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摘要

我们之前报道了9-MEL肽，JAL-TA9（YKGSGFRMI）的催化活性，从盒子/ BTG系列的蛋白质区衍生出来。这是较短合成肽的催化活性的第一报告。因此，我们使用“催化剂”（催化肽）作为具有水解酶活性的肽的一般术语。JAL-TA9的NMR研究表明催化活性所需的最小序列是5-MEL肽（GSGFR）。在这项研究中，我们研究了该5-MEL肽对Aβ片段肽，Aβ1-20和Aβ11-29的催化活性，以找到下一个催化剂。鉴定为催化剂的所有肽的活性，特别是GQAYR（BTG3）和GQAFR（BTG4），比GSGFR（TOB1和2）和GSGYR（BTG1和2）的活性更高。这些催化剂的切割机制仍然没有很好地理解并需要进一步调查。尽管如此，5-MEL催化剂是具有肽药物作为治疗阿尔茨海默病（AD）的新策略的吸引力的候选者。

关键字

催化，水解酶活性，Tob/BTG, Box A区，5-mer合成肽，淀粉样蛋白β肽，阿尔茨海默病

缩写：

APPL:淀粉样前体蛋白;β,β淀粉样蛋白;广告:阿尔茨海默病;HSA:人血清白蛋白;组织:三氟乙酸;HPLC:高效液相色谱;NMR:核磁共振

介绍

我们最近报道了一种具有蛋白水解活性的合成九肽JAL-TA9（YKGSGFRMI）。我们的研究是首次报道肽酶。因此，我们使用术语Catalytide（催化肽）来表示较短的蛋白水解肽[1]。JAL-TA9源自Tob1的框A区域，Tob1是由BTG1、BTG2、BTG3/ANA、BTG4和Tob2组成的Tob/BTG家族的成员。Tob/BTG家族的Box-A区域是一个高度保守的同源结构域。根据最近的报道，这些蛋白质在多种细胞类型中显示抗增殖活性，并参与肿瘤发生的调节。然而，Tob/BTG蛋白家族的框A区域的作用仍不清楚[2-7]。

JAL-TA9 (YKGSGFRMI)是第一个被报道具有自身蛋白水解和水解酶活性的Aβ片段多肽的催化剂。此外，核磁共振预测的JAL-TA9的二级结构表明，该5-mer多肽(GSGFR)可能具有与JAL-TA9[1]相似的催化活性。在本研究中，我们评估了来自Tob/BTG家族蛋白Box A区域的4种类型的5-mer合成肽的蛋白水解活性(SFig 1)，以发现新的催化如JAL-TA9，并了解Tob/BTG家族蛋白的水解酶活性。

方法

化学多肽合成

由氟甲基氧羰基氯(Fmoc)保护的l-氨基酸衍生物按照Kojima所描述的方法合成et al。使用自动肽合成器(型号433A，应用生物系统，加州，美国，0.1 mmol级预载树脂)[8]。按生产厂家的方案脱保护后，用反相高效液相色谱(HPLC, Capcell Pak C18柱，SG, 10或15 mm i.d. × 250 mm;资生堂有限公司。从0.1%三氟乙酸(TFA)到50%或70%氯化物的线性梯度洗脱_3.CN含有0.1％TFA超过30分钟。流速设定为3.0或6.0 ml / min。收集原发性峰并冻干。The purity of the synthetic peptides and the progress of the enzymatic reaction were confirmed using an analytical reverse-phase HPLC (Capcell Pak C18 column, MGII, 4.6 mm i.d. × 150 mm; Shiseido Co., Ltd., Japan), and the flow rate was set to 1.0 mL/min. Linear gradient elution was carried out from 0.1% TFA to 70% CH_3.CN含有0.1％TFA。用光电二极管阵列检测器（SPD-M20A; Shimadzu，Japan）监测柱洗脱液。通过电喷雾电离（ESI） - 使用QSTAR精英杂交LC-MS / MS系统[8]，通过电喷雾电离（ESI） - MS）表征每个纯化的肽。

