作品简介:肺泡巨噬细胞(AM)在肺免疫系统中起着重要作用。已知香烟烟雾(CS)可抑制抗体的产生,但与AM的相关机制尚不清楚。本研究的目的是研究CS如何通过肺泡巨噬细胞影响抗体的产生。
方法:小鼠每天接触20支香烟,持续10天。支气管肺泡灌洗法获得AM。以绵羊红细胞(SRBC)为抗原,用斑块形成细胞法分析抗体产生。B细胞增殖分析3.H-thymidine合并。流式细胞术分析异硫氰酸荧光素标记SRBC的吞噬活性和AM表面抗原的表达。RT-PCR法检测AM细胞因子和NF-κB mRNA表达。
结果:与未暴露于CS的小鼠相比,暴露于CS的小鼠在诱导期抗体产生减少,但AM的抗体表达期没有减少。与未暴露于CS的小鼠相比,暴露于CS的小鼠AM的Class II和CD80细胞表面抗原降低。与未暴露于CS的小鼠相比,暴露于CS的小鼠AM的吞噬活性和细胞因子/NF-κB mRNA表达降低。
结论:这些结果表明,香烟烟雾对抗体产生的抑制是由于抑制了与抗原呈递相关的表面抗原的吞噬作用和表达。这种AM功能的抑制可能会增加细菌和病毒感染的风险,如COVID-19。
香烟烟雾,肺泡巨噬细胞,吞噬作用,抗体产生,抗原呈递
卷烟烟雾(CS)由吸烟者呼出的主流烟、侧流烟、生长烟、扩散烟、渗出烟、阴燃烟和吹出烟组成[1,2]。CS除主流烟雾外,被称为环境烟草烟雾(ETS)[2]。CS中发现了大约6000种不同的化学物质,其中200种被认为是有毒物质[3]。CS有一个气相和一个粒子相。一氧化碳和氨是气相的一部分。颗粒相包括尼古丁和苯并芘。CS包括多种致癌物和癌症促进物[2,4]。吸烟是癌症发展的主要危险因素,也与感染、慢性肺阻塞性疾病(COPD)、哮喘和支气管炎发病率的增加有关[5,6]。
肺的气体交换区由肺泡组成,肺泡巨噬细胞在肺免疫中发挥重要作用[7]。AM的功能主要是吞噬作用;细胞因子、酶和活性氧中间体的生产;抗原提呈[8,9]。当CS到达肺泡时,它被AM识别并作为一种外来物质合并。因此,CS可能影响AM功能和一些免疫反应。
从20世纪70年代开始就有关于吸烟对免疫系统影响的各种研究报告。有报道称,吸烟者的白细胞数量增加,人类和小鼠的[10]也一样。AM降低了吞噬作用、抗原呈递和炎症细胞因子的产生[4,5,9]。此外,有报道称吸烟可降低脾脏淋巴细胞的增殖和抗体的产生[11,12]。然而,关于CS对免疫功能的影响,目前尚无共识。
在之前的研究中,我们证实了吸烟诱导AM的功能改变[13-17]。然而,CS与AM相关的免疫抑制机制尚不清楚。因此,我们研究了CS对AM抗体产生、吞噬、表面抗原表达和与免疫功能相关的mRNA表达的影响。
动物
C57BL/6雌性小鼠购自日本SLC, Inc.(静冈县,日本)。这些小鼠被安置在京都产业大学(Kyoto Sangyo University, Japan, Kyoto)动物设施的透明塑料笼子里,笼子上有不锈钢丝盖,在标准条件下,黑暗期从晚上8点到早上8点,水和食物是自由提供的。所有小鼠均在8 ~ 10周龄之间。这项研究得到了京都产业大学动物使用和护理委员会的批准。
香烟烟雾暴露
CS组小鼠在10天内使用Hamburg II型吸烟机(Leybold- Heraeus, Hamburg, Germany),每天暴露在20支过滤嘴香烟(参考香烟CORESTA批准的监测No.5)的主流烟雾中。用空气按7:3的比例稀释CS,吞吐量为35ml/2sec/1puff。除暴露于CS外,非CS组小鼠的处理条件与CS组相同。
Broncho-alveolar灌洗(BAL)
最后一次CS暴露后,麻醉下处死小鼠。AM由BAL得到。短暂地;用1ml磷酸缓冲盐水(PBS)冲洗肺5次。回收的BAL液体(BALF)被汇集在一起。BAL细胞在185 × g离心10分钟。将细胞颗粒重悬于0.5 ml培养基[RPMI 1640 (Nacalaitesque, Kyoto, Japan)含有10%胎牛血清(FCS, Hyclone Laboratories, UT, USA), 100 U/ml青霉素(Meiji Seika, Tokyo, Japan)和100μg/ml链霉素(Meiji Seika)]中。取10μl细胞悬液与10μl 0.2%台盼蓝混合,测定细胞总数和活力。AM的纯度和活性分别大于98%和95%。
抗体产生的空斑形成细胞(PFC)测定
