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摘要

作品简介:沃顿果冻组织具有分离间充质干细胞(MSCs)的诱人来源，可用于大规模临床试验、组织工程和再生医学。然而，长时间的细胞培养和扩增可能会通过引起基因组和表观遗传的改变来影响它们的特性。解决这个问题的一个可能的方法是冷冻保存整个沃顿氏水母组织。对这种复杂的组织使用二甲基亚砜不足以使其适当储存。玻璃化可能是储存更复杂组织的可行方法。为了寻找WJ组织的最佳保存方法，本研究采用了玻璃化冷冻和常规冷冻两种不同的冷冻保存方法。

方法:玻璃化是用商业上可用的溶液(“Cryostor”)进行的^TM”)或VS55可以在非平衡方法中使用的解决方案。采用10% DMSO和胎牛血清混合的溶液进行常规冷冻保存。通过MSCs的分离、生长动力学、免疫表型分析、多系分化、划伤实验和活性氧(ROS)定量来评价冷冻保存方法。

结果:结果清楚地表明，玻璃化成功地保存了WJ组织在-196^oC，产生具有间充质干细胞特性的活细胞。另一方面，与玻璃化方法相比，传统的冷冻保存没有达到相同的细胞分离率。

结论:总之，玻璃化是一种很有前途的WJ组织库方法，可以分离明确定义的MSCs，用于未来基于MSCs的再生治疗。

关键字

间充质干细胞，玻璃化，冷冻保存，再生医学，组织工程，活性氧，液氮，沃顿果冻组织

介绍

人类的脐带是连接胎儿和母亲的重要纽带，由两条动脉和一条静脉组成。动脉和静脉之间的中间空间称为WJ组织[1]。众所周知，这种胶质基质是MSCs的丰富来源[2]。间充质干细胞被认为是一种具有自我更新能力的中胚层细胞群，能够向多系中胚层分化[3]。除了WJ组织外，MSCs还存在于骨髓(BM)、脐带血(UCB)、羊水(AF)和脂肪组织(AT)中[4]。在过去的20年里，研究表明MSCs具有免疫调节、抗炎特性，其在成人组织和器官中的存在似乎对组织特异性细胞具有支持作用[5]。确实，MSCs能够在炎症部位表达IL-6、IL-10、一氧化氮(NO)、idoleamine 2,3 dioxygenase (IDO)和前列腺素E2 (PGE2)，并可能通过Fas/Fas配体和TNF受体信号通路导致T细胞凋亡。由于这些特性，MSCs现在可以作为免疫相关疾病的常规联合疗法，如多发性硬化症(MS)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)和克罗恩病[6]。

此外，间充质干细胞的特点是不含HLA II类抗原，因此在异体移植时发挥最小的免疫反应性[7]。这些特性使它们成为再生医学和组织工程方法的理想细胞群。这些方法的成功依赖于大量定义良好的间充质干细胞的使用，这些msc可以在良好生产规范(gmp)下使用[8]。到目前为止，在一些研究中，已经描述了MSCs在伤口愈合，组织工程血管和细胞外基质的发展中的应用[9]。

然而，虽然MSCs存在于大多数成人组织中，但似乎只有WJ-MSCs可以不经侵入性手术从脐带中轻松获得，从而提供了大量的免疫特权细胞。据估计，WJ组织约含有4.6 × 10⁶细胞/ cm[3]。此外，与来自上述来源的MSCs相比，WJ-MSCs具有较少的表观遗传修饰，并且具有更高的增殖和中胚层分化能力。因此，WJ组织是一个有吸引力的MSCs来源，可用于大规模临床试验[6]。

由于再生医学和组织工程的方法需要大量的间充质干细胞，在大多数情况下延长在体外需要细胞培养。因此，端粒长度缩短、形态改变、自我更新能力以及免疫调节和分化特性可能发生改变。

