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摘要

植物及其产品，如精油，大多被认为是安全的药物产品。近年来，药用植物被用作有助于预防和治疗疾病的天然产品。

药用植物在传统医学和维护人类健康方面发挥着至关重要的作用。大多数的蓍属物种包括高度生物活性的化合物，所以它们有治疗应用。在本研究中，目的是调查在体外抗氧化和细胞毒作用蓍属falcata精油。采用Clevenger法提取地上部分挥发油，采用GC-MS法测定挥发油成分。采用DPPH法和总酚含量法对其抗氧化性能进行了分析。采用MTT法检测挥发油对人宫颈癌细胞HeLa和结肠癌细胞Caco-2的细胞毒性。结果表明，挥发油具有较低的DPPH清除活性，其总酚含量为32.467没食子酸当量/g植物油。随着浓度的增加，挥发油对HeLa和Caco-2癌细胞表现出更强的细胞毒作用蓍属镰状的精油可能含有抗癌化合物，可触发HeLa和Caco-2癌细胞的细胞毒性。

简介

在过去的几年中，人们对中草药及其提取物的抗氧化和自由基清除特性的兴趣大大增加。事实上，植物中含有的抗氧化剂似乎与保护人类健康有关，例如预防癌症，延缓衰老过程，降低心血管和神经退行性疾病的风险。氧化损伤是所有这些生理病理条件的标志，而植物提供外源性抗氧化剂，可能有助于细胞的自然防御系统[1-3]。因此，评估传统上广泛使用的植物和植物提取物的抗氧化和自由基清除特性，对于寻找功能性食品和营养食品中天然抗氧化剂的新来源[4,5]以及食品工业中合成抗氧化剂的可行和“天然”替代品都是一个重要问题，因为食品保存化合物由于其固有的致癌性风险[6]而受到限制。Achillea是菊科(Asteraceae)最重要的属之一，全世界有100多个种，主要分布在欧洲、亚洲和北非[7]，特别是Achillea falcata被报道对内出血、子宫痔疮、胃病、胃炎和膀胱结石[8]有有益作用。近年来，该物种的一些药理特性得到了科学的研究。已经证明了一些A.falcata倍半萜内酯是细胞毒剂[9-12]，其提取物/精油具有抗菌、抗氧化和抗血小板的特性[8,13-16]。植物药物基础上或包括a falcata被视为人类使用和完全安全无毒(8,17)。然而，关于镰形莲的植物化学数据，以及使用镰形莲精油对癌细胞系的研究都相当缺乏[18,19]。本研究的目的是评估抗氧化能力，并研究不同浓度的falcata精油对HeLa和Caco-2细胞的影响，并评估其与总酚含量的关系，在本研究中，使用化学方法(DPPH清除自由基的活性)和MTT试验(HeLa和Caco-2细胞系的细胞活力)。

材料与方法

植物材料

的空中部分A.falcata该植物于2016年7月在拉塔基亚的Karm Al-Maasara地区采集，并由大马士革大学植物生物学系助理教授、植物分类学家Emad Al-Qadi博士进行了分类。植物在室温下干燥1周，然后用电磨研磨。干燥的粉末状材料在+4°C保存。

精油的提取

从植物样品中提取精油使用克利文杰型装置，其中植物材料经过水力蒸馏。提取条件为100g样品，料水比1:5，蒸馏2.5h。油用无水硫酸钠脱水，立即储存在密封玻璃器皿中，置于+4°C的冰箱中。

gc - ms分析

采用带数据处理系统的装置色谱仪对挥发油进行分析。采用苯基甲基硅氧烷HP-5MS%色谱柱(0.25μm × 250μm × 30m)，载气1ml/min。操作条件为:进样器温度260℃，检测器温度280℃;烤箱温度程序在60°C开始，然后上升4°C/min至200°C，随后以8°C/min上升至260°C，然后在260°C恒温7.5 min;注射方式，无分裂(1μl 1:1000正戊烷溶液)。在相同的操作条件下，测定了与同源系列正构烷烃(C8-C22)相关的线性保留指数。采用与上述相同的色谱条件，使用Agilent 7890 A进行GC-MS分析。

抗氧化活性

总酚类化合物评价:以没食子酸为标准，采用福林- ciocalteu法[20]测定挥发油中总酚的含量。将蒸馏水(450 μL)与样品50 μL和福林- ciocalteu试剂250 ml混合，进行涡流处理。然后加入2ml Na2CO3(20%)，将混合物进行漩涡处理。所有样品在40°C孵卵30 min后，用紫外/可见分光光度计在765 nm处测定吸光度。根据没食子酸的标准曲线(没食子酸80% MeOH溶液，0.25 ~ 5 μg/mL)定量。结果表示为毫克没食子酸当量(GAE)每克干重。测量重复三次，计算平均值。