为了测量抗体的产生,CS和非CS暴露小鼠静脉注射绵羊红细胞(SRBC, 108细胞/小鼠)作为抗原接种4天后,小鼠脾脏通过塑料盘中的不锈钢网压入。塑料盘中脾脏细胞用RPMI 1640清洗,计数后用培养基悬浮。PFC的测定采用Cunningham and zenberg[18]法。简单地说,将脾脏细胞悬液与5%的SRBC和2.5%的豚鼠血清混合,用培养基调整至最终体积为500 μl。将取自每只小鼠的细胞悬液注射到用石蜡密封的Cunningham室中,在37°C下培养1小时。在显微镜下计数斑块,数据以PFC/10表示6脾细胞。为了测量抗体产生诱导期PFC的数量,小鼠注射SRBC (106细胞/小鼠)和AM (105细胞/老鼠)。注射4天后,用PFC法测定抗体产生。为了测定抗体产生的表达期PFC的数量,采用AM (2 × 105细胞/ml)与脾细胞悬液混合,进行PFC试验。
水溶性卷烟提取物或水溶性卷烟烟气的制备
采集10支卷烟的干叶,105°C水提取1 h,水溶性提取液3000 rpm离心30 min, 0.22μm过滤灭菌。为了制备WSCS,将20支香烟的CS泡在水中。水溶性提取液3000 rpm离心30 min, 0.22μm过滤灭菌。
B细胞增殖
B细胞增殖用3h -胸苷激酶(NEF生命科学产品,MA, USA)掺入分析。将5 × 105个正常小鼠脾细胞培养于96孔平底培养板(Becton Dickinson, MA, US)中,最终体积为200μl,含10μg/ml脂多糖(LPS, E.coli, O127:B8, Nacalaitesque, Kyoto, Japan)和不同浓度的wce或WSCS。培养物在37°C, 5% CO2存在下培养。培养24h后,以18.5kBq的3H-胸腺嘧啶在收获前24小时。将细胞收集到滤纸上,使用液体闪烁计数器(Global Medical instrument, MN, USA)测量合并的3h -胸腺嘧啶的放射性。
表面抗原表达
AM在荧光激活细胞分选(FACS)缓冲液(含100μg/ml CaCl2/ MgCl2, 0.01%叠氮化钠和1% FCS),用0.5 μg异硫氰酸荧光素(FITC)或藻蓝菊素(PE)偶联单克隆抗体(mAb)在4℃下染色45分钟。fitc偶联的抗cd80、抗cd11b、抗cd16 /32和pe偶联的抗II类单抗均来自BD。AM孵育后用FACS缓冲液洗涤2次,再用300 μl的FACS缓冲液重悬。采集了1万个细胞,并使用正向和侧向散点图进行适当的门控。使用FACS Calibur (Becton Dickinson, CA, USA)分析表面抗原阳性细胞。
吞噬活动
点(105细胞/100 μl)与fitc标记SRBC (106细胞/100 μl), 37℃,5% CO存在下培养2为2小时。将fitc标记的SRBC低渗溶血,AM在185 × g离心10分钟后,再悬浮于300 μl的FACS缓冲液中。采集了5000个细胞,并使用正向和侧向散点图进行适当的门控。使用FACS Calibur分析吞噬细胞。
细胞因子和NF-κB mRNA表达
AM的等分线,由BAL (105细胞/100 μl/孔),加入或不加入LPS或Zymosan(终浓度10 μg/ml)培养于96孔平底培养板中,37℃,5% CO存在2.培养24小时后,用酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿法分离总RNA。用MLV逆转录酶(Invitrogen, Carlsbad USA)将总RNA转录为cDNA。寡核苷酸引物来自已发表的IL-1β (250bp)、TNF-α (253bp)、NF-κB (283bp)和β-actin (268bp)的cDNA序列。PCR对β-actin进行28个循环,对IL-1β进行30个循环,对TNF-α和NF-κB进行32个循环,使用以下引物对:β-actin义(5 ' -GCATTGTTACCAACTGGGAC-3 ')和β-actin反义(5 ' -TCTCCGGAGTCCATCACAAT-3 ');IL-1β义(5 ' -AGCTACCTGTGTCTTTCCCG-3 ')和IL-1β反义(5 ' -GTCGTTGCTTGGTTCTCCTT-3 ');TNF-α义(5′-AGTGGTGCCAGCCGATGGGTTGT-3′)和TNF-α反义(5′-GCTGAGTTGGTCCCCCTTCTCCAG-3′);NF-κB义(5´-CTCCCTACGGTGGGATTACA-3)和NF-κB反义(5´-AGCTGCAGAGCCTTCTCAAG-3)。扩增剖面包括94°C变性30秒,引物56°C退火30秒,72°C延伸30秒。PCR产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳后用溴化乙锭可视化。 Cytokine and NF-κB mRNA expression was quantified by Scion imaging.
