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慢性髓系白血病，bcr-abl1，非典型转录本，微小残留病，DDPCR

慢性髓系白血病(CML)的特征是t(9;22)(q34;q11)易位，导致BCR-ABL1蛋白的生成，具有组成型酪氨酸激酶活性。

bcr - abl1是微小残留病(MRD)评估的分子标记物，其在整个随访过程中的水平定义了分子缓解的深度，并指导临床决策，如改变酪氨酸激酶抑制剂(TKI)或最近停止治疗[1]。
在大多数情况下，22号染色体上的断点引起传统类型的bcr - abl1融合转录本e13a2或e14a2，而在BCR或ABL1导致其他非典型融合转录本，如e19a2, e8a2, e13a3, e14a3。最近对这些非典型转录本的流行病学进行了评价，但由于它们的罕见，其临床意义存在争议。

罕见转录本的存在会使CML的诊断具有挑战性，因为实时PCR (RT-qPCR)是用于定量的标准化方法bcr - abl1，可能无法进行扩增，结果可能是错误的阴性。诊断首先需要定性分析，然后是测序。目前疾病监测主要采用定性方法，如NESTED PCR和FISH分析。对稀有转录本的定量监测还没有标准化的方法。在一个我们用大分子反应或深分子反应来指代CML反应的时代，它的结果是很难遵循非典型转录本患者的临床过程。此外，由于缺乏量化MRD的可能性，携带非典型转录本的患者目前被任何停止治疗方案[3]自动排除。

与RT-qPCR相比，数字PCR (dPCR)似乎是最可靠和可重复的MRD监测方法，它独立于校准器或标准参考曲线。dPCR值在费城阳性(Ph+)和阴性白血病中已有报道[4-7]。

我们在此报告了一例具有独特非典型转录本的慢性期CML新病例，通过设计患者特异性试验，应用液滴dPCR (ddPCR)使我们能够量化从诊断到随访的疾病负担。

患者为58岁女性，既往乳腺癌复发史，2018年3月被诊断为慢性CML。诊断时，患者血球计数:Hb 14.6 g/dl，血小板282.000/uL，白细胞15860/uL，嗜碱性粒细胞6.4%，嗜酸性粒细胞2.3%，外周血涂片未见母细胞。未见脾脏肿大。索卡尔和ELTS的得分都很低。她开始服用伊马替尼400毫克/天。

患者首先采用常规细胞遗传学和荧光原位杂交(FISH)进行特征分析，如下所述。

根据标准方法对骨髓(BM)细胞进行核型诊断。根据制造方案，培养BM细胞48小时，染色体用赖特伊红亚甲基蓝g -带(#101383，默克Millipore)。分析了至少20个中期。在诊断时对BM样本进行FISH分析，使用XL BCR/ABL1 plus (#D-5052-100-OG, metsystem)，遵循制造商的协议。统计了至少300个间期细胞，并分析了所有可用的中期。

诊断时的细胞遗传学分析在20/20中期发现了典型的t(9;22)(q34;q11)易位。FISH显示96%的Ph阳性细胞。在3个月和6个月重新评估时，获得了完全细胞遗传学应答(CCyR)， FISH分析结果均为Ph阳性细胞阴性(数据未显示)。

研究患者分子特征如下:使用M-MLV逆转录酶(reverse Transcriptase)、RNAse Inhibitor和Random Hexamers Primers(分别为#28025013、#N8080119和#N8080127, Thermo Fisher Scientific)将BM和外周血(PB)细胞中提取的总RNA逆转录到互补DNA。BCR-ABL1融合转录本的存在被评估为推荐的[8]。

常规RT-qPCR分析使用BCR-ABL P210 ELITe MGBKit (#RTSG07PLD210, ELITech Group)进行，不产生目标序列扩增。BCR-ABL1融合转录本采用Sanger方法测序，引物如van Dongen所述等．[8]。液滴dPCR (ddPCR)实验采用QX200系统(Bio-Rad)进行。ddPCR是基于水-油乳状液滴技术，允许量化样本中每个液滴中的单个目标分子，并使用泊松统计实现PCR数据。针对患者特异性序列设计引物和探针如下:BCR引物的5 ' -cgtggagctgcagatgct-3’,ABL1引物5 ' cctgctcctttgataaaatgc '和TaqMan Probe 5 ' -ccaactcaaaagta-3 '(赛默飞世尔科学公司)。ABL1(#Hs01104728_m1, Thermo Fisher Scientific)基因作为内部控制。的bcr - abl1融合和ABL1在同一口井中对转录本进行了多重测试。每个重复由一个自动液滴发生器分成20,000个液滴，每个液滴用PCR扩增。然后将每个样本装入QX200液滴阅读器上，用QuantaSoft分析软件(1.7.4版本)分析ddPCR数据。每个样品分析三次，每孔加载100ng初始RNA。每个样品的靶浓度表示为bcr - abl1副本/ng和%的bcr - abl1/ABL1．