骨髓间充质干细胞的低温保存是一种广泛应用的方法，可以作为一种替代方法，使细胞在-196℃下长时间保持完整^oC[10]。理想情况下，MSCs可以在任何选择的时间点恢复，并可用于翻译医学[10]。虽然，当这些细胞恢复时，有必要扩大在体外从而进一步延续了他们的文化。为此，在理想的时间点成功冷冻保存WJ组织并分离WJ- mscs可能是一种有希望的策略，避免了初始培养，更有利于转化医学。细胞低温保存是一种成熟的长期保存方法[11]。相反，应用低温生物学原理在低温下保存整个组织仍然需要相当多的关注。Τhe二甲基亚砜(DMSO)在大多数冷冻保护溶液中使用，但它不能有效地穿透和保护组织的细胞外基质(ECM)，因此不能有效地到达驻留细胞[11]。因此，由于细胞外冰的形成，发生了不可逆的细胞损伤，并结合组织的多种形态和结构变化。WJ组织是糖胺聚糖(如透明质酸和硫酸软骨素)的丰富来源，这是间充质干细胞所依赖的，表明使用了冷冻保护剂的组合，可以保护细胞外基质和细胞。在此范围内，结合高分子量和低分子量的冷冻保护剂，玻璃化似乎是一种更可行的组织冷冻保存方法。此外，当系统中的冷冻保护剂快速冷却，从而导致分子运动“停滞”和系统凝固时，可以成功地应用该方法[12]。此外，与大多数传统的冷冻保存方法相比，脱氮温度更低，可提供更大的活细胞回收率。 Additionally, the vitrification method is devoid of any animal or human sera, thus the vitrified WJ-MSCs could be broadly used in regenerative medicine and in large scale clinical trials. Until now, vitrification protocols have been applied successfully in long term storage of small model systems including human oocytes and embryos. This technology may further be used at scale-up experiments such as adipose tissue [13], blood vessels [14] and even more WJ tissue [15].

目前，一些研究[16]为WJ组织的高效低温保存和储存提供了证据，但为了获得较高的活细胞回收率，现有的大多数方案需要进一步优化。

本研究的目的是评估两种不同的冷冻保存方案，玻璃化和常规冷冻保存，以适当地储存WJ组织。对于玻璃化方案，测试了两种不同的溶液，一种是市售溶液(“Cryostor”)^TM”)和第二个可用于非平衡玻璃化方法(VS55)。因此，传统的冷冻保存方法依赖于使用含有10% DMSO和胎牛血清(FBS)的溶液(将被称为溶液C)。通过从保存的WJ组织中分离MSCs、细胞活力、表面标记物、多系分化、划痕木实验和活性氧定量来评估不同冷冻保存方法的效率。

材料与方法

收集人类脐带

经母亲知情同意后，由经过脐带血采集培训的经验丰富的助产士从正常分娩(胎龄36-40周)中采集新鲜脐带(l=5-10厘米)。将脐带(n=10)保存在Earl’s平衡盐溶液(EBSS, Gibco, Life Technologies, Grand Island, USA)中，并添加10 U/ml青霉素和10 μg/ml链霉素(Gibco, Life Technologies, Grand Island USA)^οC，并在希腊脐带血银行(HCBB)接待后24小时内处理。收集是按照希腊国家伦理委员会的伦理标准进行的，并得到了我们机构伦理委员会的批准。

沃顿果冻组织分离和低温保存规程

最初，使用无菌手术器械切断脐带的一段，然后在磷酸缓冲盐水1x (PBS 1x)中短暂冲洗，以去除多余的血液和血凝块。然后，去除脐静脉和动脉，将WJ组织切成条状(l=2 cm)。将5个WJ组织样本放入冷冻管中，每种溶液中冷冻保存。除A溶液外，本研究中使用的冷冻保存液均为α-Minimum Essentials Medium (α-MEM)作为稀释剂。

方案A:“Cryostor”^TM解决方案(BioLife Solutions, Monte Ville Parkway, USA)

溶液B:玻璃化溶液(VS55)， 3.10 M DMSO/3.10 M甲酰胺/2.21 M 1,2-丙二醇(Sigma Aldrich, St Louis USA) in Euro-Collins溶液[17]。

溶液C: 10% vol/vol DMSO (Sigma Aldrich, St Louis USA)/ 50% vol/vol FBS (Sigma Aldrich, St Louis USA)。