统计分析
所有数值均以平均值±标准差(S.D.)表示。统计显著性评估使用学生t测试。任何p值小于0.05被认为是显著的。
CS增加了BALF中AM的数量和大小
cs暴露小鼠AM数量显著增加(2.58±0.95×10) (p<0.001)5细胞/小鼠)与非cs暴露小鼠相比(1.25±0.39×105(图1)。与未暴露于CS的小鼠相比,暴露于CS的小鼠的FSC和SSC值均增加。这些结果表明AM的尺寸变大,导致细胞内部结构复杂化。
图1所示。CS对BALF中AM数量和点图的影响。CS暴露后,处死小鼠。AM取自胸腺肺泡灌洗液(BALF)。用台盼蓝染料排除试验测定AM的总数和活力。AM的点图采用FACS分析。NSM:非烟雾暴露小鼠,SM:烟雾暴露小鼠。a)均值±标准差,使用Student 's评定统计学显著性t测试。***p与NSM相比<0.001
CS降低抗体产生诱导期的PFC数量
为了研究CS是否影响抗体的产生,采用PFC法测定了CS暴露小鼠和非CS暴露小鼠免疫SRBC后的脾脏细胞。CS暴露小鼠PFC数量显著(p<0.01)减少(1103±359/10)6(1660±273/10)6(图2a)。由于已有报道表明抗体的产生被CS抑制,我们研究了在抗体产生的诱导和表达阶段CS暴露对AM的影响。CS暴露小鼠诱导期PFC数量显著(p<0.01)减少(211±86/10)6(387±75/10)6(图2b)。但在CS暴露小鼠中,表达期PFC的数量无显著差异(1883±520/10)6脾细胞)和非cs暴露小鼠(1800±473/106(图2c)。
图2。CS对抗体产生的影响。抗体产生用PFC法测定。a) SRBC抗原免疫后第4天进行PFC试验。b)感应阶段;小鼠注射SRBC (106细胞/小鼠)和AM (105细胞/老鼠)。注射4 d后,用PFC法检测抗体产生情况。c)表达阶段;Am (2 × 105细胞/ml)与脾细胞悬液混合,进行PFC试验。NSM:非烟雾暴露小鼠,SM:烟雾暴露小鼠。**p<0.01与NSM比较
wce或WSCS降低B细胞增殖
由于CS在抗体产生的表达期不影响成熟B细胞,我们研究了WSCE或WSCS对LPS刺激下未成熟B细胞增殖的影响。我们发现,在WSCE或WSCS治疗后,B细胞增殖以剂量依赖性的方式减少(图3)。
图3。wce和WSCS对B细胞增殖的影响。脾脏细胞与LPS (10 μg/ml)、WSTE或WSTS共培养。培养24小时后,用3.H-thymidine合并。与对照组相比,**p<0.01, ***p<0.001。
CS降低了表面抗原的表达
由于CS抑制抗体的产生,我们接下来研究了CS对与抗原呈递相关的表面抗原表达的影响。CS暴露小鼠II类和B7.1类抗原阳性细胞百分比(分别为31.35±3.63和52.22±7.42)明显低于未暴露小鼠(分别为53.28±4.98和85.63±2.68)(p<0.001)(图4)。
图4。CS对表面抗原表达的影响。用单克隆抗体流式细胞仪分析AM表面抗原表达。□NSM(非烟雾暴露小鼠),■SM(烟雾暴露小鼠)。***p与NSM相比<0.001
CS降低AM的吞噬活性
由于CS影响抗体产生的诱导阶段,并降低与抗原呈递相关的表面抗原的表达,我们决定研究CS如何影响AM对抗原的吞噬活性。与未暴露于CS的小鼠(40.35±4.85)相比,暴露于CS的小鼠AM的吞噬活性百分率(20.86±4.75)显著降低(p<0.001)(图5)。CS暴露小鼠CD11b抗原阳性细胞比例(20.53±3.21)明显低于未暴露小鼠(57.53±14.95)(p<0.001)(图5d)。而CS暴露小鼠与非CS暴露小鼠CD16/32抗原阳性细胞的百分率(81.79±6.87)无差异(91.23±7.17)(图5d)。