评价患者特异性ddPCR检测的良好质量bcr - abl1我们首先用RT-qPCR技术对患者的cDNA进行10倍稀释，检测引物的效率。所得曲线线性度高(相关系数R²=0.989)，斜率为-3.24，效率良好(E=103.5%)(图1A)。为了评估检测的灵敏度，我们将患者的RNA与一组阴性的RNA混合bcr - abl1ddPCR(100%， 10%， 1%， 0.1%， 0.01%， 0.001%和0%患者的RNA vs。bcr - abl1- RNA池)。结果表明，我们的试验可以量化BCR-ABL1转录量的减少，最多可达10⁵， 0%样品中无阳性液滴(图1B)。此外，得到的曲线显示非常高的线性度(相关系数R²c = 0.9998)(图1)。

图1。一个用qRT-PCR计算引物效率。10倍级数稀释在5个对数上是线性的。数据表示每种稀释倍数的两次重复。(E:效率;R²:相关系数)。B通过ddPCR分析获得的一维图显示患者特异性探针产生的荧光。每个点代表BCR-ABL1融合转录本阳性的一个液滴。C患者cDNA 10倍序列稀释后BCR-ABL1融合转录本的逐渐减少(以log of copies/ng表示)。(右²:相关系数)

然后,bcr - abl1在诊断时(BM)和TKI治疗3、6和12个月后(PB和BM)评估患者样本的融合转录水平。在诊断时，巢式PCR捕捉到一个与e14a2转录本分子量兼容的特异性信号，而我们观察到，在每次评估的第一步，信号一致减少，且非常轻微的持续阳性，直到12个月后的最后一次随访(图2A)。尽管巢式PCR在诊断时的结果与e14a2转录本相似，但RT-qPCR无法对其进行量化(数据未显示)。巢式PCR产物在诊断时的Sanger测序显示一个非典型断点BCREx13缺失53个核苷酸，插入119个核苷酸ABL1内含子1融合到ABL1外显子a2 (BCRe13(-53元)/ ins 119元ABL1 b/ ABLex2)(图2 b)。随后，设计了一种患者特异性分析来量化bcr - abl1应用ddPCR技术检测诊断时和随访时的转录水平。数据显示不断减少bcr - abl1从诊断到最后一次随访(12个月)(图2C)。

图2。分子分析。一个BCR-ABL1进行定性PCR分析
融合转录本检测。(M: DNA分子量标记;控制:控制;NTC:没有模板控件)。B定性PCR产物的直接测序显示BCR ex13之间融合，删除53个核苷酸，插入119个从ABL1内含子1融合到ABL1外显子a2的核苷酸。C左侧为ddPCR分析得到的一维图，显示患者特异性探针产生的荧光。每个点代表BCR-ABL1融合转录本阳性的一个液滴。右侧显示，自TKIs治疗开始，BCR-ABL1融合转录本(表示为BCR-ABL1/ABL1的%)逐渐减少。(CCyR:完全细胞遗传学反应)

变体bcr - abl1融合转录本发生在1-2%的CML患者中，最常见的报道是由于选择性剪接BCR而且ABL1外显子。插入21个核苷酸ABL1内含子1在bcr - abl11998年Rubinstein和Purves[9]首次在CML患者中描述了融合部位。的其他可变大小的插入ABL1在RT-qPCR中出现明显假阴性结果的内含子1在后续几年也有报道[9-11]。尽管定性嵌套PCR和Sanger测序对诊断和鉴别该病仍然有用bcr - abl1转录本、ddPCR技术在非典型病例的定量检测中效果显著bcr - abl1在不需要标准曲线制备的情况下进行绝对定量。根据欧洲白血病网标准[12]，该患者在TKI治疗6个月时达到早期分子反应(MR2)，在TKI治疗12个月后达到主要分子反应(MR3)。不幸的是，在临床实践中，由于没有标准化的监测方法，这种判断是不可能的bcr - abl1变异是可用的。总之，分子监测bcr - abl1在显示非典型转录本的CML患者中可能有助于更好地确定这些患者的MRD水平。

作者和contributorship

JP和MD设计了研究，进行了实验并撰写了手稿;AC提供了样品和临床资料;MLI设计了实验方法;CF和CB加工样品;AS进行测序分析;EG进行细胞遗传学分析;GA和VR对数据进行分析;EG, GRC, GS, DC和CF监督实验并提供最终审稿。所有作者阅读并批准了最终稿件。

JP和MD对这份手稿贡献相同。

资金信息

这项工作得到了AIRC的资助(资助号为10005给GS)。

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。

参考文献

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