将含有wj条的冷冻管中填充预冷溶液A或B，快速冷却(43)^oC/min)至-100^oC，然后慢慢冷却^oC/min)至-135^oC.最后将样品保存在-196℃的液氮中^oC.用C溶液保存的装有wj条的冷冻管置于Mr Frosty容器中，以1的慢冷却速率冷冻过夜^o从室温至-80℃^oC.然后转移到冷冻箱中，放入液氮(LN)₂)坦克在-196^oC，保存60天。非低温保存的wj条和LN保存的wj条₂不含任何冷冻保护剂(CPA-free)，分别作为阴性和阳性对照组。实验过程的示意图如图1所示。

版权所有OAT。版权所有

图1所示。实验设计示意图。

沃顿果冻解冻程序

在LN储存60天后₂解冻wj条，分离WJ-MSCs。从LN中取出装有wj条的冷冻管₂37岁的时候立刻被泡在水浴里^oC，直到冷冻的wj条完全解冻。最后将wj -试纸移入含20 ml PBS 1x的50 ml聚丙烯falcon管中，500g离心6 min。丢弃上清，每个wj -试纸移入100 mm²待皮氏培养皿进一步加工。

华顿氏果冻间充质干细胞的分离

每个wj条切成小块(1-3毫米)^3.)，使用无菌手术器械，置于6孔板中(Costar, Corning Life, Canton, MA)。然后在每孔中加入1ml培养基，最后将6孔板置于5% CO的湿化气氛中转移₂在37^oC. 15天后，进行显微镜检查，当6孔板上达到足够数量的贴壁细胞时，使用0.25%胰蛋白酶EDTA溶液(Gibco)分离细胞，用PBS 1倍洗涤，重新镀至75 cm²水瓶(配角)。在达到70-80%的融合度时，将WJ-MSCs胰蛋白酶化，洗涤并重悬至175 cm²烧瓶。重复同样的步骤，直到细胞达到培养的第5代(P5)。WJ-MSCs的分离扩增培养基为α- minimum Essentials medium (α-ΜΕΜ，Gibco)，培养基中添加15%胎牛血清(FBS, Gibco)、10 U/ml青霉素(Gibco)、10 μg/ml链霉素(Gibco)和2mM l -谷氨酰胺(Gibco)。每周更换培养基两次，培养物保持在5% CO的湿润气氛中₂在37^oC。

WJ-MSCs的细胞活力、倍增时间和代代时间

从每种实验条件下5条独立的WJ-MSCs中分离WJ-MSCs，从P1持续培养至P5，每次传代达到80%的合流度时计数。一开始是2 × 10⁵75厘米内的细胞²P1的烧瓶被镀。台盼蓝法测定WJ-MSCs的细胞活力。最初，种群倍增率(PD)在每个传代中使用以下公式确定:

PD= log_10 ? ? (N / N0) ? / log_10 ? ? (2) ?

另外，从P2到P8的细胞倍增时间(CDT)由经典公式计算:

CDT＝log_10 ? ? (N / N0) ? / log_10 ? ? (2) ?x (T)

其中N为培养结束时的细胞数，N0为接种细胞数，T为培养时间，单位为小时。

体外多系分化

的在体外通过成脂分化、成骨分化和成软骨分化来评估各实验条件下WJ-MSCs的多系分化能力。为此，使用12 × 10⁴用培养基将细胞/孔接种于6孔板(Costar)。第二天，取出培养基，然后用PBS 1x短暂洗涤，进行成脂、成骨和软骨诱导。WJ-MSCs的成脂分化使用基础培养基(Mesencult, StemCell Technologies)补充10%的成脂刺激补充剂(StemCell Technologies) 25天，并通过油红- o (Sigma-Aldrich)染色对脂泡进行染色。WJ-MSCs分化成成骨系使用基础培养基(Mesencult, StemCell Technologies, Vancouver, BC Canada)，外加15%的成骨刺激物(StemCell Technologies)、0.01 mM地塞米松(StemCell Technologies)和50 μg/ml抗坏血酸(StemCell Technologies)。25天后用茜素红S (Sigma-Aldrich)染色评估成骨分化。最后，高糖D-MEM在球体培养物中添加0.01 mM地塞米松(StemCell Technologies)、35 μg/ml抗坏血酸-2-磷酸(StemCell Technologies)、10 ng/ml转化生长因子-β1 (Sigma-Aldrich)、液体培养基(ITS+预混料，Sigma-Aldrich)，培养30天，诱导软骨分化。用10%福尔马林(Sigma-Aldrich)固定，石蜡包埋，切成5 μm的切片。用阿利新蓝(Fluka, Sigma-Aldrich)染色评估软骨分化。

