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摘要

背景:体外和体内研究表明，复方cantharis (CCI)可逆转三阴性乳腺癌(TNBC)对多西他赛(Doc)的化疗耐药。

摘要目的:探讨CCI对TNBC的影响。

材料与方法:建立人TNBC细胞MDA-MB-231、MDA-MB-468耐药细胞模型。将小鼠分为溶剂对照组(Con)、Doc (5 μmol/L)、CCI (10 μmol/L)和Doc + CCI 4组。通过MTT、流式细胞仪和Tunel检测各药物对TNBC增殖和凋亡的影响，通过western blot (WB)、MDC染色和免疫荧光检测各药物对TNBC自噬水平的影响。然后观察改变Beclin-1和miR-520d的表达水平对三阴性乳腺癌细胞凋亡和自噬水平的影响。将2只BALB/CL裸小鼠(MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-468/Doc)耐药模型分为4组(n = 7):对照组(Con)、Doc (10mg/kg)、CCI (15.06g/kg)和Doc + CCI。采用尾静脉给药，每2 d给药1次，连续25 d。免疫组化检测细胞增殖和凋亡。通过WB和RT-PCR检测细胞自噬相关蛋白和miR-520d。

结果:Doc + CCI可进一步诱导耐药细胞凋亡，下调LC3和Beclin-1表达，降低自噬水平(p < 0.01)。MiR-520d可抑制Beclin-1的表达，增加耐药细胞对Doc的敏感性(p < 0.01)。动物实验结果表明，CCI能增强TNBC细胞对Doc的敏感性和对肿瘤细胞的抑制作用。Doc + CCI可显著上调凋亡蛋白caspase3、Bax和miR-520d的表达，下调自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的表达(p < 0.001)。

结论:CCI可能通过miR-520d/Beclin-1信号轴抑制TNBC细胞自噬水平，成为一种有希望的化疗耐药药物。

关键字

复方眼角，三阴性乳腺癌，自噬，化疗耐药，miR-520d/Beclin-1

简介

乳腺癌是世界上最常见的女性癌症，每年大约有50万人死于乳腺癌。三阴性乳腺癌(three -negative breast cancer, TNBC)是指雌激素(ER)、孕酮(PR)和人表皮生长因子(HER-2)受体检测通常为阴性的乳腺癌，占所有乳腺癌病理类型的15%，预后差，复发率、转移率和死亡率高[2,3]。由于内分泌治疗对TNBC疗效较差，化疗被认为是一种重要的治疗方法[4,5]。目前常用的乳腺癌化疗药物有紫杉烷(紫杉醇、多西紫杉醇、白蛋白合成紫杉醇)[6]、蒽环类(阿霉素、表柔比星、各种阿霉素脂质体)、抗代谢药物(卡培他滨、吉西他滨)[7]。值得注意的是，TNBC是一种容易产生化疗耐药细胞，严重影响乳腺癌治疗方案[8]的疗效。近年来有报道称，长期应用多西他赛(docetaxel, Doc)可诱导TNBC细胞自噬水平异常升高，从而诱导细胞耐药，而自噬水平降低可增强肿瘤细胞对Doc的敏感性[9,10]。

miRNA是一种长度为19-25个核苷酸的非编码小分子单链RNA。miRNA通过与下游靶基因mRNA 3'-非翻译区(3 ' -UTR)的特定序列互补结合，可降解或抑制蛋白质的翻译过程，从而在转录后水平调控靶基因的表达。近年来，miRNA[11]等非编码RNA在自噬调控中的作用受到越来越多的关注。miRNA通常参与许多生物学过程，包括增殖、发育、体内稳态、免疫、代谢、凋亡和癌症[12-19]。有研究表明，miRNA可通过调节自噬水平影响肿瘤细胞的耐药性[20,21]。自噬是细胞的一种自我保护机制。通常，当细胞处于代谢压力状态时，细胞最终会通过吞噬作用降解细胞质蛋白或细胞器等细胞成分，产生营养物质，维持细胞生存[22]。然而，最近的研究表明，大规模持续的自噬也可导致细胞死亡并抑制肿瘤。自噬(Autophagy)不仅能维持细胞存活，还能导致细胞死亡，已经成为癌症研究和治疗的热点[23]。