蛋白水解活性分析和裂解位点测定

在37°C磷酸盐缓冲盐水(PBS, pH 7.4)中，在人血清白蛋白(HSA)(最终浓度为0.025% w/v)的存在下，将5-mer多肽(最终浓度为0.2 mM)与Aβ42(最终浓度为0.05 mM)的肽片段单独孵育。使用上述分析高效液相色谱系统，以时间依赖性的方式分析每种反应混合物的10微升。峰收集:将20 μL的反应混合物装入相同的HPLC体系中，220 nm处的峰收集到微管(Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL)中。

冻干后，用36％CH的色谱峰高度确定的适当量_3.加入含0.1% HCOOH的CN，用自动搅拌器搅拌。采用70% CH流动注射法，ESI-MS测定裂解位点_3.在Qstar混合LC-MS/MS系统（ABI）上含有0.1%HCOOH的CN，流速设置为0.1 mL/min[12]。

结果

我们合成了4种5-mer合成肽GSGFR、GSGYR、GQAYR和GQAFR，它们来源于Tob/BTG家族蛋白(SFig)的Box A区。1)用反相制备高效液相色谱法纯化每个肽段，并用光电二极管阵列检测器的分析高效液相色谱系统检查每个肽段的纯度。纯化的多肽分子量经质谱(MS)确证。2).根据这些数据，我们判断所有的多肽都有足够的纯度进行下面的实验。

如前所述，对蛋白水解活性进行了分析[1]。每种肽（终浓度0.2 mM）在37°C条件下，在含有HSA（人血清白蛋白）的PBS中与作为底物的β1-20或β11-29（终浓度0.05 mM）共同孵育，随后在第0、2、4和5天（SFig.3和4）通过分析HPLC分析10μL反应混合物。Aβ肽的片段肽Aβ1-20和Aβ11-29在含有HSA（sfig3）的PBS中是稳定的。通过降低底物浓度来评估蛋白水解活性。对于GSGFR和GSGYR，Aβ1-20和Aβ11-29的峰高略有降低；然而，即使在第2天的样品中，色谱图上也没有观察到新的峰值，这表明GSGFR和GSGYR的蛋白水解活性非常弱（图1a和1b）。另一方面，GQAYR和GQAFR在2天内完全裂解Aβ1-20，并观察到几个新的峰值（图1c和1d）。

图1。反应混合物色谱图。(a) GSGFR， (b) GSGYR， (c) GQAYR或(d) GQAFR与(左)a β1-20或(右)a β11-29在含HSA的PBS中共孵育，在0(上)和2天(下)分析10 μL的反应混合物。

图2显示了4种肽对Aβ1-20和Aβ11-29的下降比率。这些数据表明GQAYR和GQAFR对Aβ1-20和Aβ11-29的蛋白水解活性强于GSGFR和GSGYR。

图2。将每种底物的比例降低与5-MEL肽共孵育。通过在HPLC分析中第0天和第2天获得的峰值高度来计算降低比率

然后我们用GQAYR或GQAFR鉴定了Aβ1-20和Aβ11-29的裂解位点。5-mer多肽和底物的峰值均随时间的变化而降低。当a β1-20作为底物时，在第2天几乎消失;但GQAYR和GQAFR仍然存在。因此，我们继续孵育(SFig。另外12个(A1-10)和4个(C1-4)肽段分别来自Aβ1-20和GQAYR(图3a)。对于GQAFR, 12个(A1-7)和5个肽段(C1-5)也分别被鉴定为来自Aβ1-20和GQAFR的片段肽段(图3b)。Aβ1-20对应GQAYR和GQAFR的裂解位点如图3c所示。这些数据表明，GQAYR和GQAFR具有自身蛋白水解活性，并能裂解类似于JAL-TA9[1]的Aβ1-20。