流式细胞仪免疫表型分析

在P2进行WJ-MSCs的免疫表型分析。采用流式细胞术分析各实验条件下WJ-MSCs样品(n=3)的细胞表面抗原。检测细胞中MSCs标志物CD90 (Thy-1)、CD105(内啡肽)、CD73(外泌-5′-核苷酸酶)[18]。此外，检测WJ-MSCs的CD29(整合素亚基)、CD19(泛b细胞标志物)、CD31(泛内皮标志物)、CD45(泛造血标志物)、CD14(单核细胞标志物)、HLA- dr (HLA II类抗原)、HLA- abc (HLA I类抗原)、CD14 (TLR-4共受体)、CD3 (t细胞共受体)。更具体地说，用异硫氰酸荧光素偶联抗cd90、HLA-ABC、CD29、CD19、CD31、CD45标记细胞。表位CD105、CD73、CD44、CD3和CD14、HLA-DR(均来自法国马赛的Beckman Coulter公司Immunotech公司)分别用植物红蛋白偶联和pc5偶联的小鼠抗人单克隆抗体进行鉴定。WJ-MSCs的表型分析采用Cytomics FC 500 (Beckman Coulter, Marseille, France)流式细胞仪，使用CXP分析软件(Beckman Coulter)。

组织学分析

将5种实验条件下的wj条进行组织学分析。wj试纸(n=3)用10% vol/vol的中性福尔马林(Sigma-Aldrich)固定。然后将固定后的样品包埋于石蜡中，得到5 μm的截面。最后进行苏木精和伊红(H&E, Sigma-Aldrich)染色。采用徕卡DM LS2显微镜，IC Capture v 2.2软件获取图像，NIH Image J v1.50软件处理。

Scratch-wound化验

每个实验条件下WJ-MSCs的数量为12 × 10⁴细胞/孔镀于6孔板中。第二天用20 μl移液管头进行划伤实验。使用倒置的徕卡dmiil和NIH Image J v1.50软件，在最初的抓挠后24和48小时捕捉细胞迁移。

活性氧定量

根据制造商的说明书(Sigma-Aldrich)对五种实验条件下的wj条进行总抗氧化剂的定量。总抗氧化剂的浓度与细胞中活性氧的水平有关。简单地说，用25 μg/ml (Sigma-Aldrich)蛋白酶K在55℃下孵育过夜^oC，然后在95℃时使蛋白酶K失活^o5分钟。然后在96孔板(Costar)的每孔中加载100 μl的组织裂解物。再加入100 μl的铜^２＋每孔加入工作液，室温暗箱孵育90分钟。最后，用分光光度法测定各样品在570 nm处的吸光度。用Trolox标准溶液建立的标准曲线插值法测定了该抗氧化剂的含量。用于ROS定量的其他对照组为新鲜获得的WJ-MSCs(阴性对照组)和用10%体积/体积DMSO处理的WJ-MSCs(阳性对照组)。

统计分析

采用graphpad Prism v 6.01软件进行统计学分析。采用非配对非参数Mann-Whitney u检验比较各实验条件下细胞总数、细胞活力、细胞倍增、细胞倍增时间及流式细胞术分析。组间值差异有统计学意义假定值< 0.05。指示值为平均值±标准差。

结果

WJ-MSCs的分离与扩增

WJ-MSCs均成功从所有玻璃化wj条中分离出来。具体地说，WJ-MSCs从用A溶液(Cryostor)玻璃化的5条wj条中的5条中一致分离出来^TM”)和溶液B (VS55)。然而，用C溶液(10%体积/体积DMSO/ 50%体积/体积FBS)冷冻保存的5条wj条带中，只有3条WJ-MSCs被分离出来。另一方面，不含cpa的wj条(阳性对照组)未分离出细胞。