图5。CS对吞噬细胞活性的影响。a)在非cs暴露小鼠AM中观察到fitc标记SRBC的吞噬。b) CS暴露小鼠AM中观察到fitc标记SRBC的吞噬作用。c)利用fitc标记的SRBC进行FACS分析吞噬活性。d)单克隆抗体流式细胞仪(FACS)分析AM表面抗原与AM吞噬相关的表达。□NSM(非烟雾暴露小鼠),■SM(烟雾暴露小鼠)。**p<0.01, ***p<0.001与NSM比较
CS降低细胞因子和NF-κB mRNA的表达
为了确定CS是否影响淋巴细胞和巨噬细胞激活相关细胞因子mRNA的表达,采用RT-PCR分析IL-1β和TNF-α mRNA的表达。LPS刺激下,CS暴露小鼠AM中IL-1β mRNA表达(IL-1β/β-actin)的比值(0.36±0.09)显著低于非CS暴露小鼠(0.66±0.12)(p<0.001)(图6a)。在Zymosan刺激下,CS暴露小鼠AM中TNF-α mRNA表达率(TNF-α/β-actin)也显著(p<0.05)降低(1.25±0.56),低于非CS暴露小鼠(2.14±0.62)(图6b)。
图6。CS对细胞因子和NF-κB mRNA表达的影响。RT-PCR法检测AM细胞因子和NF-κB mRNA的表达。NSM:非烟雾暴露小鼠,SM:烟雾暴露小鼠。*: p<0.05, ***:与NSM相比p<0.001
由于CS暴露后AM中IL-1β和TNF-α mRNA均降低,我们研究了NF-κB mRNA的表达,它与细胞因子基因激活相关。在Zymosan刺激下,CS暴露小鼠AM中NF-κB mRNA表达(NF-κB/β-actin)的比值(0.50±0.15)显著低于非CS暴露小鼠(1.07±0.19)(p<0.001)(图6c)。
在肺泡中,AM在肺免疫系统中起着重要作用。AM的主要功能是吞噬作用;细胞因子、酶和活性氧中间体的生产;抗原提呈[8,9]。CS包含大约6000种化学物质,其中200种是有毒物质[2,3]。CS有气相和颗粒相,在吸烟时被吸入肺部。当CS的异物到达肺的气体交换区时,AM对其进行识别和吸收。因此,CS可能对AM功能和免疫反应产生负面影响。
与未暴露于CS的小鼠相比,暴露于CS的小鼠AM的数量明显增加,这可能是由于CS诱导未成熟单核细胞从外周血转位到肺泡。除了本研究外,也有一些关于CS增加人和动物AM数量的报道[10,19]。
与未暴露于CS的小鼠相比,暴露于CS的小鼠FSC和SSC值均升高,说明CS使AM体积增大,内部细胞结构增大。这些变化可能是由于AM摄入了CS颗粒。此前已有关于吸烟者AM细胞超微结构变化的报道[20,21]。
为了确定CS是否影响抗体的产生,采用PFC法测定了CS暴露小鼠和SRBC免疫的非CS暴露小鼠的脾脏细胞。与未暴露于CS的小鼠相比,暴露于CS的小鼠PFC数量明显减少。我们的研究结果证实了之前的报道,即CS暴露会抑制小鼠和大鼠的PFC反应[11,12]。这些结果与我们目前关于抗体产生减少的报告一致。然而,有一项研究报告了暴露于CS[10]的小鼠的PFC反应增加。那项研究和我们的研究之间的差异可能是实验系统不同。目前,CS暴露对血清IgG、IgA、IgM抗体浓度的影响尚无共识[7,22,23]。
由于抗体产生受到CS暴露的抑制,我们关注抗体产生的诱导和表达阶段。与非CS暴露小鼠相比,CS暴露小鼠诱导期PFC数量明显减少。然而,在CS暴露的小鼠和非CS暴露的小鼠之间,表达期PFC的数量没有差异。这些结果表明,吸烟影响抗体产生的早期阶段,而不是晚期阶段。
在抗体产生的表达期,CS不影响成熟B细胞。因此,我们研究了wce和WSCS对LPS刺激未成熟B细胞增殖的影响。B细胞增殖在wce或WSCS治疗后呈剂量依赖性下降。已有文献报道无烟烟草和烟草糖蛋白(TGP)激活人和小鼠[4]的B细胞增殖,这些结果与我们本研究看到的B细胞增殖抑制不同。结果的差异可能是由于不同的香烟提取方法。
