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摘要

目的:韦斯特综合征(WS)是一种罕见的癫痫疾病，特别影响年幼的婴儿，具有潜在的严重后果。其病理生理尚不清楚，这阻碍了开发靶向药物的进展。在这里，我们试图确定WS患者是否具有特定的脑脊液(CSF)代谢特征，这可能有助于描述所涉及的改变。

方法:脑脊液样本收集于2010-2016年期间WS患者(n=9)。对照组(n=9)包括接受腰椎穿刺(LP)的发育正常和无癫痫发作的儿童。通过液相色谱-高分辨质谱(LC-HRMS)进行靶向和非靶向脑脊液代谢组学分析。代谢模式通过基于多种机器学习方法的多元分析进行分析。biosigner算法包括训练、测试集和自举的使用)和单变量统计分析。

结果:Biosigner策略揭示了一个从包括丝氨酸在内的2种代谢物中区分WS和对照组的显著模型。该模型正确预测了83%的受试者的诊断。通过单因素分析，两组间丝氨酸水平也有统计学差异(p= 0.0023)。

结论:这是WS的第一个代谢组学研究。我们的结果表明在这种疾病中丝氨酸的关键需求。在WS中观察到的症状与丝氨酸代谢途径的改变一致。我们提供了关于这种严重癫痫综合征的新数据，并强调了代谢组学研究在儿童神经疾病中的潜在价值，即使患者很少。

关键字

西部综合征，癫痫，脑脊液，生物标志物，代谢组学，丝氨酸

简介

韦斯特综合征(WS)是指婴儿痉挛的一个子集，可以继发于神经系统疾病或原因不明。虽然它在19世纪被发现，但我们对其病理生理学的理解仍然相对较差，需要强有力的生物标志物。Greene使用蛋白质组学方法等．强调了动物模型中一些潜在的生物标志物。然而，这种蛋白质组学的概况是不具体的，这种技术上具有挑战性的方法排除了它在日常实践中的使用。代谢组学是确定生物液体中小分子代谢特征的一种强有力的策略。在本研究中，我们首次使用基于质谱的代谢组学方法来探索WS。这可能为改善该病的管理和治疗提供了机会。

方法

患者招募和数据选择

患者在图尔大学医院儿科神经内科招募(2010年7月- 2016年5月)。纳入标准为WS诊断，基于ILAE定义[1]。在使用抗癫痫药物前采集脑脊液样本。对照组包括发育正常和无癫痫发作的儿童，他们最初表现出各种症状，在调查期间需要进行腰椎穿刺(LP)。收集了以下因素:性别、癫痫发作时的年龄、精神运动发展、发育退化、WS病因、正在进行的治疗、LP时的年龄、LP时禁食或非禁食状态。获得父母双方的伦理同意。

样品制备和LC-HRMS分析

我们用LC-HRMS的标准方法制备了代谢组学的样品和质量控制样品(QC)。LC-HRMS分析使用UPLC Ultimate 3000系统(Dionex)进行，耦合到Q-Exactive质谱计(Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany)，并在正(ESI+)和负(ESI-)电喷雾电离模式下操作，如先前发表的[2]。

数据预处理

我们进行了非定向和定向分析。筛^R使用软件(赛默飞世尔科学公司)处理原始数据进行非靶向分析，并从我们自己的库中识别代谢产物进行靶向分析。在最终数据集中，我们只保留QC样本中变异系数< 30%的代谢物。

多元数据分析

使用主成分分析(PCA)评估QC和患者样本的聚类，以评估异常值。OPLS-DA首先使用SIMCA®版本13.0 (Umetrics, Umeå，瑞典)进行，以提供分数散点图和加载分数图，以可视化样本的判别和最具判别性的变量。

我们还使用了biosignerR[3]中的算法来评估，作为一种发现重要分子特征的新策略。这种数据挖掘算法独立地围绕着不同的机器学习方法，即偏最小二乘判别分析(PLS-DA)、随机森林(RF)和支持向量机(SVM)。该策略的目的是将采样(bootstrap, n=1000)、相关代谢物排序、在测试集内排列后的性能评价与半区间搜索相结合后，找到能提供显著模型的最小模式。模型的最终训练是基于数据集中的所有样本和选定的特征。首先，将数据集分为训练数据集和测试数据集(通过引导，控制类的比例)，然后在训练集上建立模型，并在测试集上评估预测的性能。

单变量分析

代谢产物的单变量分析基于折叠变化(FC)值和火山图显著性阈值，使用metabolanalyst 2.1版进行非参数Wilcoxon检验。我们只强调了代谢物p< 0.05, FC > 1.5。

结果

CSF集合

纳入WS患者9例(6女3男)。临床资料汇总见表1。对照组临床表现如下:

表1。西证受试者的临床特征(F:女，M:男，M:月，w:周，d:日，div:饮食多样化)

患者1:14岁1个月女婴，四肢疼痛;