与非低温保存wj条(阴性对照组)分离的细胞相比，玻璃化wj条(溶液A和溶液B)中的WJ-MSCs表现出纺锤状形态。37岁培养后第7天出现第一个塑料贴壁细胞^o初始分离15天后，观察到湿润气氛中的C和6孔板的融合(图2)。并且，这些细胞能够扩增并达到传代5，与未冷冻保存的wj -条带分离的细胞相同(补充文件1)。相反，从wj -条带中分离的WJ-MSCs在C溶液中冷冻后，存活细胞较少，增殖活性较低。没有明显的形态特征，最终无法从初始培养中扩增。因此，本研究的下一组实验只使用A溶液和B溶液玻璃化wj条获得的MSCs。

图2。从-196℃储存的wj -条带中分离WJ-MSCs^oC，期限为60天。在37℃孵育7 (A)、10 (F)和15 (K)天后，从非冷冻保存的wj条(阴性对照组)分离MSCs^oC和5% CO₂。经过7 (B)， 10 (G)和15 (L)天的培养，用A溶液(Cryostor)从玻璃化的wj条中分离出MSCs。用B溶液(VS55)孵育7 (C)、10 (H)和15 (M)天后，从玻璃化wj条中分离出MSCs。低温保存的wj条在孵育7 (D)、10 (I)和15 (N)天后分离出MSCs，仅有少量活细胞出现。wj条在-196℃时的MSCs分离^oC在7 (E)、10 (J)、15 (O) d后未出现任何细胞(阳性对照组)。原装放大倍数10倍，比例尺100 μ

为了充分确定获得的WJ-MSCs的特性，我们进行了细胞活力、群体倍增和细胞倍增时间的估计。值得注意的是，在P5结束时，从玻璃化的wj条中获得的细胞总数超过了2 × 10⁷细胞(图3A)。在A和B溶液中冷冻wj条获得的MSCs (P2至P5)的平均存活率分别为87.4±3.9%至89.4±3.6%和89.4±1.9%至91.4±2.2%(图3B)。与未冷冻保存的wj条相比，A、b溶液冷冻后的wj条平均细胞活力略有下降，差异有统计学意义(p< 0.01）在冷冻和非冷冻的wj条之间的平均细胞活力(图3B)。同样，WJ-MSCs的P2 -P5平均PD和CDT分别在3.8±0.2 ~ 9.0±2.1和83.2±4.6 ~ 196.1±47.5 h之间(图3C和3D)。此外，对于玻璃化的wj条，平均PD和CDT介于3.8±0.13至9.1之间。±2.0和85.6±2.7 h至199.4±45.4 h(图4)。冷冻和非冷冻wj条的平均PD和CDT无统计学差异。

图3。分离MSCs的动力学特性。到传代5的MSCs总细胞数(A)。到传代5的WJ-MSCs细胞活力百分比的测量(B)。到传代5的WJ-MSCs群体加倍的计算(C)。到传代5的WJ-MSCs细胞加倍时间的计算(D)。各研究组之间仅细胞活力百分比有统计学差异，p<0.01。

图4。分别用茜素红S、油红o和阿利新蓝染色观察WJ-MSCs向成骨、成脂和软骨细胞分化的多系分化。来自非冷冻保存wj条(阴性对照组)的MSCs成功分化为成骨(A)、脂肪(D)和软骨(G)谱系。用A溶液从玻璃化wj条中提取间充质干细胞(“Cryostor”)成功分化为成骨(B)、脂肪(E)和软骨细胞谱系(G)。用溶液B (VS55)玻璃化的wj -条带成功分化为成骨(C)、脂肪(F)和软骨细胞谱系(I)。原始放大倍数为10倍，比尺为100 μm。

MSCs的多系分化

WJ-MSCs向中胚层细胞系(包括成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞系)的分化能力通过用A和B溶液玻璃化的wj -条获得的细胞进行评估，并与未冷冻保存的wj -条进行比较。所有样本都成功分化为成骨、成脂和成软骨谱系。在成骨诱导方面，茜素红S染色显示分化的间充质干细胞呈阳性，表明钙沉积的产生(图4)。此外，油红O染色显示向脂肪形成谱系分化的间充质干细胞呈阳性。最后，在暴露于软骨诱导因子21天后，冷冻和非冷冻wj条的MSCs产生了糖胺聚糖(GAG)，这在阿利新蓝染色中可见(图4)。在所有测试的实验组中，上述染色的强度没有明显差异。