中药对缓解恶性肿瘤术后并发症、减少放化疗毒副作用有良好的作用。复方cantharis注射液(CCI)，一种中草药，又称爱地注射液(Z52020236，中国食品药品监督管理局)，其有效成分为斑毛(斑蝥素)、人参(人参)、黄芪(黄芪甲苷)和刺五加(Eleutherococcus senticosus)．CCI是一种多靶点中药，具有清热解毒、祛瘀化瘀的作用。临床用于妇科恶性肿瘤、原发性肝癌、肺癌、直肠癌、恶性淋巴瘤等的治疗。CCI也是TNBC常用的化疗辅助药物，其主要成分是斑蝥素[25,26]。越来越多的临床试验评价CCI在化疗中的作用已被报道。目前，复方斑蝥素抑制自噬抗tnbc耐药活性的机制尚未见报道。我们前期研究发现CCI可抑制TNBC细胞增殖，显著下调Beclin1蛋白表达，降低自噬水平;我们进一步将CCI和Doc应用于TNBC细胞，结果显示两者联合使用对细胞增殖的抑制作用强于单独使用Doc。为了阐明复方斑鸠素对TNBC的作用机制，我们利用miRNA微阵列检测CCI处理前后TNBC耐药细胞，发现CCI可显著上调miR-520d水平，表达差异达8.3倍[27]。我们还证明，miR-520d通过作用于Beclin-1 3 ' UTR区域，抑制Beclin-1的表达，增加耐药细胞对Doc[28]的敏感性。 This study observed the pharmacological effect of compound cantharides on the reversal of the drug resistance of TNBC. This study also sought to explore whether miRNA autophagy signal axis is the key mechanism underlying the capacity of CCI to reverse the drug resistance of TNBC.

材料和方法

材料

试剂和仪器

DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Gibco公司。复方cantharis注射液(CCI)，购自贵州益百药业有限公司。多西他赛(Doc)由MedChemExpress(美国)提供。MTT试剂盒购自生工生物。流式细胞凋亡试剂盒、MDC染色试剂盒购自江苏开基生物科技有限公司。Tunel试剂盒由罗氏公司提供。Beclin-1抗体、LC3抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔第二抗体购自英国Abcam公司。美国ThermoFisher公司提供了Trizol试剂、TaqMan miRNA逆转录试剂盒、TaqMan miRNA定量PCR试剂盒和Lipofectamine 2000转染试剂盒。Takara 6210A逆转录试剂盒和实时(RT)定量聚合酶链反应(qPCR)试剂盒由日本Takara公司提供。MiR-520d模拟物和抑制剂购自Qiagen(美国)。 The PCR amplicon was provided by Guangzhou Ruibo Biotechnology Co., Ltd (Patent No: ZL 201010183196.4). Electrophoresis, transmembrane and gel imaging systems were bought from Bio-Rad (USA).

动物

BALB/CL型裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司动物中心(许可证号:030831)。SCXK, 2007-0005, SPF级)，3~4周龄，体重16~ 22g，雌性。小鼠培养于上海中医药大学附属普陀医院动物室，恒温25~27℃，恒湿(45% ~ 50%)，新鲜空气，无特殊病原体(SPF级)除尘除菌的繁育室。所有的动物实验都符合“到达”指南。

方法

细胞培养

MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞株购自中国科学院细胞库。在实验室诱导获得相应的Doc耐药细胞株MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-468/Doc。所有细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，37℃，5% CO中培养₂大气条件。取对数生长期细胞，在10 nmol/L Doc培养基中培养2~3个月，构建Doc耐药细胞株。为维持MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-468/Doc的耐药表型，始终在耐药细胞培养液中加入多西他赛(最终浓度为2 μm)，实验前一周停止给药。

MTT法检测细胞增殖

细胞大小为5 × 10^3.细胞/孔密度接种于96孔板。待细胞完全贴壁后，分组加入相应药物，置于37℃，5% CO培养箱中培养₂)．48 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液(10 μL)，连续培养4 h。吸去上清后，每孔加入DMSO (100 μL)。摇匀1分钟，使培养液充分混合。MTT还原产物完全溶解后，以492 nm为实验波长，630 nm为参考波长，酶标仪测定产物的吸光度。通过计算细胞存活率，确定药物对50%细胞杀伤的半数抑制浓度(IC50)。