图3。Aβ1-20裂解位点的测定。第5天，注入20μL反应混合物，收集所有峰。Aβ1-20与（A）GQAYR或（b）GQAFR共孵育。（c） 裂解位点

接下来我们鉴定了Aβ11-29的裂解位点。8个片段(A1-7)和4个片段(C1-4)分别来自Aβ11-29和GQAYR(图4a)。对于GQAFR, 12个(A1-7)和4个肽段(C1-4)也分别被鉴定为来自Aβ11-29和GQAFR的片段肽(图4b)。Aβ11-29对应GQAYR和GQAFR的裂解位点如图4c所示。有趣的是，在上述病例中均未发现HSA衍生的碎片峰。GSGFR和GSGYR也表现出蛋白水解活性(SFig。5)．

图4。Aβ11-29裂解位点的测定。第5天，注入反应混合物20 μL，收集所有峰。a β1-20与(a) GQAYR或(b) GQAFR共孵育。(c)解理网站

讨论

阿尔茨海默病(Alzheimer 's disease, AD)是由Aβ42聚集和积累引起的最常见的年龄相关性神经退行性疾病。人们已经进行了许多试验来开发治疗AD的药物，但结果并不令人鼓舞[9-14]。因此，治疗AD急需新的有效药物。在本研究检测的4种多肽中，GQAYR和GQAFR对Aβ片段的切割能力很强，特别是Aβ1-20，切割位点较多(图3和图4)，表明这些5-mer多肽能够切割Aβ42。

Tob/BTG蛋白家族的抗增殖能力是由于它们与细胞中的靶蛋白相关。Tob/BTG N端区域的高度保守区域框A介导了大多数Tob/BTG相互作用。然而，没有研究报道Tob/BTG家族蛋白本身或其片段肽的水解酶活性。在本研究中，我们发现来自Tob/BTG家族蛋白框A区域的合成5-聚体肽具有蛋白水解活性；尤其是来自BTG3的GQAYR和来自BTG4片段肽的GQAFR显示出具有许多切割位点的有效活性（图2）（图3和图4）。这些结果表明，Tob/BTG家族蛋白也可能具有以前未知的蛋白水解活性。

其蛋白水解活性的机制尚不清楚。为了阐明这一机理，需要进行立体结构分析。因此，我们尝试预测二级结构在网上在使用MM2和MMFF94程序的个人计算机上。GSGFR和GSGYR的立体结构彼此相似。此外，三个氨基酸的位置，arg-phe / tyr-ser似乎是关闭（Sfig。6a和b）。另一方面，立体结构和Arg的位置，PHE / Tyr-Gln也相互相似，但与GSGFR和GSGYR（SFIG.6C和D）不同。这些结果可能涉及蛋白水解活性（图2）。我们目前正在使用NMR分析投资5-MER肽的立体结构。

结论

我们得出结论，来自Tob/BTG家族蛋白Box A区域的5-mer多肽可切割Aβ片段多肽，并被归类为催化肽。因此，GQAYR和GQAFR也可以被归为catalyst。与JAL-TA9一起，这些催化物可以被证明是预防和治疗AD的有吸引力的候选药物。

声明

数据和材料的可用性

本研究中生成或分析的所有数据均包含在本文中。

利益争夺

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

T. A.和R. N.负责实验设计和数据解释。T. A.，R. N.，Y. H.和M.和M. S.主要促成了撰写和审查手稿。R. N.和M.K.进行所有实验，特别是HPLC分析和裂解位点的测定。R. N.和M. K.促成了MS分析。M. K.和R. N.使用NMR和计算机建模有助于结构分析。

确认

这项工作得到了日本科学促进协会(JSPS)科学研究资助计划(KAKENHI)的部分支持，资助号为15K07908，以及冲绳科学技术研究所(OIST)概念验证(POC)计划。

查看补充数据

参考文献

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