Immunophenotypic分析

用A和B溶液玻璃化的wj -条获得的MSCs与从非冷冻保存的wj -条分离的MSCs表达相同的表面标记。更具体地说，流式细胞术分析显示β1整合素亚基CD29和基质受体CD90、CD105、CD73和HLA- ABC阳性表达，CD19、CD3、CD31、HLA- dr和CD45阴性表达。图5所示为流式细胞术分析的可表示图。上述表面抗原的表达水平在所有MSCs样品之间均无统计学差异(补充文件2)。

图5。流式细胞术分析非冷冻保存或玻璃化wj条的wj - msc“Cryostor)B (VS55)。在A、B溶液中培养的WJ-MSCs中，CD90 (A、H、O)、CD105 (B、I、P)、CD73 (C、J、Q)表达较强，CD45 (D、K、R)、HLA DR (E、L、S)、CD19 (F、M、T)和CD3 (G、N、U)表达较弱。

组织学分析

对wj条进行组织学分析，以进一步评价所采用的储存方法。更具体地说，用A和B溶液玻璃化的wj条呈现出致密的胶质细胞外基质，未观察到驻留细胞的破坏和损伤。在形态学上，wj条的ECM与非冷冻保存的wj条无显著差异。相反，低温保存的wj -条带和不加任何CPA保存的wj -条带在-196^oC的特征是在ECM中有较大的中间空间，表明其广泛的损伤，只有少数间充质干细胞。这些空间在低温下储存的组织中很有特点，是由于细胞外冰在低温保存过程中形成的。

Scratch-wound化验

采用刮伤法评价MSCs的迁移能力。具体来说，从玻璃化的wj条中获得的MSCs与非冷冻保存的MSCs具有相同的迁移活性。最后，在48h后观察到所有样品中初始产生的间隙完全闭合，表明它们的细胞成功粘附和迁移。

ROS量化

与不含cpa的wj条相比，未低温保存的wj条和玻璃化的wj条(溶液A或溶液B)的抗氧化剂水平较低。然而，用C溶液冷冻保存的wj -条的总抗氧化剂水平与不含cpa的样品相同，而与用A和B溶液冷冻的wj -条相比，ROS水平更高。此外，用A和B溶液冷冻保存的wj -条的抗氧化剂水平与用10% DMSO(阳性对照组)处理的MSCs相比，具有统计学意义的低。此外，用C溶液冷冻的wj条和不含cpa的样品的抗氧化水平与阳性对照组相同，并且与非冷冻保存的wj条分离的MSCs相比，抗氧化水平更高，这具有统计学意义(图6-图8和补充文件3)。

图6。H&E染色玻璃化或低温保存后wj条的组织学分析。新鲜、非低温保存的WJ组织，其特征是具有大量细胞的致密胶质ECM (a,B)。在A (C,E)和B (F,G)溶液中玻璃化的WJ条与非低温保存的WJ组织结构保持良好。WJ组织用C (H,I)溶液冷冻保存或不加任何CPA保存在-196℃^oC (J,K)的特征是大面积的破坏，如箭头所示。A、C、F、H、J图，原放大10倍，比例尺100倍。B、E、G、I和K图，原放大倍数为40倍，比例尺为50 μm。

图7。WJ -MSCs进行划痕木试验。在37℃孵育48小时后，初始间隙完全闭合^oC和5% CO₂。无论是非冷冻保存(A,B,C)的WJ-MSCs，还是用溶液A (D,E,F)和B (G,H,I)玻璃化的wj -条带获得的WJ-MSCs，都在同一时间点迁移并填充了发生的间隙。图A、D、G为原放大2.5倍，比例尺为200 μm。B、C、E、F、H、I图，原放大倍数为10倍，比例尺为100 μm。

图8。wj条抗氧化定量测定。试验了5种不同的实验条件对wj条中总抗氧化量的影响。用A、B溶液玻璃化或用C溶液冷冻保存的wj试纸条与未冷冻保存或不加CPA保存的wj试纸条进行比较。含C溶液的wj试纸与其余样品比较差异有统计学意义，p<0.05。未加CPA的wj试纸与其余样品的差异也有统计学意义，p<0.01。