流式细胞术检测细胞凋亡

对数生长期靶细胞用胰蛋白酶消化后，细胞悬液在完全培养基中重悬，传代至6孔板中。每孔密度为1 × 10⁶．第2天，按组加入相应药物，培养48 h后，收集各处理组细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗一次。用1xBinding缓冲液悬浮于流式检测试剂盒中，细胞密度约为2~5 × 10⁵细胞/毫升。加入5 μL Annexin V-FITC，室温避光孵育10~15 min。用200 μL 1xBinding缓冲液洗涤细胞，1000 rpm离心4 min，弃上清。加入碘化丙啶(10 μL)前，用190 μL 1xBinding缓冲液重悬细胞。最后用流式细胞仪对结果进行分析。

Tunel检测细胞凋亡

攀爬后用4%多聚甲醛固定细胞30 min。PBS轻轻冲洗细胞3次(5min /次)。其余操作按照Tunel凋亡检测试剂盒进行。值得注意的是TdT酶与荧光素鞭毛的稀释比^TMTdT标记反应Mix为1:12。用DAPI在室温下再染色3~5 min，然后用抗淬火封片。荧光显微镜下观察凋亡细胞数量。

Western blot检测蛋白表达

各组蛋白用RIPA缓冲液提取。采用BCA试剂盒检测各组总蛋白浓度。调整蛋白浓度后，用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离等效蛋白，通过湿旋转法转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。然后用5%脱脂牛奶在室温下封闭PVDF膜1 h，加入第一抗体后，在4℃下封闭PVDF膜过夜。第二天，丢弃第一个抗体。然后在PVDF膜上加入HRP标记的山羊抗兔第二抗体，室温封膜1 h后，滴加显色液显色。然后，利用凝胶成像系统对蛋白质条带进行成像。

单核细胞尸体蛋白(MDC)染色检测细胞自噬

爬片后用不同药物处理细胞，培养24 h，用PBS轻轻冲洗2~3次。将MDC母液用培养基1:10稀释后加入细胞中。暗孵育30~45 min, PBS洗3次。加入抗荧光猝灭片后，在荧光显微镜下观察细胞内自噬体的图像。对照组(Con)、CCI组和CCI + miRNA-520d抑制剂组采用相同方法。

免疫荧光法检测自噬相关蛋白LC3

细胞培养至约80%的密度。计数细胞，用6孔板接种。接种密度为5 × 10⁴细胞/。这些细胞在细胞培养箱中培养一夜。然后根据分组在细胞中加入相应的药物。细胞培养48 h, 4℃离心。细胞在4%多聚甲醛中4℃固定15min，包蜡切片(4 μ m)，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化。PBS室温下冲洗细胞3次(3 min/次)。用1%牛血清白蛋白(BSA)封闭细胞30min，然后轻轻去除BSA。免疫组化笔将组织圈得尽可能小，加入预制备的第一抗体(1:200)，4℃孵育过夜。PBS清洗3次(3 min/次)。然后擦拭纸巾周围的PBS。 Again, the tissue was circled as small as possible with immunohistochemistry pen, and the pre prepared fluorescent secondary antibody (1:100) was added, and incubated in a wet box at room temperature for 60 min (keep away from light). Repeated the above mentioned operation of PBS cleaning and tissue circling, and then added 4′6-diamindino-2-phenylindol (DAPI) (diluted 10 times), incubate at room temperature in dark for 3 min (no more than 5 min), and then observed with confocal microscope.

