、尿液和血液学检查的变化[10]。

更高的ROS生成，特别是过氧化氢和超氧化物，可能是由于细胞色素P450的介导，它被认为促进了这种增加[24]，因为4-MEI具有与2和3-甲基呋喃非常相似的结构，代谢后具有细胞色素P450蛋白[25]。同样，细胞色素P450代谢后的高剂量扑热息痛会产生一种称为n -乙酰基-对苯醌亚胺的有毒代谢物，它可以与还原性谷胱甘肽偶联并消耗其肝脏储存[26]。我们认为细胞色素P450通路可能在高剂量C-IV下被激活，这是由于4-MEI的存在，它在结构上类似于2和3-甲基呋喃，并且具有细胞色素P450代谢。与这一假设相配合，我们在这里证明了高剂量的C-IV通过增加肝脂质过氧化而具有高毒性，并可能损害细胞膜，改变其结构和通透性[27]。

此外，糖毒素或脂质过氧化产物通过美拉德反应促进晚期糖基化产物(AGEs)的形成[28]，这一过程发生在焦糖染料焦糖化过程中[29]。C-IV被认为含有丰富的AGEs，其分子被认为具有高活性，是自由基生成的电子供体，可促进氧化应激的发展和随之而来的细胞损伤[30]。AGEs激活被称为RAGE(受体晚期糖基化终产物)的特异性受体，并产生炎症细胞因子，如白细胞介素1和6 (IL-1和IL-6)、肿瘤坏死因子α (TNF-α)、蛋白C反应(PCR)。AGE-RAGE的相互作用似乎介导了自由基的产生，改变了细胞膜的通透性和活力[30]，这与我们关于氧化标志物形成并导致氧化应激的研究结果相吻合[28-30]。

自由基的有害作用可以通过激活抗氧化防御系统来抑制和/或减少，维持细胞内稳态，防止损伤的扩大。根据我们的研究，我们证明了C-IV能够诱导被分析组织中以SOD、CAT和乙酰胆碱酯酶为代表的抗氧化酶防御系统的增加[31]。这种对抗氧化系统调节的调节可能被认为是对ROS形成增加的反应，但不足以防止或减弱C-IV给药引起的氧化损伤。

C-IV 3 g/kg给药小鼠肝脏和肾脏均可见氧化应激损伤，肝脏可见弥漫性轻度中央旁水肿变性，可能出现肾小球肾炎，中度多灶性增膜，肾组织肾小球计数低。此外，研究表明，用2-甲基咪唑治疗的动物会出现含铁血黄素的肾脏病变，这在雄性小鼠中最为明显[25]。这些改变与肝脂质过氧化和肾活性氧损伤增加有关。

通过这种方式，我们指出这是一项至关重要的研究，因为如果我们使用人类x小鼠之间的剂量转换因子——一种采用体表面积指数的方法，考虑代谢率的差异，来转换动物和人类之间的剂量——这里使用的最高剂量大约比人类的RDA低30倍[32]。这样，它突出了我们研究的相关性，因为低剂量，甚至低于RDA的剂量，会导致许多组织损伤和氧化应激的发展。

最后，已知AGEs的产生可能导致炎症过程[30]，因此，C-IV极有可能通过增加细胞因子和触发特异性炎症受体而导致炎症过程[30]。我们小组将在未来的研究中对这一假设进行调查。

结论

我们的研究首次表明，高剂量的焦糖染料IV促进小鼠肝脏和肾脏的氧化应激，通过增加TBARS, ROS产生和NPSH减少水平来证明，鉴于其潜在的细胞毒性作用，因为它的成分中含有物质4-MEI，已经被认为是通过可能的氧化和代谢途径产生有害影响。此外，C-IV可以促进氧化还原系统的改变，通过提高肾脏和肝脏的CAT、SOD和AChE活性观察到。由于本研究中使用的小鼠剂量比人类日剂量低30倍，这些结果表明，日剂量可能会引起大量氧化应激损伤，并可能导致慢性疾病的发展。CI-V诱导细胞氧化损伤和可能的炎症损伤的机制有待进一步研究。

致谢及资助

这项工作得到了PRONEM/CNPq/FAPERGS 16/25510000248-7和CAPES/PROEX 23038.005848/2018-31研究基金的支持。FAAS获得CNPQ奖学金。JSS和PCR获得了CAPES的奖学金。

利益冲突声明

作者声明无利益冲突。

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