自由基清除性能评估(DPPH测定):用DPPH试剂按Mensor所述方法测定抗氧化能力et al。[21]。精油用乙醇稀释到4种不同的浓度，在0.2到2毫克/毫升之间。乙醇中DPPH浓度为45μg/ml。将0.3 mL油溶液(样品)或乙醇(对照)与1ml DPPH混合，在515nm处黑暗20 min后记录吸收。以维生素C为参照物质。DPPH自由基浓度计算公式如下:

DPPH清除活性(%)= (A0 - A1)/A0×100%，其中A0为对照品吸光度，A1为反应混合物或标准品吸光度。这些值已表示为三次复制的平均值。

细胞系及培养条件

HeLa(人宫颈癌细胞)来自叙利亚原子能委员会的人细胞培养实验室。MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)- 2,5 -二苯基溴化四唑)购自Sigma Chemical Co.，细胞在添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI培养基中培养。这些细胞被保存在37°C的潮湿大气中，其中含有5%的二氧化碳。用不同剂量(0、10、15、25和50µg/ml)的镰刀蒿精油处理HeLa和Caco-2细胞。在两个不同的时间间隔(24和48小时)处理HeLa细胞。

MTT法检测细胞活力

HeLa细胞和Caco-2细胞分别接种于不同的96孔培养皿中，HeLa细胞为1.5*104细胞/100 μL/孔，Caco-2细胞为1*104细胞/100 μL/孔。用不同剂量的精油(0、5、15、25和50µg/ml)处理培养的细胞A.falcata，并在两个不同的时间间隔(24和48小时)处理Hela培养的细胞。此外，将DMSO单独添加到另一组细胞中作为溶剂对照(DMSO)。在每孔中加入20 μL 2 mg/mL MTT溶液后，再培养24 h。继续孵育3小时后取出培养基。在每个孔中加入DMSO (150 μL)的混合物，混合以确保甲醛晶体溶解，然后在540 nm处测量吸光度。每个实验均做3个重复，计算油的50% Hela细胞抑制浓度(IC50)。细胞存活率由下式计算:

抑制比(%)= (OD/光密度控制- OD处理)/ OD对照× 100。

细胞毒性表现为油浓度抑制细胞生长50% (IC50值)。

统计研究

实验一式三次。采用方差分析和学生t检验检验数据的统计学相关性。p值<0.05为差异有统计学意义。

结果

挥发油的产率与分离

从空中部分获得的油的产量A.falacta(100g植物经水力蒸馏2.5小时分离得到)为0.367% (w/w)，挥发油密度为0,92gr̸cm³．油是清澈的黄色，气味怡人。

gc - ms分析

采用气相色谱-质谱联用法对黄芪地上部分挥发油进行了分析A.falcata允许鉴定23种化合物(表1)，占石油的92.902%。该油的特点是含氧化合物含量高。精油的主要成分为α - Thujon(32.082%)、trans-2,7-二甲基-4,6-八烯二醇(11.387%)、青蒿酮(11.23%)、3-Thujanone(11.18%)、germacene - d(8.373%)。

表1。气相色谱-质谱分析镰形飞蛾地上部分挥发油的成分

RI:与书目相同的保留指数;质谱:质谱比对鉴别;ST:标准时间保持时间与正品相同

抗氧化活性

总酚评价:总酚含量为32.467(mg GaEs̸g植物油)。

DPPH实验:用DPPH法测定镰形苋油注射液的抗氧化能力见表2。我们的DPPH分析结果表明A.falcata油的抗氧化活性较低(IC₅₀> 2毫克/毫升;2mg/mL时对DPPH的清除能力为31.43%。

表2。DPPH法测定镰刀蒿地上部分挥发油的浓度

细胞生存能力

采用MTT法测定该精油对癌细胞(HeLa和Caco-2)的抑制活性。研究人员测试了不同浓度的油(0、10、15、25和50µg/ml)对癌细胞的抑制作用。宫颈癌细胞和结肠癌细胞对不同浓度的油的治疗表现出显著的剂量依赖性。(表3)为随油浓度增加的细胞死亡率的高度。