实时荧光定量PCR检测miRNA表达

用Trizol提取细胞总RNA。然后使用TaqMan miRNA逆转录试剂盒进行逆转录，每个miRNA的相对量根据细胞中U6 snRNA的含量而定。采用PCR技术扩增，根据试剂盒说明书使用TaqMan miRNA qPCR试剂盒或RT qPCR试剂盒进行定量分析。实验所用引物均由广州瑞博生物科技有限公司设计合成(专利号:ZL 201010183196.4)。

动物实验

适应1周后，乳腺癌细胞悬液密度为5 × 10⁶将细胞植入裸鼠右腋窝皮下。后肿瘤生长至100 ~ 200mm^3.这些动物被随机分为四组。按药物分组，分别采用尾静脉给药:A、溶剂对照组(Con);B, Doc(10毫克/公斤);C, CCI(15.06克/公斤);D、Doc + CCI。每2天给药1次，持续25天。每3 d分别测量肿瘤体积和动物体重，并记录数据。肿瘤体积(TV)的计算公式为:TV=1/2 × a × b²，其中a、b分别代表长度、宽度。采用WB和免疫组化法检测动物模型中细胞凋亡和自噬相关蛋白的表达。RT-PCR检测动物模型中miR-520d和Beclin-1的变化。

统计分析

采用SPSS 24.0和GraphPad Prism 8分别对实验数据和曲线图进行分析。所有实验数据均以均数±标准差(SD)表示，组间差异采用单因素方差分析(One Way ANOVA)检测。的统计显著性水平p< 0.05为本研究接受。

结果

检测CCI、Doc及其联合对TNBC耐药细胞增殖、凋亡的影响

由图(图1A)可以看出，耐药细胞组MDA-MB-231/Doc (IC50 = 38 μmol/L)和MDA-MB-468/Doc (IC50 = 60 μmol/L)细胞的增殖率明显高于MDA-MB-231 (IC50 = 3.8 μmol/L)和MDA-MB-468 (IC50 = 6 μmol/L)。MDA-MB-231和MDA-MB-468的光密度值随Doc浓度的增加明显降低，而MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-468/Doc的光密度值变化不显著。这一结果表明耐药细胞已经成功构建(p< 0.01)。MTT法检测CCI、Doc及CCI、Doc联合对TNBC耐药细胞增殖的影响。如图1B所示，Doc和CCI联合使用对MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-468/Doc对多西他赛的敏感性有增效作用(p< 0.01)。与单一药物相比，联合用药对耐药菌株增殖的抑制作用更大。同时，流式细胞仪检测结果如图(图1C&D)。与对照组相比，单独使用CCI和DOC可显著增加MDA-MB-231和MDA-MB-468耐药株的细胞凋亡率(MDA-MB-231/ DOC、MDA-MB-468/ DOC) (p< 0.001)。此外，CCI和DOC的联合作用进一步促进了细胞凋亡(p< 0.001)。Tunel检测也有相同的实验结果，如图(1E)所示，与对照组相比，Doc组和CCI组、Doc + CCI组耐药株具有更强的黄绿色荧光。进一步(图1F)显示，联合用药组MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-468/Doc耐药株中凋亡细胞更多，说明Doc与CCI联合用药可进一步诱导细胞凋亡(p< 0.001)。

图1:成功构建MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-468/Doc耐药细胞;B: MTT法检测药物对MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-468/Doc增殖的影响;C:流式细胞术检测药物对MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-468/Doc细胞凋亡的影响;D:统计数据;E:采用Tunel法检测药物对细胞凋亡的影响;F:统计数据;与诈骗相比,^＊P< 0.05,^**P< 0.01,^＊＊＊P< 0.001;与医生+ CCI相比,^{# # #}P< 0.001。

检测CCI、Doc及其联合对TNBC耐药细胞自噬的影响

Western blotting显示MDA-MB-231/Doc、MDA-MB-468/Doc及不同处理组细胞自噬相关蛋白LC3和Beclin-1水平低于对照组，而P62水平高于对照组，提示LC3和Beclin-1的下调可能是Doc和CCI抑制TNBC细胞自噬的主要原因之一(图2A&B)。此外，DOC和CCI联合可更显著降低TNBC耐药细胞的自噬水平(p< 0.001)。MDC染色结果(图2C&D)显示，与对照组相比，CCI + DOC联合组耐药菌株绿色荧光强度减弱，自噬体明显减弱(p< 0.001)，说明CCI与DOC联合可抑制MDA-MB-231/ DOC和MDA-MB-468/ DOC的自噬，且抑制作用比单独CCI或DOC更显著。免疫荧光检测结果(图2E&F)显示，Doc + CCI、CCI和Doc中耐药株的荧光活性和自噬相关蛋白LC3水平低于对照组，而Doc + CCI组耐药株的荧光强度和自噬相关蛋白水平高于Doc和CCI单施组(p< 0.001)。提示联合用药可增强乳腺癌细胞对Doc的敏感性，显著降低LC3的表达，降低自噬水平。