讨论

本研究的目的是评估可用于WJ组织长期保存的不同冷冻保存方法。目前，常规的低温保存方法很难适用于WJ组织的低温适当保存[19]。到目前为止，为了建立低温保存和储存条件，已经在各种组织中进行了多次使用不同冷冻保护溶液的尝试[20]。其中，玻璃化方法可能是目前最好的低温保存方法，将低分子量和高分子量的冷冻保护剂相结合。结果表明，与传统冷冻保存方法相比，ECM可以有效保存，同时组织细胞的存活率更高。

在这项研究中，三种不同的冷冻保存溶液，一种市售的解决方案(“Cryostor”)^TM使用玻璃化溶液(VS55)和含有10%体积/体积DMSO的常规冷冻保存溶液，并评估在-196下成功保存wj条的效果^oC，期限为60天。在这段时间后，快速解冻wj条，进行MSCs的分离。更具体地说，从玻璃化的wj条中获得，扩增和传代成功^TM”)或方案B (VS55)。形态学上，这些细胞呈纺锤形，与非冷冻保存的wj条(阴性对照组)获得的MSCs相比无明显差异。另一方面，常规冷冻保存的wj条(C溶液)仅分离出少量活细胞，且无法进一步扩增传代。这些结果与Roy及其同事先前的研究一致[21]，在分离活细胞方面也观察到同样的困难。在此范围内，可以假设DMSO不能有效穿透组织的细胞外基质，有利于内源性冰形成的发展，并可能损害组织驻留细胞。相反，通过结合低分子量和高分子量的冷冻保护剂，玻璃化方案可以在非常低的温度下适当地储存组织。根据低温生物学原理，低分子量的CPAs可以有效地穿透到达细胞的ECM，从而有助于细胞的适当保存。高分子量的cpa负责保存ECM，从而不允许冰晶形成，减少组织热机械应力，进一步保护组织驻留细胞免受低温造成的任何损伤。

接下来，我们继续计算从玻璃化样品(用Cryostor保存)中获得的MSCs的平均细胞数、CDT、PD和细胞活力^TM”和VS55)，以便全面评估冷冻保存溶液对该组织的影响。从玻璃化的wj -条带中获得的MSCs成功地达到了5代，平均数量为2.5 × 10⁷溶液A和2.4 × 10的细胞⁷而非冷冻保存的wj条获得的细胞平均数量达到3.3 × 10个⁷细胞。尽管不同实验条件下的平均细胞数存在差异，但通过Kruskal-Wallis检验计算，差异无统计学意义。wj玻化带第5代平均CDT为196.1±47.5 h, PD为9.0±2.1，溶液A为199.4±45.4 h, PD为9.1。基于台盼蓝实验，上述标本中wj -strip提取的MSCs在A溶液中平均细胞活力为89.4±3.6%，在B溶液中平均细胞活力为91.4±2.2%。

免疫表型分析显示，MSCs中CD90、CD105、CD73、CD29、CD44阳性超过80%，CD3、CD31、CD14、CD45和HLA-DR阴性低于3%。流式细胞术分析结果与非冷冻保存样品中获得的间充质干细胞相比无统计学差异。

通过使用特定的生长因子将分离的MSCs分化为脂肪、成骨和软骨谱系，进一步评估不同冷冻保存方法对其多谱系分化能力的影响。事实上，通过茜素红S和油红O染色，MSCs分别在成骨和脂肪诱导条件下形成了钙沉积和脂质液泡。此外，在成软骨诱导条件下，MSCs成功地产生了硫酸糖胺聚糖，这是软骨ECM的关键大分子，表明成功地向软骨谱系分化。目前，先前的结果清楚地表明，从玻璃化组织中获得的细胞保留了间充质间质细胞的特性。迄今为止，大多数研究涉及使用传统的低温保存方法在低温下储存WJ组织，结果相互矛盾。尽管实验过程存在显著差异，但我们关于MSCs的免疫表型分析和多系分化的结果似乎与先前发表的研究一致[5]。Shivakumar及其同事的研究[22]中，MSCs的成功分离、扩增和多系分化与我们的研究结果非常相似，唯一不同的是，在我们的研究中，WJ组织的最佳冷冻保存方案是玻璃化。