患者2:4岁11个月女婴，共济失调

患者3:10岁4个月男婴，头痛头晕

病人4:14岁6个月大的女孩，严重的慢性背痛

患者5:9岁1个月女婴，头痛，共济失调

患者6:9岁4个月女婴感觉异常

患者7:15岁6个月女童，右侧偏瘫

病人8:15岁女孩，晕倒

病人9:12岁10个月大的女孩，复视

LC-HRMS分析

非靶向分析显示ESI+和ESI-模式分别获得291和82帧，靶向分析鉴定出62种代谢物。

多变量分析

主成分分析显示QC和每组受试者(未显示的数据)．图1A显示了由OPLS-DA构建的分数散点图(p =0.0001)使用10种最相关的代谢物(图1B)进行测试，如丝氨酸、色氨酸、组氨酸、3-甲基组氨酸、谷氨酸、柠檬酸、维生素B5和未识别的代谢物。Biosigner分析显示WS患者有2种代谢物的显著特征:丝氨酸和ESI -的未知代谢物X363。在1000次自举后的测试集中，正确预测患者的百分比为83%。

图1．基于LC-HRMS的代谢组学分析脑脊液样品获得OPLS-DA(蓝点:对照组，n=9，绿点:WS患者;N =9)来自10个代谢物。A)分数散点图。x轴和y轴代表了总结所有进入分析变量的得分向量:t1和to1 B) Loading score Plot。相互接近的变量正相关;相互相反的变量是负相关的

单变量分析

火山图谱显示有8种代谢物p-value < 0.05和FC >1.5:丝氨酸(p=0.0023)， 3-甲基组氨酸(p=0.024)、组氨酸(p=0.0152)、维生素B5 (p=0.0152)，琥珀酸(p=0.03)和3种未知代谢物，包括X363 (p =0.005，数据未显示)。

讨论

这是首次在WS患者中进行脑脊液代谢组学研究。它的优点之一是结合了几种统计方法，即biosigner基于火山图的机器学习策略和单变量分析。尽管队列规模较小，但每组受试者中的PCA结果均未显示因禁食或治疗而导致的偏倚，并且稳健的多变量分析提供了一个极好的模型来区分WS和对照组。由于伦理问题，我们无法选择匹配的对照组，但这项初步研究表明，代谢组学策略可能用于癫痫。

WS患者特定的脑脊液代谢组

OPLS-DA揭示了一个仅从10种代谢产物中区分WS和对照的优秀模型。令人惊讶的是，高度限制biosigner分析还提供了一个仅从2种代谢物得出的精度优于80%的重要模型。这种新方法基于最近不同类型的机器学习策略，包括自举重采样，被认为是突出区分化合物和判断模型适应度的最稳健方法。

丝氨酸的鉴别作用

受影响最显著的代谢物是丝氨酸。在动物模型中已经观察到丝氨酸水平升高。在人类中,原位丝氨酸水平升高与难治性癫痫有关。因此，丝氨酸稳态似乎在脑神经传递和癫痫发生中起着重要作用。谷氨酸和丝氨酸升高都需要激活NMDARs，这是突触可塑性和兴奋性传递的关键因素[4]。在慢性癫痫大鼠模型中，d -丝氨酸水平的改变改变了NMDAR亚单位的组成，改变了长期增强和随后的记忆功能[5]。丝氨酸还参与mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)通路的调控，参与突触可塑性、神经元修复机制和记忆[6,7]。抑制mTOR通路被认为是一种有前途的抗惊厥策略。生酮饮食可以增加脑脊液中的丝氨酸水平，对严重癫痫患者[8]也有有益作用。

我们还观察到色氨酸的浓度在WS患者中趋于较高。这与丝氨酸的发现是一致的，因为色氨酸是由吲哚和色氨酸的不可逆缩合产生的丝氨酸．色氨酸降解次生导致生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，被称为犬尿氨酸通路。我们的研究结果进一步强调了该通路在癫痫中的作用[9,10]。然而，其在WS病理生理学中的参与仍是假设的，需要进一步的具体研究。

WS涉及的其他生化途径

柠檬酸和琥珀酸也参与了三羧酸循环。柠檬酸盐与癫痫发生过程高度相关，因为它的转运在携带SLC13A5基因突变的患者中发生改变，而癫痫是其中的一个关键特征。

组氨酸-肌肽通路的调节也被强调。这一数据与之前的一份报告一致，该报告显示组氨酸和肌肽在大鼠PTZ点燃癫痫发作模型和青霉素诱导的大鼠癫痫样活性中均表现出抗惊厥作用。

总之，这是第一个探讨代谢组学在WS中的潜在用途的研究。我们显示了一个鉴别剖面和我们的数据阐明了涉及WS病理生理学的途径，特别是有关丝氨酸。下一步将在一个独立的队列中验证这些结果，将不明原因的WS患者与其他癫痫患儿进行比较。

声明

作者身份/贡献者身份/致谢:所列的所有作者都对该项目做出了足够的贡献，因此被列为作者，并且已经批准了手稿和本次提交。

资金信息:据我们所知，不存在财务或其他利益冲突。

竞争利益:我们没有任何竞争利益需要申报。

参考文献

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3. Rinaudo P, Boudah S, Junot C, Thévenot EA(2016)生物签名:从组学数据中发现显著分子签名的新方法。Mol Biosci3: 26。(Crossref)
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