图2:western blotting检测药物对自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的影响;B:统计数据;C:通过MDC染色检测药物对细胞自噬的影响;D:统计数据;E:免疫荧光法检测药物对自噬相关蛋白LC3的影响;F:统计数据;与诈骗相比,^＊＊＊P< 0.001;与医生+ CCI相比,^{# # #}P< 0.001。

miR-520d在CCI逆转TNBC耐药中的作用

本研究采用MTT法检测miR-520d在CCI逆转TNBC耐药中的作用(图3A)。MTT法观察到MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-468/Doc菌株中耐药株的细胞活力较对照组明显下降。反之，如果使用miR-520d的抑制剂来抑制miR-520d的水平，耐药菌株的细胞活力比不使用抑制剂的CCI组提高。MDC染色结果显示，CCI组自噬水平低于对照组，CCI +抑制剂组自噬水平高于对照组(p< 0.001)(图3B&C)。免疫荧光结果也显示，抑制miR-520d可增加自噬小体数量(图3D)。提示下调miR-520d可增加耐药细胞的自噬能力。LC3结果显示，低表达miR-520d组自噬相关蛋白LC3高于对照组(p< 0.001)(图3F)。上述结果表明，下调miR-520d可抑制TNBC耐药细胞自噬，显著降低CCI促进的TNBC耐药细胞对Doc的敏感性。

图3:MTT法检测CCI (10 μmol/L)和CCI (10 μmol/L) + miR-520d inhibitor (100 nmol/L)对细胞增殖的影响;B:采用MDC染色法检测CCI (10 μmol/L)和CCI (10 μmol/L) + miR-520d inhibitor (100 nmol/L)对细胞自噬的影响;C:统计数据;D:免疫荧光法检测CCI (10 μmol/L)及CCI (10 μmol/L) + miR-520d inhibitor (100 nmol/L)对自噬相关蛋白LC3的影响;艾凡:统计数据;与Con组相比，^＊＊＊P< 0.001。

在耐药细胞株中检测Doc下miR-520d和Beclin1过表达的差异

RT-PCR检测TNBC细胞耐药和非耐药细胞中miR-520d的表达水平。MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-468/Doc中miR-520d表达水平显著升高(p<0.01)低于MDA-MB-231和MDA-MB-468，说明miR-520d在耐药株中的表达水平明显低于非耐药细胞(图4A)。这可能提示肿瘤细胞的耐药与miR-520d的低表达有关。通过MTT实验观察到MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-468/Doc两株耐药株中，与对照组相比，过表达miR-520d后耐药株细胞活力下降。与对照组相比，Beclin1-OE组增加了耐药细胞的活力。当Beclin-1和miR-520d同时上调时，与过表达miR-520d组相比，耐药细胞活力增加。因此，过表达miR-520d被认为会降低MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-468/Doc细胞的活力(图4B)。另一方面，这可能意味着提高miR-520d的表达水平可以逆转TNBC耐药细胞对Doc的耐药性。在Doc的作用下，各组细胞凋亡率均较未受Doc影响的组升高(p< 0.001)。过表达miR-520d组细胞凋亡率最高。与过表达miR-520d组相比，同时上调miR-520d和Beclin1后，凋亡率略有下降(图4C&D)。

图4:real-time PCR检测TNBC中miR-520d的表达B: MTT检测miR-520d对Doc作用下细胞凋亡的影响;C:流式细胞术检测耐药细胞株under Doc中miR-520d和Beclin1过表达的差异。D:统计数据;与诈骗相比,^＊＊＊P< 0.001。