此外，尽管我们做出了努力，但当使用含有10%体积/体积DMSO的常规冷冻保护溶液时，WJ组织中没有获得间充质干细胞。为此，为了彻底找出造成这一问题的确切原因，我们对WJ组织进行H&E染色的组织学分析。WJ组织是一种致密的胶质基质，MSCs依赖于此[15]。正如H&E染色所显示的那样，无论是用溶液A还是溶液B进行玻璃化处理，这种形成都保留了下来，并且与非冷冻保存的WJ组织没有表现出任何显著的形态学差异。另一方面，用C溶液(常规方法)冷冻保存的wj条显示出广泛的ECM破坏，并伴有驻留细胞的损伤。这种形态在低温保存过程中发生细胞外冰形成时非常典型，表明低温保护剂未成功渗透到组织中。

划伤实验结果显示，来自玻璃化样品的间充质干细胞具有与阴性对照组相同的迁移能力。最初发生的间隔在48小时后关闭，这段时间也被其他研究小组在文献中描述过。骨髓间充质干细胞的迁移能力是非常重要的，特别是当这些细胞打算用于伤口愈合和再生医学方法时。

直到今天，世界各地的几个小组已经尝试在低温下低温保存和妥善储存WJ组织。然而，Da-Croce和她的同事[23]的研究表明，缓慢冷却的玻璃化方案是造成广泛细胞损伤的原因，因此没有从玻璃化样品中获得细胞。与这一组相反，我们的研究提供了明确的结果，与冷冻保存的样品相比，玻璃化样品中MSCs的存活能力增强。我们小组进行的活性氧定量实验对此提供了更好的了解。两种玻璃化wj条的抗氧化剂含量与从新鲜组织和非冷冻保存wj条中获得的间充质干细胞相同。在玻璃化和冷冻保存的样品中，抗氧化剂的含量有统计学上的显著差异。此外，冷冻保存的wj条的抗氧化剂含量略低于不添加冷冻保护剂的液氮保存的wj条。在本研究中，低温保存过程中MSCs受到的高热机械应力可诱导ROS水平升高[19]。众所周知，高ROS水平诱导线粒体进一步损伤，通过细胞色素c释放和caspase 3激活诱导细胞凋亡。这可能是低温保存的wj细胞条分离细胞数量少的主要原因。 The huge discrepancy that has occurred between the two studies might reflect different experimental parameters that were applied during the vitrification protocol of the WJ-strips. Possibly, different time points set or slightly different combination of cryoprotective agents used in the vitrification protocol might harm irreversible the WJ tissue.

WJ是一个非常有前途的MSCs来源，可用于自体或异体应用的转化医学。在大多数组织冷冻保存的情况下，冷冻溶液由10%体积/体积的DMSO和FBS组成。虽然牛胎牛血清中的牛蛋白阻碍了储存的细胞或组织的临床应用，但在冷冻溶液中添加胎牛血清是需要进行适当的冷冻保存的。此外，用于低温保存的典型DMSO浓度在5-20% vol/vol之间，可能无法有效保存复杂组织，从而对驻留细胞造成更大的破坏。另一方面，玻璃化方法已经成功地应用于卵母细胞的保存，其应用范围可以进一步扩大，如在大多数复杂组织如WJ组织的冷冻保存中。

结论

总之，适当的保存和储存WJ组织是至关重要的，可以用市售的溶液或应用非平衡方法进行。WJ组织可以作为一种替代来源，在不丧失干细胞特性的情况下，随时可以使用定义良好的MSCs。迄今为止，骨髓是分离骨髓间充质干细胞的首选来源，骨髓间充质干细胞被广泛用于再生医学和大规模临床试验。然而，由于MSCs在整个骨髓中的比例很低(0.01-0.001%)[4]，在大多数情况下需要长时间的细胞扩增和培养。玻璃化法可能是一种可行的方法，可以适当地储存WJ组织，并且可以在任何需要的时间进行MSCs的分离，而不需要延长细胞培养时间。

作者和贡献者

Mallis Panagiotis(第一作者)对华顿水母组织的冷冻保存、分离、扩增、MSCs的质量控制和组织学分析进行了实验。另外，撰写论文并对实验进行统计分析。Georgiou Eleni参与了华顿水母组织的冷冻保存、MSCs的分离和三系分化实验，Michalopoulos Efstathios设计并监督了整个研究。Catherine Stavropoulos Giokas监督并批准了整个研究。

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