表3。用不同浓度精油处理HeLa和Caco-2细胞的细胞死亡率

HeLa细胞也在不同的时间，分别在24和48小时处理。的集成电路₅₀值分别为13.687µg/ml和10.325µg/ml(表4)。

表4。精油处理24小时和48小时HeLa细胞的细胞死亡率

统计研究

宫颈癌和结肠癌细胞对不同浓度的油的治疗表现出显著的剂量依赖性，统计研究表明A.falcata油对HeLa细胞的影响大于Caco-2细胞，HeLa细胞对不同时间油处理的敏感性不表现出时间依赖性。

讨论

许多蓍属由于具有抗氧化、抗痉挛、抗炎、抗痔疮、健胃、镇痛和防腐等多种治疗特性，植物被广泛应用于多种文化的传统医学中[14,15]。当代研究表明，许多Achillea物种也具有抗氧化和抗癌特性[16,17]。特别是，镰形草被描述为对内出血、胃病、胃炎和膀胱结石有有用的作用。许多其他报道显示了镰形镰孢分离成分的抗增殖活性[19-21]。镰形苋注射液已被证实具有抗氧化活性[22]。在植物化学方面，镰形苋已被报道含有多种化学成分，其中大部分是存在于其精油中的挥发性有机化合物。已报道的镰形草中的各种化学成分为单萜类化合物，如桉树脑、樟脑和冰片92.902%。黄酮类化合物也被报道从这种植物。倍半萜内酯，包括3-β-甲氧基-异仲烷内酯(β-tan)，显示出强大的抗肿瘤特性，也有报道从镰刀蒿。从镰形苋中纯化的β-tan在非细胞毒浓度下对人表皮HaCaT细胞的生长有显著的抑制作用。 However, there are no reports on the Anti-oxidant properties of an A.falcata oil, and nor is there any report on the antitumor effect of the oil of A.falcata on cervical cancer and colon cancer cells, Therefore, our aim was to evaluate the antioxidant properties of the oil extract of A.falcata with demonstrating its effect on HeLa human cervical cancer cells and Caco-2 human colon cancer cells. In our study antioxidant activities forA.falcata采用两种方法对挥发油进行了研究，第一种方法是挥发油中总酚的含量(32.467 mg GaEs̸g)，第二种方法是DPPH分析(IC₅₀> 2 mg/mL)，这些方法的结果表明A.falcata油的抗氧化活性较低。

采用气相色谱-质谱联用法对黄芪地上部分挥发油进行了分析A.falcata允许鉴定23种化合物(表1)，占石油的92.902%。该油的特点是含氧化合物含量高。精油的主要成分为α - thujanone(32.082%)、trans-2,7-二甲基-4,6-八烯二醇(11.387%)、青蒿酮(11.23%)、3-Thujanone(11.18%)。这些化合物在其他研究报告的空中部分A.falcata在我们的研究中，Alpha Thujon化合物含量最高，其浓缩物达到35.9224%，其次是青蒿酮化合物，其浓缩物为12.573%，这与它们在油中的浓度不同A.falcata从Jab种植的植物中提取。Kneissé(黎巴嫩)，其中Alpha Thujon为(3.0%)，青蒿酮(5.2%)，[16]和Ceneole 1,8化合物，这是该化合物的主要化合物A.falcata从安塔利亚(土耳其)提取的油(14-24%)[22]，在我们的油中存在较低的浓度(3,0419%)。这些差异可能是由于各种环境因素，如不同的地理位置，土壤性质，气候差异，或收获时间，除了遗传因素。

Caco-2细胞在处理24小时后，Hela细胞在处理24和48小时后，使用MTT法测定细胞活力，该方法测量代谢活性细胞将四唑盐转化为蓝色甲马甲产品的能力，使用ELISA酶标仪在540 nm处记录其吸光度。实验结果表明，该油对HeLa癌细胞的生长抑制作用呈剂量依赖性，时间不依赖性，对HeLa和Caco-2细胞系的抑制作用存在差异。HeLa细胞上的IC50为13.687µg/ml，而Caco-2细胞上的IC50值，即使在本研究中使用的最高浓度为50µg/ml，也未达到，因此需要使用更高浓度的额外实验，或延长该油的处理时间才能准确确定该值。一般来说，可能是由于不同类型的细胞对同一油成分的受体敏感性不同，也可能是由于不同类型的细胞对不同油成分激活不同信号通路的能力不同。

结论

总之，我们的研究提供了证据，油A.falcata具有抗氧化和抗肿瘤特性，而以前的研究从A.falcata并对精油在多个领域的功效进行了研究，目前的研究主要是利用精油蓍属falcata石油支持了这种植物在叙利亚民间医学中的传统用途。

致谢

一个也没有。

利益冲突

作者声明没有什么可透露的。

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