Western blotting检测miR-520d对细胞凋亡及自噬相关蛋白表达的影响

Western blotting检测过表达Beclin1和miR-520d后自噬相关蛋白的表达水平。与亲本菌株相比，耐药菌株自噬相关蛋白表达增加，而p62表达减少(图5A&B)。Beclin1和LC3水平显著升高(pmiR-520d过表达后<0.001)较对照组降低。这表明上调miR-520d可以降低耐药细胞的自噬水平。此外，当Beclin1和miR-520d同时上调时，与对照组相比，Beclin1和LC3水平也显著升高(p<0.001)(图5C&D)，说明miR-520d可能通过Beclin1调控耐药细胞自噬水平。

图5:Western blotting检测自噬相关蛋白的表达水平。B:统计数据。C: Western blotting检测miR-520d对自噬相关蛋白表达的影响。D:统计数据;与诈骗相比,^＊＊＊P< 0.001。

MDC染色和免疫荧光检测细胞自噬

MDC染色结果(图6A&B)显示，与对照组相比，Beclin1过表达组(Beclin1- oe)的自噬小体显著(p<0.001)增强，提示过表达Beclin1可增强耐药细胞的自噬能力。同时，过表达miR-520d (miR-520d mimics)组自噬小体减少，提示过表达miR-520d可以抑制耐药细胞的自噬能力。此外，当Beclin1和miR-520d同时上调时，自噬能力较对照组有一定程度的提高(p< 0.001)。这说明miR-520d可以通过Beclin1调控耐药细胞的自噬水平。免疫荧光实验(图6C&D)显示，自噬相关蛋白LC3被显著抑制(p<0.001)，而细胞自噬水平降低。进一步的实验表明，过表达miR-520d可以抑制TNBC耐药细胞的自噬能力。且耐药细胞中Beclin1过表达或Beclin1与miR-520d同时上调，而自噬相关蛋白LC3在耐药细胞中显著(p<0.001)与对照组相比增加。

图6:MDC染色检测自噬小体形成(Con:对照组、Beclin1- oe: Beclin1过表达组、miR-520d mimic/Con: miR-520d过表达对照组、miR-520d mimic/ Beclin1- oe: miR-520d和Beclin1同时上调组)。B:统计数据。C:免疫荧光检测miR-520d对自噬相关蛋白LC3的影响。D:统计数据;与诈骗相比,^＊＊＊P< 0.001。

动物实验

动物实验结果显示，与对照组相比，Doc + CCI组裸鼠肿瘤体积明显减小，说明CCI能增强TNBC细胞对Doc的敏感性，增强对肿瘤细胞的抑制作用(图7A&B)。免疫组化结果显示，与对照组相比，Doc和CCI能促进细胞凋亡，下调Ki67的表达(p< 0.001)(图7C&D)。Western blotting检测Doc、CCI及其联合对细胞凋亡和自噬相关蛋白的影响(图7H)。结果显示，Doc和CCI可显著上调凋亡蛋白caspase3和Bax的表达，下调抗凋亡蛋白BCL-2、自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的表达(p< 0.001)。RT-PCR结果显示，与对照组相比，CCI可上调miR-520d的表达，下调Beclin-1的表达(p< 0.05)。然而，当Doc和CCI联合应用于两种耐药动物模型(MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-468/Doc)时，可以显著上调miR-520d的表达，下调Beclin-1的表达(p< 0.001)(图7G)。

图7:CCI (15.06g/kg)、Doc (10mg/kg)及其配伍对动物肿瘤的抑制作用。(A:各组肿瘤大小比较;B:肿瘤体积随时间的变化;C: KI67检测增殖;D: Tunle检测细胞凋亡;e和f:统计数据;G: RT-PCR检测两种耐药动物模型中miR-520d和Beclin-1;H: western blotting检测两种耐药动物模型细胞凋亡和自噬相关蛋白;我:统计数据;与诈骗相比,^＊P< 0.05,^**P< 0.01,^＊＊＊P< 0.001;与Doc + CCI相比，^＃P< 0.05,^{# #}P< 0.01,^{# # #}P< 0.001)。