由于暴露在CS中会抑制抗体的产生,我们还研究了CS对与抗原呈递相关的表面抗原表达的影响。II类抗原由抗原提呈细胞表达,而抗原提呈细胞又向T细胞呈递外源抗原。B7.1是抗原呈递的共刺激分子,与T细胞上的CD28结合。与未暴露于CS的小鼠相比,暴露于CS的小鼠II类和B7.1抗原阳性细胞的百分比明显降低。这些结果表明,与抗原呈递相关的表面抗原表达的减少诱导了T细胞抗原呈递和T细胞活化的抑制。在暴露于CS的人和小鼠中发现II类和B7.1抗原阳性细胞减少[17,24,25]。
由于CS影响抗体产生的早期阶段和抗原呈递相关的表面抗原的表达,我们研究了CS对AM对抗原的吞噬活性的影响。与未暴露于CS的小鼠相比,暴露于CS的小鼠AM的吞噬活性百分率明显降低。对AM的吞噬抑制可能是由于CS颗粒饱和了AM的正常吞噬能力。有报道称,暴露于CS的小鼠的AM对细胞吞噬有抑制作用C.albicans和乳胶珠[26,27]。这些结果与我们目前的报告中看到的吞噬活性一致。还研究了与AM吞噬作用相关的表面抗原。CD11b是C3b补体的受体,CD16/32是IgG的Fc受体。这些表面受体作为调理蛋白协助AM的吞噬作用。与未暴露于CS的小鼠相比,暴露于CS的小鼠CD11b抗原阳性细胞的百分比明显降低。而CD16/32抗原阳性细胞比例在CS暴露小鼠与非CS暴露小鼠之间无显著差异。这些结果表明,CS对吞噬活性的抑制是由于CD11b表面抗原的抑制和相应的C3b补体受体活性的降低。CS暴露小鼠中CD11b抗原阳性细胞的减少已被报道过[19]。
为了研究CS是否影响淋巴细胞和巨噬细胞活化相关细胞因子mRNA的表达,采用RT-PCR分析IL-1β和TNF-α mRNA的表达。IL-1β和TNF-α与AM功能的激活和淋巴细胞增殖有关。LPS刺激下,与未暴露于cs的小鼠相比,暴露于cs的小鼠AM中IL-1β mRNA表达率(IL-1β/β-actin)明显降低。在Zymosan刺激下,与非CS暴露小鼠相比,CS暴露小鼠AM中TNF-α mRNA表达率(TNF-α/β-actin)也显著降低。同样的结果(IL-1β和TNF-α的分泌减少)也报道了吸烟者的AM[28-30]。
由于CS暴露降低了IL-1β和TNF-α mRNA的表达,我们关注的是NF-κB mRNA的表达。NF-κB是调节多种细胞因子基因[31]表达的主要转录因子。在Zymosan刺激下,与非CS暴露小鼠相比,CS暴露小鼠AM中NF-κB mRNA表达率(NF-κB/β-actin)明显降低。据报道,我们研究的NF-κB活性和相同细胞因子的mRNA表达在猴子的肺组织在环境烟草烟雾(ETS)暴露后被抑制[32]。然而,也有报道称,ETS和尼古丁暴露导致人类口腔角质形成细胞NF-κB mRNA表达增加[33,34],这些结果与我们研究中看到的NF-κB mRNA表达不同。CS抑制NF-κB可抑制IL-1β和TNF-α mRNA的表达。
综上所述,本研究结果表明,吸烟对AM抗体产生的抑制是由以下方式引起的:1)吞噬抑制和2)与抗原呈递相关的表面抗原表达。这些变化的一个可能后果是细菌和病毒感染的风险增加。
这些结果表明,香烟烟雾对抗体产生的抑制是由于抑制了与抗原呈递相关的表面抗原的吞噬作用和表达。这种AM功能的抑制可能会增加细菌和病毒感染的风险,如COVID-19。
作者声明没有利益冲突,经济或其他方面。
作者感谢Suzette Smiley-Jewell博士对稿件准备的帮助。
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