讨论

事实上，中医药在乳腺癌的辨证治疗中已经显示出独特的优势，可以显著提高[29]患者的生活质量和延长生存期。中医认为，乳腺癌是由情绪失常、肝气郁结、经络堵塞、气机阻滞、痰瘀内因、气血长期积存所致。虽然乳腺癌的病机复杂，但痰瘀阻络、热毒是该病的主要病因。正气虚弱是乳腺癌复发转移的基础，而毒痰瘀则是乳腺癌复发转移的关键因素。因此，三tnbc的治疗以毒虚痰瘀理论为基础，被认为是中医预防[31]复发转移的一种治疗方法。中医药治疗对乳腺癌术后并发症的防治及减轻放化疗毒副作用具有重要的临床意义。在这些治疗方案中，CCI是TNBC常用的辅助化疗方案。值得注意的是，CCI由斑蝥素、人参、黄芪甲苷和黄芪提取物组成Eleutherococcus senticosus．通常，它被称为现代配方的纯中药制剂。在方剂中，斑蝥素以驱邪为主要功能，是君主药。斑蝥素中含有斑蝥素，是具有抗肿瘤活性的主要活性成分。同样，人参和黄芪是处方中的其他主要药物。为了增强这两种药物的强化作用，eleutherococcus senticosus通常被用作“适应原”，如人参根。在功能上具有破血化瘀、清热解毒、攻毒蚀痛、强身健体、提高免疫力、激活抑癌基因、杀灭癌细胞、对化疗有协同辅助作用。CCI的主要成分斑蝥素具有直接杀伤肿瘤细胞的作用。斑蝥素提取物的抗肿瘤活性成分为去甲斑蝥素，对乳腺癌细胞[32]有抑制作用。具有抗癌而不抑制骨髓的特点，能抵抗放化疗时血细胞的下降。临床观察表明，复方眼角膏对TNBC有一定疗效，能有效防止术后[33]复发转移。现代医学研究证实，CCI可通过多途径、多靶点对恶性肿瘤发挥治疗作用。包括干扰肿瘤细胞的DNA和RNA生物合成，直接杀伤肿瘤细胞，抑制癌基因表达，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤血管生成，逆转多药耐药，保护骨髓，调节免疫，增强淋巴因子激活的杀伤细胞和自然杀伤细胞[34]的活性。然而，逆转耐药性被认为是复方斑蝥素抗肿瘤作用的机制之一。因此，本研究进一步阐明了逆转耐药的具体机制。

自噬过程主要受自噬相关基因的调控。Beclin-l是一种激活或启动自噬的标记蛋白。通过与不同的自噬相关蛋白结合形成复合物，参与自噬的形成和成熟。自噬过程中，Beclin-1的表达水平有升高[35]的趋势。Beclin-1可通过调节自噬参与肿瘤细胞的耐药。在生理上，Doc诱导内质网应激，通过c-Jun氨基末端激酶-1介导Bcl-2磷酸化，从而释放Beclin1促进细胞自噬。释放的Beclin-1与Bax联合可抑制凋亡，使肿瘤细胞抗凋亡，最终形成肿瘤耐药[36]。已经证实降低乳腺癌细胞中Beclin-1的表达水平可以提高其对[37]的化学敏感性。因此，研究Beclin-1在乳腺癌化疗耐药中的表达及调控机制具有重要意义。

本研究以一株Doc耐药的TNBC耐药细胞株为研究对象，检测CCI、Doc及其联合使用对TNBC耐药细胞株增殖和凋亡的影响。结果显示，与对照组相比，联合用药显著抑制了TNBC耐药细胞株的增殖，细胞凋亡明显增加。同时，Doc与CCI联合的TNBC耐药细胞株自噬水平降低，miR-520、Beclin-1表达下调。提示CCI可能通过抑制TNBC耐药细胞株的过度自噬来逆转耐药。

最近，科学家们对miRNA在调控肿瘤自噬[38]中的作用表现出了极大的兴趣。已经确定miRNAs对肿瘤自噬的调控是通过转录后调控自噬相关基因的表达水平。例如，外分泌miRNA-126可以破坏胰岛素受体底物(IRS)/Glut-4信号转导，激活amp -活化蛋白激酶(AMPK)/自噬通路，稳定所产脂肪细胞中缺氧诱导因子1- α (HIF-1α)的表达。miRNA-126的抑制作用在活的有机体内能抑制脂肪细胞[39]诱导的肿瘤生长。在使毛毛虫floppy-7 (MCF-7)乳腺细胞系中，miR-486-5p抑制剂通过增加PTEN表达和抑制AKT信号[40]来诱导自噬，并增强AdoMet诱导的自噬过程。同时，有研究表明，miR-224-5p可以通过靶向MDA-MB-231细胞中的Smad4抑制自噬，而miR-224-5p/Smad4自噬信号轴可能作为乳腺癌治疗[41]的新靶点。此外，在TNBC中，miR-20a介导的自噬缺陷可能被认为是miRNA在乳腺癌[42]过程中起致癌作用的一种新机制。miR-376a通过抑制atg4b和Beclin-1[43]的表达，抑制饥饿诱导的MCF-7细胞和Huh-7细胞自噬。进一步的文献研究表明，miRNA可以通过调节细胞自噬水平影响肿瘤细胞的耐药。值得注意的是，miR-181不仅可以抑制乳腺癌MCF-7细胞的自噬水平，还可以抑制依泊苷、雷帕霉素等药物诱导的自噬，进一步逆转耐药[44]。在乳腺癌中，miR-214可以通过自噬抑制[45]增强乳腺癌细胞对他莫昔芬的敏感性。同样，具有自噬调节功能的miR-129-5p通过结合3’UTR序列下调Beclin-1基因的表达，进而起到抑制多种肿瘤细胞自噬的作用，即乳腺癌、肺癌等细胞[46]。

为了进一步探索CCI逆转TNBC耐药的分子机制，我们采用miRNA芯片检测CCI治疗前后TNBC的耐药细胞。我们发现复方斑蝥素可以显著提高miR-520d的水平。此外，RT PCR也证实了这一结果。目前，miR-520d被观察到作为乳腺癌诊断的一种可能的特异性生物标志物，因为它在乳腺癌中高表达，特别是在HER-2[47]阴性的乳腺癌患者中。因此，miR-520d与肿瘤的关系越来越受到科学家[48]的关注。此前有报道称，miR-520d通过下调EphA2表达[49]抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。此外，在MDA-MB-231中，过表达miR-520d可降低细胞增殖和迁移[50]。结合已有文献，我们肯定了miR-520d可以结合Beclin-1 mRNA的3’UTR区域，显著抑制TNBC耐药细胞中Beclin-1蛋白的表达。此外，结果显示miR-520d mimic可显著增加Doc对耐药细胞的敏感性。反之，miR-520d抑制剂显著抑制CCI对TNBC细胞耐药的逆转作用。 In addition, the effect of CCI on TNBC resistant animal model through miR-520d/Beclin-1 signal axis was verified by animal experiments in this study. Altogether, these findings indicate that the miR-520d/Beclin-1 signal axis is the main mechanism of CCI in reversing the chemotherapy resistance of TNBC.

结论

本研究显示，CCI通过上调miR-520d的表达，靶向Beclin-1，抑制TNBC耐药细胞高水平的自噬。这可以增加TNBC耐药细胞对Doc的药物敏感性，逆转TNBC的耐药性。本研究有助于阐明复方斑蝥素与自噬与耐药之间的内在关系，并有助于完善TNBC的化疗耐药机制。因此，本研究为以复方斑蝥素为辅助联合治疗TNBC的临床提供了实验依据。

作者的贡献

夏生、冯典序、柯旭对这一研究的构想有一定的贡献。李洪昌和刘欢进行了体外实验，分析了数据，并起草了手稿。陈亚峰和李洁进行了动物实验。夏升、冯殿旭、柯旭对手稿进行了严格的修改。所有作者阅读并批准最终稿。

竞争利益声明

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，可以被解释为潜在的利益冲突。

确认

本研究由国家自然科学基金“复方cantharis通过miR-520d/Beclin1信号轴逆转TNBC化疗耐药”(No.81703881)和闵行区医学教研协同卫生服务体系高水平重点专科医生(No. 2020MZYS02)资助。

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